Доступ к ранней дифференцировке вирус-специфических фолликулярных хелперных CD4+ Т-клеток у острых LCMV-инфицированных мышей

Резюме

В текущем исследовании представлены протоколы для оценки ранней судьбы вирус-специфических клеток T_FH и манипулирования экспрессией генов в этих клетках.

Аннотация

Фолликулярные хелперные Т-клетки (T_FH) воспринимаются как независимая линия CD4⁺ Т-клеток, которая помогает родственным В-клеткам вырабатывать высокоаффинные антитела, тем самым устанавливая долгосрочный гуморальный иммунитет. Во время острой вирусной инфекции приверженность к судьбе вирус-специфических Т-клеток_СГ определяется на ранней фазе инфекции, и исследования раннедифференцированных клеток_Т-СГ имеют решающее значение для понимания Т-клеточного гуморального иммунитета и оптимизации дизайна вакцины. В исследовании, используя мышиную модель инфекции, вызванной вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), и мышь TCR-трансгенную SMARTA (SM) с CD4⁺ Т-клетками, специфически распознающими эпитоп гликопротеина LCMV I-A^B_{GP 66-77}, мы описали процедуры доступа к ранней судьбе вирус-специфических клеток T_FH на основе окрашивания проточной цитометрией. Кроме того, использование ретровирусной трансдукции SM CD4⁺ Т-клеток также позволяет использовать методы манипулирования экспрессией генов в раннедифференцированных вирус-специфических клетках T_FH. Следовательно, эти методы помогут в исследованиях, изучающих механизм(ы), лежащие в основе раннего связывания вирус-специфических_{Т-FH-клеток}.

Введение

Сталкиваясь с различными патогенами или угрозами, наивные CD4⁺ Т-клетки адаптируют свои иммунные реакции путем дифференцировки в различные субпопуляции Т-хелперных Т(_Т-H) клеток со специализированными функциями¹. При острой вирусной инфекции большая часть наивных CD4⁺ Т-клеток дифференцируется в фолликулярные хелперные Т-клетки (T_FH), которые оказывают помощь В-клеткам ^2,3. В отличие от других субпопуляций CD4⁺ T_{H-клеток} (например, клеток T_H1, T_H2, T_H9 и T_H17), клетки T_FH экспрессируют значительный уровень CXCR5, который является хемокиновым рецептором для В-клеток, хоутингующих хемокин CXCL13, что позволяет клеткам T_FH мигрировать в фолликулы В-клеток. В фолликулах В-клеток_{Т-клетки FH} помогают родственным В-клеткам инициировать и поддерживать реакции зародышевого центра, тем самым обеспечивая быструю выработку высокоаффинных антител и долговременную гуморальную память ^2,3.

При острой вирусной инфекции ранняя фиксация в судьбе вирусспецифических Т-клеток_СГ происходит в течение 72 ч ^4,5 и контролируется транскрипционным репрессором В-клеточной лимфомой-6 (Bcl-6)^5,6,7,8, который действует как «главный регулятор», определяющий решения о судьбе_Т-СГ. Дефицит Bcl-6 сильно притупляет дифференцировку клеток T_FH, в то время как эктопическая экспрессия Bcl-6 существенно способствует приверженности судьбе клеток T_FH. В дополнение к Bcl-6, несколько молекул участвуют в инструктаже ранней фиксации судьбы клеток T_FH. Факторы транскрипции TCF-1 и LEF-1 инициируют дифференцировку клеток T_FH путем индукции Bcl-6 ^9,10,11. Ингибирование Blimp1 как Bcl-6, так и TCF-1 требуется для ранней фиксации судьбы клеток_{T FH} ^11,12. STAT1 и STAT3 также необходимы для ранней дифференцировки клеток T_FH ¹³. Кроме того, эпигенетические модификации гистонметилтрансферазой EZH2^14,15 и m6A метилтрансферазой METTL3¹⁶ помогают стабилизировать транскрипционные программы клеток_T-FH (особенно Bcl6 и Tcf7) и, таким образом, обеспечить раннюю приверженность судьбе клеток_T-FH. Несмотря на то, что были достигнуты успехи, в том числе в отношении вышеупомянутых молекул и других, обобщенных в другом месте³, в понимании транскрипционной и эпигенетической регуляции ранней судьбы клеток_Т-СГ, ранее неизвестные молекулы еще предстоит изучить.

