Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В текущем исследовании представлены протоколы для оценки ранней судьбы вирус-специфических клеток TFH и манипулирования экспрессией генов в этих клетках.

Abstract

Фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH) воспринимаются как независимая линия CD4+ Т-клеток, которая помогает родственным В-клеткам вырабатывать высокоаффинные антитела, тем самым устанавливая долгосрочный гуморальный иммунитет. Во время острой вирусной инфекции приверженность к судьбе вирус-специфических Т-клетокСГ определяется на ранней фазе инфекции, и исследования раннедифференцированных клетокТ-СГ имеют решающее значение для понимания Т-клеточного гуморального иммунитета и оптимизации дизайна вакцины. В исследовании, используя мышиную модель инфекции, вызванной вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), и мышь TCR-трансгенную SMARTA (SM) с CD4+ Т-клетками, специфически распознающими эпитоп гликопротеина LCMV I-ABGP 66-77, мы описали процедуры доступа к ранней судьбе вирус-специфических клеток TFH на основе окрашивания проточной цитометрией. Кроме того, использование ретровирусной трансдукции SM CD4+ Т-клеток также позволяет использовать методы манипулирования экспрессией генов в раннедифференцированных вирус-специфических клетках TFH. Следовательно, эти методы помогут в исследованиях, изучающих механизм(ы), лежащие в основе раннего связывания вирус-специфическихТ-FH-клеток.

Introduction

Сталкиваясь с различными патогенами или угрозами, наивные CD4+ Т-клетки адаптируют свои иммунные реакции путем дифференцировки в различные субпопуляции Т-хелперных Т(Т-H) клеток со специализированными функциями1. При острой вирусной инфекции большая часть наивных CD4+ Т-клеток дифференцируется в фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH), которые оказывают помощь В-клеткам 2,3. В отличие от других субпопуляций CD4+ TH-клеток (например, клеток TH1, TH2, TH9 и TH17), клетки TFH

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетами по уходу за животными и их использованию Третьего военно-медицинского университета. В настоящем исследовании использовались следующие линии мышей: мышь C57BL/6J (B6) (оба пола), в возрасте от 6 д?.......

Representative Results

Характеристика раннедифференцированных вирус-специфическихТ-СГ-клеток при острой LCMV-инфекции
Чтобы выяснить раннюю приверженность к судьбе вирус-специфичныхТ-клеток FH, наивные конгенные SM CD4+ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп LCMV GP I-AB

Discussion

Исследования в областиТ-клеток СГ получили широкое распространение с момента открытия специализированной функцииТ-клеток СГ в оказании помощи В-клеткам. Накапливающиеся исследования показали, что дифференцировка клеток TFH является многоступенчатым и многофакторны.......

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 32300785 до X.C.), Китайской национальной программы постдокторантуры для инновационных талантов (No 100). BX20230449 в X.C.) и Национальный крупный проект в области науки и техники (No 2021YFC2300602 в Лос-Анджелес).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TFHTFHLCMVSMARTATCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved