Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В текущем исследовании представлены протоколы для оценки ранней судьбы вирус-специфических клеток TFH и манипулирования экспрессией генов в этих клетках.

Аннотация

Фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH) воспринимаются как независимая линия CD4+ Т-клеток, которая помогает родственным В-клеткам вырабатывать высокоаффинные антитела, тем самым устанавливая долгосрочный гуморальный иммунитет. Во время острой вирусной инфекции приверженность к судьбе вирус-специфических Т-клетокСГ определяется на ранней фазе инфекции, и исследования раннедифференцированных клетокТ-СГ имеют решающее значение для понимания Т-клеточного гуморального иммунитета и оптимизации дизайна вакцины. В исследовании, используя мышиную модель инфекции, вызванной вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), и мышь TCR-трансгенную SMARTA (SM) с CD4+ Т-клетками, специфически распознающими эпитоп гликопротеина LCMV I-ABGP 66-77, мы описали процедуры доступа к ранней судьбе вирус-специфических клеток TFH на основе окрашивания проточной цитометрией. Кроме того, использование ретровирусной трансдукции SM CD4+ Т-клеток также позволяет использовать методы манипулирования экспрессией генов в раннедифференцированных вирус-специфических клетках TFH. Следовательно, эти методы помогут в исследованиях, изучающих механизм(ы), лежащие в основе раннего связывания вирус-специфическихТ-FH-клеток.

Введение

Сталкиваясь с различными патогенами или угрозами, наивные CD4+ Т-клетки адаптируют свои иммунные реакции путем дифференцировки в различные субпопуляции Т-хелперных Т(Т-H) клеток со специализированными функциями1. При острой вирусной инфекции большая часть наивных CD4+ Т-клеток дифференцируется в фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH), которые оказывают помощь В-клеткам 2,3. В отличие от других субпопуляций CD4+ TH-клеток (например, клеток TH1, TH2, TH9 и TH17), клетки TFH экспрессируют значительный уровень CXCR5, который является хемокиновым рецептором для В-клеток, хоутингующих хемокин CXCL13, что позволяет клеткам TFH мигрировать в фолликулы В-клеток. В фолликулах В-клетокТ-клетки FH помогают родственным В-клеткам инициировать и поддерживать реакции зародышевого центра, тем самым обеспечивая быструю выработку высокоаффинных антител и долговременную гуморальную память 2,3.

При острой вирусной инфекции ранняя фиксация в судьбе вирусспецифических Т-клетокСГ происходит в течение 72 ч 4,5 и контролируется транскрипционным репрессором В-клеточной лимфомой-6 (Bcl-6)5,6,7,8, который действует как «главный регулятор», определяющий решения о судьбеТ-СГ. Дефицит Bcl-6 сильно притупляет дифференцировку клеток TFH, в то время как эктопическая экспрессия Bcl-6 существенно способствует приверженности судьбе клеток TFH. В дополнение к Bcl-6, несколько молекул участвуют в инструктаже ранней фиксации судьбы клеток TFH. Факторы транскрипции TCF-1 и LEF-1 инициируют дифференцировку клеток TFH путем индукции Bcl-6 9,10,11. Ингибирование Blimp1 как Bcl-6, так и TCF-1 требуется для ранней фиксации судьбы клетокT FH 11,12. STAT1 и STAT3 также необходимы для ранней дифференцировки клеток TFH 13. Кроме того, эпигенетические модификации гистонметилтрансферазой EZH214,15 и m6A метилтрансферазой METTL316 помогают стабилизировать транскрипционные программы клетокT-FH (особенно Bcl6 и Tcf7) и, таким образом, обеспечить раннюю приверженность судьбе клетокT-FH. Несмотря на то, что были достигнуты успехи, в том числе в отношении вышеупомянутых молекул и других, обобщенных в другом месте3, в понимании транскрипционной и эпигенетической регуляции ранней судьбы клетокТ-СГ, ранее неизвестные молекулы еще предстоит изучить.

В мышиной модели инфекции вируса острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) адоптивно перенесенные TCR-трансгенные SMARTA (SM) CD4+ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп гликопротеина LCMV I-AbGP66-77, подвергаются дифференцировке клеток TFH или TH1во время вирусной инфекции. Эта модель бифуркационной дифференцировки TFH/TH1 способствует продвижению модели SM/острой инфекции LCMV в изучении биологии вирус-специфических клеток TFH. Действительно, модель СМ/острой инфекции LCMV широко использовалась в области исследований клетокТ-СГ и сыграла решающую роль в знаковых открытиях в биологии клетокТ-СГ. Это включает в себя идентификацию вышеупомянутого Bcl-6 в качестве определяющего линию фактора транскрипции клеток TFH 5,6, а также других важных транскрипционных факторов (например, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 и Itch19), регулирующих дифференцировку клетокT FH, посттранскрипционную регуляцию ( например, METTL316 и miR-17~9220) дифференцировки клеток TFH, памяти и пластичности клеток TFH 21,22, а также рациональных стратегий вакцинации, нацеленных на клетки TFH (например, селен23).

