Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В текущем исследовании представлены протоколы для оценки ранней судьбы вирус-специфических клеток TFH и манипулирования экспрессией генов в этих клетках.

Abstract

Фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH) воспринимаются как независимая линия CD4+ Т-клеток, которая помогает родственным В-клеткам вырабатывать высокоаффинные антитела, тем самым устанавливая долгосрочный гуморальный иммунитет. Во время острой вирусной инфекции приверженность к судьбе вирус-специфических Т-клетокСГ определяется на ранней фазе инфекции, и исследования раннедифференцированных клетокТ-СГ имеют решающее значение для понимания Т-клеточного гуморального иммунитета и оптимизации дизайна вакцины. В исследовании, используя мышиную модель инфекции, вызванной вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), и мышь TCR-трансгенную SMARTA (SM) с CD4+ Т-клетками, специфически распознающими эпитоп гликопротеина LCMV I-ABGP 66-77, мы описали процедуры доступа к ранней судьбе вирус-специфических клеток TFH на основе окрашивания проточной цитометрией. Кроме того, использование ретровирусной трансдукции SM CD4+ Т-клеток также позволяет использовать методы манипулирования экспрессией генов в раннедифференцированных вирус-специфических клетках TFH. Следовательно, эти методы помогут в исследованиях, изучающих механизм(ы), лежащие в основе раннего связывания вирус-специфическихТ-FH-клеток.

Introduction

Сталкиваясь с различными патогенами или угрозами, наивные CD4+ Т-клетки адаптируют свои иммунные реакции путем дифференцировки в различные субпопуляции Т-хелперных Т(Т-H) клеток со специализированными функциями1. При острой вирусной инфекции большая часть наивных CD4+ Т-клеток дифференцируется в фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH), которые оказывают помощь В-клеткам 2,3. В отличие от других субпопуляций CD4+ TH-клеток (например, клеток TH1, TH2, TH9 и TH17), клетки TFH

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетами по уходу за животными и их использованию Третьего военно-медицинского университета. В настоящем исследовании использовались следующие линии мышей: мышь C57BL/6J (B6) (оба пола), в возрасте от 6 д?.......

Representative Results

Характеристика раннедифференцированных вирус-специфическихТ-СГ-клеток при острой LCMV-инфекции
Чтобы выяснить раннюю приверженность к судьбе вирус-специфичныхТ-клеток FH, наивные конгенные SM CD4+ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп LCMV GP I-AB

Discussion

Исследования в областиТ-клеток СГ получили широкое распространение с момента открытия специализированной функцииТ-клеток СГ в оказании помощи В-клеткам. Накапливающиеся исследования показали, что дифференцировка клеток TFH является многоступенчатым и многофакторны.......

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 32300785 до X.C.), Китайской национальной программы постдокторантуры для инновационных талантов (No 100). BX20230449 в X.C.) и Национальный крупный проект в области науки и техники (No 2021YFC2300602 в Лос-Анджелес).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

References

Explore More Articles

TFHTFHLCMVSMARTATCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved