Ordinamento a singola cellula di cellule staminali mesenchimali immunofenotipizzate da denti decidui esfoliati umani

Summary

Questo protocollo descrive l'uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando il metodo di selezione a singola cellula. In particolare, l'uso del sorting a singola cellula può raggiungere una purezza del 99% delle cellule immunofenotipizzate da una popolazione eterogenea se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) di un organismo possiedono una straordinaria capacità di differenziarsi in più lignaggi di cellule adulte nel corpo e sono note per le loro proprietà immunomodulatorie e antinfiammatorie. L'uso di queste cellule staminali è una manna per il campo della biologia rigenerativa, ma allo stesso tempo, una rovina per la medicina rigenerativa e le terapie a causa delle molteplici ambiguità cellulari ad esse associate. Queste ambiguità possono derivare dalla diversità nella fonte di queste cellule staminali e dalle loro condizioni di crescita in vitro , che si riflettono entrambe sulla loro eterogeneità funzionale.

Ciò garantisce metodologie per fornire popolazioni purificate e omogenee di MSC per applicazioni terapeutiche. I progressi nel campo della citometria a flusso hanno permesso di rilevare popolazioni di singole cellule utilizzando un approccio multiparametrico. Questo protocollo delinea un modo per identificare e purificare le cellule staminali dai denti decidui esfoliati umani (SHED) attraverso la selezione di singole cellule assistita da fluorescenza. L'espressione simultanea di marcatori di superficie, vale a dire, CD90-isotiocianato di fluoresceina (FITC), CD73-peridinina-clorofilla-proteina (PerCP-Cy5.5), CD105-alloficocianina (APC) e CD44-V450, ha identificato gli espressiori positivi "luminosi" delle MSC utilizzando la citometria a flusso multiparametrica. Tuttavia, è stato osservato un calo significativo nelle percentuali di quadrupli espressiori di questi marcatori positivi dal passaggio 7 in poi ai passaggi successivi.

Le sottopopolazioni immunofenotipizzate sono state ordinate utilizzando la modalità di ordinamento a singola cellula in cui solo due marcatori positivi e uno negativo costituivano i criteri di inclusione. Questa metodologia ha garantito la vitalità cellulare delle popolazioni selezionate e ha mantenuto la proliferazione cellulare dopo lo smistamento. L'applicazione a valle per tale ordinamento può essere utilizzata per valutare la differenziazione specifica del lignaggio per le sottopopolazioni gated. Questo approccio può essere applicato ad altri sistemi a singola cellula per migliorare le condizioni di isolamento e per acquisire informazioni multiple sui marcatori di superficie cellulare.

Introduction

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono essere considerate una fonte scalabile di cellule adatte alle terapie cellulari e possono essere considerate un sistema gold standard nella medicina rigenerativa. Queste cellule possono essere isolate da una varietà di fonti nel corpo con diverse origini tissutali¹. A seconda del tessuto di origine, ogni tipo di MSC mostra un comportamento in vitro ambiguo². Ciò è ben osservato nelle loro proprietà morfologiche e funzionali³. Diversi studi hanno mostrato variazioni intraclonali nelle dimensioni, tra cui la differenziazione dei tessuti adulti....

Protocol

Approvazione etica e consenso alla partecipazione: i campioni di polpa dentale decidua esfoliata umana sono stati ricevuti dopo aver ottenuto il consenso informato e la piena approvazione etica da parte del Dipartimento orale e maxillofacciale dello Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, in conformità con gli standard stabiliti dal Comitato di autorizzazione etica dell'ospedale, SRGCDS. A seguito di ciò, l'isolamento, la coltura, il mantenimento e l'applicazione di SHED sono stati approvati e in conformità con le linee guida raccomandate dal Comitato Istituzionale per la Ricerca sulle Cellule Staminali (IC-SCR) presso l'Istituto di Medicina ....

Discussion

Nel campo dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa, tra le fonti postnatali, le MSC orali derivate da tessuto hanno suscitato un profondo interesse a causa dei loro obblighi etici minimi e del notevole potenziale di differenziazione multilignaggio²¹. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) del terzo molare impattato e le SHED hanno attirato la maggior parte dell'attenzione tra le MSC dentali per il loro potenziale terapeutico nelle malattie neurodegenerative e traumatiche

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5