В настоящем исследовании описаны воспроизводимые методы получения доступа к ранней судьбе вирус-специфическихТ-СГ-клеток , включая (1) создание острой модели мыши-химеры, инфицированной LCMV, пригодной для доступа к раннедифференцированнымТ-СГ-клеткам , (2) проведение проточной цитометрии окрашивания молекул, связанных с ранними дифференцированнымиТ-СГ, и (3) выполнение манипуляций с генами на основе ретровирусного вектора в SM CD4+ Т-клетки. Эти методы будут полезны для исследований, изучающих раннюю судьбу вирус-специфическихТ-клеток FH .

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетами по уходу за животными и их использованию Третьего военно-медицинского университета. В настоящем исследовании использовались следующие линии мышей: мышь C57BL/6J (B6) (оба пола), в возрасте от 6 до 8 недель, массой тела 25-30 г; CD45.1+SM TCR трансгенная мышь (B6 CD45.1 × SM TCR трансгенная), оба пола, в возрасте от 6 до 8 недель, массой 25-30 г; и трансгенная мышь CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR трансгенная × CXCR5-GFP knock-in), оба пола, в возрасте от 6 до 8 недель, массой 25-30 г. Трансгенные виды были получены в соответствии с ранее опубликованным отчетом24. Подробная информация о реагентах, буферах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Сбор CD45.1+ SM CD4+ Т-клеток для адоптивного переноса

  1. Усыпить (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) необходимое количество мышей CD45.1+ TCR-трансгенных SM в возрасте от 6 до 8 недель24. Сделайте 1-дюймовый разрез слева от брюшинной стенки усыпленных мышей хирургическими ножницами, рассеките селезенку от брюшины и оторвите соединительную ткань за селезенкой25,26.
  2. Поместите каждую селезенку в клеточное ситечко размером 70 мкм в чашке Петри (60 мм × 15 мм) и измельчите селезенку с 3 мл буфера для лизиса эритроцитов (RBC) с помощью поршня шприца объемом 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте круглую сторону поршня шприца, чтобы измельчить селезенку, пока не останется только соединительная ткань.
  3. Добавьте 6 мл RPMI + 2% FBS (RPMI 2%) в каждую чашку, чтобы разбавить 3 мл буфера для лизиса эритроцитов. Пипеткой поместите клеточные суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл из чашки. Ополосните посуду еще 3 мл 2% RPMI и переложите в ту же коническую трубку.
  4. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации. Ресуспендируйте клетки с помощью изоляционного буфера и отрегулируйте плотность клеток до ~1 ×10 8 клеток на мл. Поставьте трубку на лед.
  5. Приготовьте 1x биотинилированный коктейль антител против CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c и Ter119 в изоляционном буфере для обогащения CD4+ Т-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте биотинилированные антитела в изоляционный буфер в указанном разведении, как указано в таблице материалов. Держите объем коктейля антител таким же, как и объем изоляционного буфера на шаге 1.4.
  6. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации.
  7. Ресуспендируйте клеточную гранулу с указанным 1x коктейлем биотинилированных антител в конической пробирке.
  8. Положите коническую трубку на лед в шейкере на 30 минут при 45 оборотах в минуту.
  9. Во время инкубации с биотинилированными антителами приготовьте необходимый объем гранул, покрытых стрептавидином, в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество спленоцитов от одной наивной мыши требует 200 мкл гранул, покрытых стрептавидином.
  10. Промойте клетки центрифугированием при 800 x g с 8-10 мл изоляционного буфера в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг еще два раза.
  11. Ресуспендируйте клеточную гранулу подготовленными шариками, покрытыми стрептавидином.
  12. Положите трубку на лед в шейкере на 40 минут при 45 оборотах в минуту.
  13. Затем поставьте трубку на магнитную подставку на 3-4 минуты, пока все бусины не соберутся на магнитной стороне.
  14. Осторожно соберите надосадочную жидкость и переложите ее в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
  15. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации.
    Примечание: Существуют и другие коммерческие наборы для обогащения CD4+ Т-клеток, которые могут быть использованы в качестве замены для процедуры обогащения CD4+ Т-клеток, описанной в шагах 1.5-1.15.
  16. Ресуспендируйте клеточную таблетку 2-3 мл 2% RPMI. Аспират 50 мкл клеточной суспензии для проточной цитометрии, анализа эффективности обогащения CD4+ Т-клеток (CD4 и Vα2) и жизнеспособности клеток.
  17. Суспензии клеток центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации. Ресуспендируйте клеточную гранулу с помощью RPMI и отрегулируйте плотность клеток до 1 ×10 7 CD4+Vα2+ SM клеток на мл. Положите трубку на лед и перейдите к переносу аппальной клетки на следующем этапе.