В мышиной модели инфекции вируса острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) адоптивно перенесенные TCR-трансгенные SMARTA (SM) CD4⁺ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп гликопротеина LCMV I-A^bGP_66-77, подвергаются дифференцировке клеток T_FH или T_H1во время вирусной инфекции. Эта модель бифуркационной дифференцировки T_FH/T_H1 способствует продвижению модели SM/острой инфекции LCMV в изучении биологии вирус-специфических клеток T_FH. Действительно, модель СМ/острой инфекции LCMV широко использовалась в области исследований клеток_Т-СГ и сыграла решающую роль в знаковых открытиях в биологии клеток_Т-СГ. Это включает в себя идентификацию вышеупомянутого Bcl-6 в качестве определяющего линию фактора транскрипции клеток T_FH ^5,6, а также других важных транскрипционных факторов (например, Blimp-1⁶, TCF-1/LEF ^9,10,11, STAT1/STAT3¹³, STAT5¹⁷, KLF2¹⁸ и Itch¹⁹), регулирующих дифференцировку клеток_{T FH}, посттранскрипционную регуляцию ( например, METTL3¹⁶ и miR-17~92²⁰) дифференцировки клеток T_FH, памяти и пластичности клеток T_FH ^21,22, а также рациональных стратегий вакцинации, нацеленных на клетки T_FH (например, селен²³).

В настоящем исследовании описаны воспроизводимые методы получения доступа к ранней судьбе вирус-специфических_{Т-СГ-клеток} , включая (1) создание острой модели мыши-химеры, инфицированной LCMV, пригодной для доступа к раннедифференцированным_{Т-СГ-клеткам} , (2) проведение проточной цитометрии окрашивания молекул, связанных с ранними дифференцированными_Т-СГ, и (3) выполнение манипуляций с генами на основе ретровирусного вектора в SM CD4⁺ Т-клетки. Эти методы будут полезны для исследований, изучающих раннюю судьбу вирус-специфических_{Т-клеток FH} .

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетами по уходу за животными и их использованию Третьего военно-медицинского университета. В настоящем исследовании использовались следующие линии мышей: мышь C57BL/6J (B6) (оба пола), в возрасте от 6 до 8 недель, массой тела 25-30 г; CD45.1⁺SM TCR трансгенная мышь (B6 CD45.1 × SM TCR трансгенная), оба пола, в возрасте от 6 до 8 недель, массой 25-30 г; и трансгенная мышь CXCR5-GFP CD45.1⁺SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR трансгенная × CXCR5-GFP knock-in), оба пола, в возрасте от 6 до 8 недель, массой 25-30 г. Трансгенные виды были получены в соответствии с ранее опубликованным отчетом²⁴. Подробная информация о реагентах, буферах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Сбор CD45.1⁺ SM CD4⁺ Т-клеток для адоптивного переноса

1. Усыпить (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) необходимое количество мышей CD45.1⁺ TCR-трансгенных SM в возрасте от 6 до 8 недель²⁴. Сделайте 1-дюймовый разрез слева от брюшинной стенки усыпленных мышей хирургическими ножницами, рассеките селезенку от брюшины и оторвите соединительную ткань за селезенкой^25,26.
2. Поместите каждую селезенку в клеточное ситечко размером 70 мкм в чашке Петри (60 мм × 15 мм) и измельчите селезенку с 3 мл буфера для лизиса эритроцитов (RBC) с помощью поршня шприца объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте круглую сторону поршня шприца, чтобы измельчить селезенку, пока не останется только соединительная ткань.
3. Добавьте 6 мл RPMI + 2% FBS (RPMI 2%) в каждую чашку, чтобы разбавить 3 мл буфера для лизиса эритроцитов. Пипеткой поместите клеточные суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл из чашки. Ополосните посуду еще 3 мл 2% RPMI и переложите в ту же коническую трубку.
4. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации. Ресуспендируйте клетки с помощью изоляционного буфера и отрегулируйте плотность клеток до ~1 ×^{10 8} клеток на мл. Поставьте трубку на лед.
5. Приготовьте 1x биотинилированный коктейль антител против CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c и Ter119 в изоляционном буфере для обогащения CD4⁺ Т-клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте биотинилированные антитела в изоляционный буфер в указанном разведении, как указано в таблице материалов. Держите объем коктейля антител таким же, как и объем изоляционного буфера на шаге 1.4.
6. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации.
7. Ресуспендируйте клеточную гранулу с указанным 1x коктейлем биотинилированных антител в конической пробирке.
8. Положите коническую трубку на лед в шейкере на 30 минут при 45 оборотах в минуту.
9. Во время инкубации с биотинилированными антителами приготовьте необходимый объем гранул, покрытых стрептавидином, в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество спленоцитов от одной наивной мыши требует 200 мкл гранул, покрытых стрептавидином.
10. Промойте клетки центрифугированием при 800 x g с 8-10 мл изоляционного буфера в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг еще два раза.
11. Ресуспендируйте клеточную гранулу подготовленными шариками, покрытыми стрептавидином.
12. Положите трубку на лед в шейкере на 40 минут при 45 оборотах в минуту.
13. Затем поставьте трубку на магнитную подставку на 3-4 минуты, пока все бусины не соберутся на магнитной стороне.
14. Осторожно соберите надосадочную жидкость и переложите ее в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
15. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации.
    Примечание: Существуют и другие коммерческие наборы для обогащения CD4⁺ Т-клеток, которые могут быть использованы в качестве замены для процедуры обогащения CD4⁺ Т-клеток, описанной в шагах 1.5-1.15.
16. Ресуспендируйте клеточную таблетку 2-3 мл 2% RPMI. Аспират 50 мкл клеточной суспензии для проточной цитометрии, анализа эффективности обогащения CD4⁺ Т-клеток (CD4 и Vα2) и жизнеспособности клеток.
17. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации. Ресуспендируйте клеточную гранулу с помощью RPMI и отрегулируйте плотность клеток до 1 ×^{10 7} CD4⁺Vα2⁺ SM клеток на мл. Положите трубку на лед и перейдите к переносу аппальной клетки на следующем этапе.

2. Создание острой LCMV-инфицированной мышиной модели SM-химеры для доступа к раннедифференцированнымклеткам SM T_FH

1. Согрейте мышей-реципиентов C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель инфракрасной лампой, чтобы расширить хвостовую вену для внутривенного введения.
2. Аспират 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1 × 10⁶ SM клеток, приготовленный на шаге 1.17 с помощью инсулинового шприца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекции должен быть изменен каждым исследователем и не должен превышать максимальный объем инъекции, разрешенный институциональным и местным законодательством.
3. Удерживайте мышей на месте с помощью фиксатора мыши, выпрямите хвост и протрите хвост 75% этанолом с помощью ватного тампона, чтобы сделать видимой хвостовую вену.
4. Введите иглу инсулинового шприца в хвостовую вену и вводите клеточные суспензии плавно и медленно. Затем дайте мышам-реципиентам отдохнуть на ночь.
5. На следующий день разбавьте вирусный запас LCMV Armstrong средой RPMI до достижения конечной концентрации 1 × 10⁷ бляшечных единиц/мл.
6. Введите 100 мкл разбавленного раствора LCMV Armstrong (содержащего 1 × 10⁶ бляшенообразующих единиц) в хвостовую вену мышей-реципиентов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый исследователь должен с осторожностью относиться к тому, разрешен ли рекомендуемый титр инфекции институциональным и местным законодательством.