2. Создание острой LCMV-инфицированной мышиной модели SM-химеры для доступа к раннедифференцированнымклеткам SM TFH

  1. Согрейте мышей-реципиентов C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель инфракрасной лампой, чтобы расширить хвостовую вену для внутривенного введения.
  2. Аспират 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1 × 106 SM клеток, приготовленный на шаге 1.17 с помощью инсулинового шприца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекции должен быть изменен каждым исследователем и не должен превышать максимальный объем инъекции, разрешенный институциональным и местным законодательством.
  3. Удерживайте мышей на месте с помощью фиксатора мыши, выпрямите хвост и протрите хвост 75% этанолом с помощью ватного тампона, чтобы сделать видимой хвостовую вену.
  4. Введите иглу инсулинового шприца в хвостовую вену и вводите клеточные суспензии плавно и медленно. Затем дайте мышам-реципиентам отдохнуть на ночь.
  5. На следующий день разбавьте вирусный запас LCMV Armstrong средой RPMI до достижения конечной концентрации 1 × 107 бляшечных единиц/мл.
  6. Введите 100 мкл разбавленного раствора LCMV Armstrong (содержащего 1 × 106 бляшенообразующих единиц) в хвостовую вену мышей-реципиентов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый исследователь должен с осторожностью относиться к тому, разрешен ли рекомендуемый титр инфекции институциональным и местным законодательством.

3. Окрашивание проточной цитометрией раннедифференцированных SM TFH клеток

  1. Принесите мышей в жертву (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) на этапе 2.6 на 3-й день после заражения и обработайте лимфоциты из селезенки, как описано на шаге 1. Отрегулируйте плотность клеток примерно до 2 × 107 клеток на мл.
  2. Загрузите 50 мкл клеточных суспензий (~1 × 106 клеток) в 96-луночный планшет с круглым дном и долейте 150 мкл окрашивающего буфера на лунку. Держите тарелку на льду.
  3. Приготовьте очищенный коктейль антител CXCR5 против мышей крысы (т.е. первичное антитело CXCR5) в соотношении 1:50 в 50 мкл буфера для окрашивания клеток TFH для каждого образца в пробирке. Тщательно перебейте пробирку и центрифугируйте ее при 15 000 × г в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц. Держите трубку на льду.
  4. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 800 × г в течение 1 минуты при 4 °C, отбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
  5. Повторите шаг 3.4 и повторно суспендируйте клетки с 50 мкл первичного антитела CXCR5 на лунку. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и выдерживайте на льду в течение 1 часа.
  6. Приготовьте коктейль из биотинилированных козьих антител к крысам (т.е. вторичное антитело CXCR5) в соотношении 1:200 в 50 мкл буфера для окрашивания клеток TFH для каждого образца в новой пробирке. Сделайте пробирку вихревой и центрифугируйте ее при давлении 15 000 × г в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц. Держите трубку на льду.
  7. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
  8. Повторите шаг 3.7 дважды и держите тарелку на льду.
  9. Добавьте в планшет 50 мкл вторичного антитела CXCR5 из лунки на лунку. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и выдерживайте на льду в течение 30 минут.
  10. Готовят флуоресцентно-конъюгированный стрептавидин (т.е. третичное антитело CXCR5) в соотношении 1:200 в 50 мкл буфера для окрашивания клеток TFH для каждого образца. Между тем, добавьте другие антитела против поверхностных маркеров (например, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 и других заинтересованных молекул) и окрашивайте мертвые клетки вместе с третичным антителом CXCR5.
  11. Сделайте пробирку вихревой и центрифугируйте ее при 15 000 × г в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц. Держите трубку на льду.
  12. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
  13. Повторите шаг 3.12 дважды и держите тарелку на льду.
  14. Добавьте в тарелку 50 μл коктейля третичных антител CXCR5 на лунку. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и выдерживайте на льду в течение 30 минут в темноте.
  15. Приготовьте 200 мкл фиксирующего/проникающего буфера для каждой лунки в соответствии с инструкциями производителя.
  16. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 200 мкл буфера для окрашивания на лунку.
  17. Повторите шаг 3.16 дважды и держите тарелку на льду в темноте.
  18. Добавьте в каждую лунку по 200 мкл буфера для фиксации/пермеабилизации. Хорошо перемешайте пипеткой вверх и вниз и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут (в темноте).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте буфер для пермеабилизации (1x) в соответствии с инструкциями производителя.
  19. Приготовьте коктейль антител против транскрипционных факторов, включая Bcl-6, TCF-1, T-бет и другие заинтересованные молекулы, в 50 мкл буфера для пермеабилизации (1x) для каждой лунки в новой пробирке.
  20. Сделайте пробирку и центрифугу вихревыми при 15 000 x g в течение 3 минут при 4 °C для агрегирования частиц.
  21. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, отбросьте надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно перебейте планшет и добавьте 50 мкл коктейля антител к транскрипционному фактору на лунку. Хорошо перемешать и выдерживать на льду 30 минут в темноте.
  22. Центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, кратковременно перебейте планшет путем декантации и добавьте 200 мкл буфера для пермеабилизации (1x) на лунку.
  23. Повторите шаг 3.22.
  24. Добавьте 200 мкл буфера для окрашивания в каждую лунку, центрифугируйте планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и кратковременно перебейте пластину.
  25. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в каждой лунке с 200 мкл окрашивающего буфера и перенесите клетки в пробирки проточной цитометрии для немедленного анализа проточного цитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы образцы могут быть обнаружены в течение 3 дней при добавлении 200 мкл 2% PFA в каждую пробирку и хранении при температуре 4 °C в темноте.