3. Окрашивание проточной цитометрией раннедифференцированных SM T_FH клеток

1. Принесите мышей в жертву (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) на этапе 2.6 на 3-й день после заражения и обработайте лимфоциты из селезенки, как описано на шаге 1. Отрегулируйте плотность клеток примерно до 2 × 10⁷ клеток на мл.
2. Загрузите 50 мкл клеточных суспензий (~1 × 10⁶ клеток) в 96-луночный планшет с круглым дном и долейте 150 мкл окрашивающего буфера на лунку. Держите тарелку на льду.
3. Приготовьте очищенный коктейль антител CXCR5 против мышей крысы (т.е. первичное антитело CXCR5) в соотношении 1:50 в 50 мкл буфера для окрашивания клеток T_FH для каждого образца в пробирке. Тщательно перебейте пробирку и центрифугируйте ее при 15 000 × г в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц. Держите трубку на льду.
4. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 800 × г в течение 1 минуты при 4 °C, отбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
5. Повторите шаг 3.4 и повторно суспендируйте клетки с 50 мкл первичного антитела CXCR5 на лунку. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и выдерживайте на льду в течение 1 часа.
6. Приготовьте коктейль из биотинилированных козьих антител к крысам (т.е. вторичное антитело CXCR5) в соотношении 1:200 в 50 мкл буфера для окрашивания клеток T_FH для каждого образца в новой пробирке. Сделайте пробирку вихревой и центрифугируйте ее при давлении 15 000 × г в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц. Держите трубку на льду.
7. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
8. Повторите шаг 3.7 дважды и держите тарелку на льду.
9. Добавьте в планшет 50 мкл вторичного антитела CXCR5 из лунки на лунку. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и выдерживайте на льду в течение 30 минут.
10. Готовят флуоресцентно-конъюгированный стрептавидин (т.е. третичное антитело CXCR5) в соотношении 1:200 в 50 мкл буфера для окрашивания клеток T_FH для каждого образца. Между тем, добавьте другие антитела против поверхностных маркеров (например, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 и других заинтересованных молекул) и окрашивайте мертвые клетки вместе с третичным антителом CXCR5.
11. Сделайте пробирку вихревой и центрифугируйте ее при 15 000 × г в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц. Держите трубку на льду.
12. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
13. Повторите шаг 3.12 дважды и держите тарелку на льду.
14. Добавьте в тарелку 50 μл коктейля третичных антител CXCR5 на лунку. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и выдерживайте на льду в течение 30 минут в темноте.
15. Приготовьте 200 мкл фиксирующего/проникающего буфера для каждой лунки в соответствии с инструкциями производителя.
16. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
17. Повторите шаг 3.16 дважды и держите тарелку на льду в темноте.
18. Добавьте в каждую лунку по 200 мкл буфера для фиксации/пермеабилизации. Хорошо перемешайте пипеткой вверх и вниз и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут (в темноте).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте буфер для пермеабилизации (1x) в соответствии с инструкциями производителя.
19. Приготовьте коктейль антител против транскрипционных факторов, включая Bcl-6, TCF-1, T-бет и другие заинтересованные молекулы, в 50 мкл буфера для пермеабилизации (1x) для каждой лунки в новой пробирке.
20. Сделайте пробирку и центрифугу вихревыми при 15 000 x g в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц.
21. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, отбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 50 мкл коктейля антител к транскрипционному фактору на лунку. Хорошо перемешать и выдерживать на льду 30 минут в темноте.
22. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, кратковременно перебейте планшет путем декантации и добавьте 200 мкл буфера для пермеабилизации (1x) на лунку.
23. Повторите шаг 3.22.
24. Добавьте 200 мкл буфера для окрашивания в каждую лунку, центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и кратковременно перебейте пластину.
25. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в каждой лунке с 200 мкл окрашивающего буфера и перенесите клетки в пробирки проточной цитометрии для немедленного анализа проточного цитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы образцы могут быть обнаружены в течение 3 дней при добавлении 200 мкл 2% PFA в каждую пробирку и хранении при температуре 4 °C в темноте.

4. Производство ретровирусов

1. Культивируйте клетки 293T (с менее чем десятью пассажами) с 10% средой DMEM в культуральной чашке диаметром 10 см в течение 2-3 пассажей.
2. Когда клетки достигнут 90% конфлюенции, выбросьте старую среду и осторожно промойте клетки PBS дважды, после чего следует краткая трипсинизация 293T-клеток с использованием 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА при комнатной температуре в течение 1 минуты.
3. Остановите процесс разложения, повторно суспензив клетки в 2 мл предварительно нагретой 10% среды DMEM, перенеся их в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируя при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C.
4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу, пипетируя вверх и вниз питательную среду 2 мл предварительно подогретой 10% среды DMEM.
5. Количественно определите количество клеток в планшете 5 × 10⁵ клеток в 2,5 мл 10% DMEM среды на лунку в 6-луночном планшете.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно поворачивайте чашку, чтобы элементы 293T равномерно распределились по всей тарелке.
6. Когда слияние 293Т-клеток превышает 80%, приготовьте реагенты для трансфекции, как описано в шагах 4.7–4.9.
7. В каждую лунку 6-луночного планшета добавьте 250 мкл предварительно подогретой среды Opti-MEM в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Затем добавьте 3 г плазмидной ДНК (содержащей 2 г ретровирусного вектора и 1 г pCL-Eco) в среду Opti-MEM, после чего осторожно пипетируйте вверх и вниз для обеспечения полного перемешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примеров в данном исследовании используются ретровирусные векторы MigR1 и модифицированный вектор MigR1 с областью CDS Bcl6 в восходящем потоке IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
8. Затем добавьте в смесь 7,5 мкл предварительно подогретого реагента для трансфекции (коммерчески полученного) и аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
9. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 20 минут.
10. Распределите смесь по каплям на отдельные участки культивируемой клеточной лунки 293T, после чего осторожно покачивайте сосуд для культивирования взад-вперед и из стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение смеси.
11. Инкубируйте клетки 293T в течение 72 ч в инкубаторе при температуре 37 °C, содержащем 5%_CO2.
12. Определите метку ретровирусного вектора в качестве показателя эффективности трансфекции в трансфицированных клетках 293T с помощью флуоресцентного микроскопа или проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, мы подтвердили флуоресцентный сигнал GFP в значительной части клеток 293T, трансфицированных вектором MigR1, что свидетельствует о высоком качестве трансфекции.
13. Соберите среду для культивирования клеток и центрифугируйте при 2500 × г в течение 10 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора. Полученный надосадочный слой следует тщательно собирать и хранить либо для длительного хранения при -80 °C, либо временно хранить при 4 °C.

5. Активация in vivo , трансдукция ретровируса и адоптивный перенос SM CD4⁺ Т-клеток

1. Введите одну мышь CD45.1⁺ SM (в возрасте от 6 до 8 недель) внутривенно 200 мкг пептида^11,14 LCMV GP_61-77 в объеме 100 мкл среды RPMI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекции должен быть изменен каждым исследователем и не должен превышать максимальный объем инъекции, разрешенный учреждением и местным законодательством.
2. Усыпите мышь SM через 16-18 ч после инъекции пептида (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Приобретите спленоциты после вышеупомянутых процедур на шаге 1.
   Примечание: В качестве альтернативы, способ стимуляции in vitro анти-CD3/анти-CD28^27,28 может быть использован для активации SM CD4⁺ Т-клеток вместо пептидной стимуляции in vivo, описанной на этапах 5.1 и 5.2.
3. Суспензируйте спленоциты с 2% RPMI и отрегулируйте плотность клеток примерно до 1 ×^{10 8} клеток на мл в конической пробирке объемом 15 мл. Держите трубку на льду.
4. Дозируйте 50 мкл клеточной суспензии в 96-луночный планшет с круглым дном и добавьте 150 мкл буфера для окрашивания на лунку.
5. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C для гранулирования клеток, осторожно удалите надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно переведите планшет в вихревую среду и добавьте 200 мкл окрашивающего буфера на лунку.
6. Повторите шаг 5.5 и повторно суспендируйте клетки 50 мкл поверхностного коктейля антител, включая CD4, CD25 и CD69, чтобы определить статус активации SM CD4⁺ Т-клеток. Тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз и выиграйте на льду в течение 30 минут в темноте.
7. Долить в каждую лунку буфер для окрашивания до 200 μл, после чего центрифугировать планшет при 800 × г в течение 1 минуты при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания и кратковременно закрутите пластину.
8. Повторите шаг 5.7 два раза.
9. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и перенесите их в пробирку проточной цитометрии.
10. Проанализируйте клетки, окрашенные флуоресцентными конъюгированными антителами, с помощью проточной цитометрии для оценки статуса активации SM CD4⁺ Т-клеток.
    Активированные SM CD4⁺ Т-клетки демонстрировали высокую экспрессию CD25 и CD69 по сравнению с наивными клетками, что позволяло проводить последующие процедуры трансдукции.
11. Добавьте 1 × 10⁶ SM CD4⁺ Т-клеток (из шага 5.3) на лунку в 24-луночный планшет. Подавите ячейки при 800 × г в течение 3 мин при 4 °C, затем осторожно удалите среду путем декантации.
12. Добавьте 1 мл ретровирусной среды, как описано на шаге 4.13, и 8 мкг полибрена в каждую лунку.
13. Спин-трансдукцию клеток при 800 × g в течение 2 ч при 37 °C.
14. Осторожно отбраковывайте ретровирусную среду с помощью пипетирования и добавляйте в каждую лунку по 1 мл предварительно подогретого 10% RPMI с добавлением рекомбинантного мышиного IL-2 в концентрации 10 нг/мл.
15. Инкубируйте клетки в течение 48 ч в инкубаторе с температурой 37 °C, содержащем 5%_CO2.
16. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и вращайте клетки при 800 × г в течение 6 минут при 4 °C.
17. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и ресуспендируйте клетки с соответствующим объемом 2% RPMI, чтобы получить плотность клеток 1 × 10⁸ клеток на мл в конической трубке объемом 15 мл. Держите трубку на льду.
18. Дозируйте 50 мкл клеточной суспензии в 96-луночный планшет с круглым дном и добавьте 150 мкл буфера для окрашивания на лунку.
19. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C для гранулирования клеток, осторожно удалите надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно переведите планшет в вихревую среду и добавьте 200 мкл окрашивающего буфера на лунку.
20. Повторите шаг 5.19 и повторно суспендируйте клетки 50 мкл поверхностного коктейля антител, включая CD4, Vα2 и антитела, ассоциированные с векторной меткой. Тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз и выиграйте на льду в течение 30 минут в темноте.
21. Долить в каждую лунку буфер для окрашивания до 200 μл, после чего следует центрифугирование планшета при 800 × г в течение 1 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания и кратковременно закрутите пластину.
22. Повторите шаг 5.21 два раза.
23. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и перенесите их в пробирку проточной цитометрии.
24. Проанализируйте клетки, окрашенные флуоресцентными конъюгированными антителами, с помощью проточной цитометрии для оценки эффективности трансдукции в SM CD4⁺ Т-клетках.
    Примечание: Эффективно трансдуцированные SM CD4⁺ Т-клетки продемонстрировали высокую экспрессию метки ретровируса, такой как GFP, в исследовании.
25. Суспензии клеток с шага 5.17 центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации. Ресуспендируйте клеточную гранулу с помощью RPMI и отрегулируйте плотность клеток до 1 ×^{10 7} CD4⁺Vα2⁺ SM клеток/мл.
26. Адоптивно перенесите общее количество 1 × 10⁶ CD45.1⁺ SM CD4⁺ Т-клеток каждой мыши-реципиенту C57BL/6 (в возрасте от 6 до 8 недель) путем внутривенной инъекции 100 мкл клеточной суспензии на этапе 5.25.
27. На следующий день инфицировали мышей-реципиентов C57BL/6 1 ×^{10 6} бляшкообразующими единицами LCMV Armstrong путем внутривенной инъекции.

6. Анализ проточной цитометрии трансдуцированных ретровирусом клеток SM T_FH на ранней стадии острой инфекции LCMV

1. Получите спленоциты от мышей C57BL/6 с шага 5.25 на 3-й день после заражения.
2. Проведите окрашивание проточной цитометрией поверхностных маркеров, включая CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 и другие заинтересованные молекулы, в спленоцитах, как описано на шаге 3.
3. Для обнаружения транскрипционных факторов в SM CD4⁺ Т-клетках, трансдуцированных ретровирусом, меченным флуоресцентными белками, добавляют 200 мкл 2% PFA в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.
4. Выполните фиксацию/пермеабилизацию, окрашивание проточной цитометрией заинтересованных транскрипционных факторов и выполните анализ проточной цитометрии, как описано на шаге 3.

Результаты

Характеристика раннедифференцированных вирус-специфических_{Т-СГ-клеток} при острой LCMV-инфекции
Чтобы выяснить раннюю приверженность к судьбе вирус-специфичных_{Т-клеток FH}, наивные конгенные SM CD4⁺ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп LCMV GP I-A^B

Обсуждение

Исследования в области_{Т-клеток СГ} получили широкое распространение с момента открытия специализированной функции_{Т-клеток СГ} в оказании помощи В-клеткам. Накапливающиеся исследования показали, что дифференцировка клеток T_FH является многоступенчатым и многофакторны...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700