4. Производство ретровирусов

  1. Культивируйте клетки 293T (с менее чем десятью пассажами) с 10% средой DMEM в культуральной чашке диаметром 10 см в течение 2-3 пассажей.
  2. Когда клетки достигнут 90% конфлюенции, выбросьте старую среду и осторожно промойте клетки PBS дважды, после чего следует краткая трипсинизация 293T-клеток с использованием 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА при комнатной температуре в течение 1 минуты.
  3. Остановите процесс разложения, повторно суспензив клетки в 2 мл предварительно нагретой 10% среды DMEM, перенеся их в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируя при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу, пипетируя вверх и вниз питательную среду 2 мл предварительно подогретой 10% среды DMEM.
  5. Количественно определите количество клеток в планшете 5 × 105 клеток в 2,5 мл 10% DMEM среды на лунку в 6-луночном планшете.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно поворачивайте чашку, чтобы элементы 293T равномерно распределились по всей тарелке.
  6. Когда слияние 293Т-клеток превышает 80%, приготовьте реагенты для трансфекции, как описано в шагах 4.7–4.9.
  7. В каждую лунку 6-луночного планшета добавьте 250 мкл предварительно подогретой среды Opti-MEM в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Затем добавьте 3 г плазмидной ДНК (содержащей 2 г ретровирусного вектора и 1 г pCL-Eco) в среду Opti-MEM, после чего осторожно пипетируйте вверх и вниз для обеспечения полного перемешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примеров в данном исследовании используются ретровирусные векторы MigR1 и модифицированный вектор MigR1 с областью CDS Bcl6 в восходящем потоке IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. Затем добавьте в смесь 7,5 мкл предварительно подогретого реагента для трансфекции (коммерчески полученного) и аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
  9. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 20 минут.
  10. Распределите смесь по каплям на отдельные участки культивируемой клеточной лунки 293T, после чего осторожно покачивайте сосуд для культивирования взад-вперед и из стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение смеси.
  11. Инкубируйте клетки 293T в течение 72 ч в инкубаторе при температуре 37 °C, содержащем 5%CO2.
  12. Определите метку ретровирусного вектора в качестве показателя эффективности трансфекции в трансфицированных клетках 293T с помощью флуоресцентного микроскопа или проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, мы подтвердили флуоресцентный сигнал GFP в значительной части клеток 293T, трансфицированных вектором MigR1, что свидетельствует о высоком качестве трансфекции.
  13. Соберите среду для культивирования клеток и центрифугируйте при 2500 × г в течение 10 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора. Полученный надосадочный слой следует тщательно собирать и хранить либо для длительного хранения при -80 °C, либо временно хранить при 4 °C.

5. Активация in vivo , трансдукция ретровируса и адоптивный перенос SM CD4+ Т-клеток

  1. Введите одну мышь CD45.1+ SM (в возрасте от 6 до 8 недель) внутривенно 200 мкг пептида11,14 LCMV GP61-77 в объеме 100 мкл среды RPMI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекции должен быть изменен каждым исследователем и не должен превышать максимальный объем инъекции, разрешенный учреждением и местным законодательством.
  2. Усыпите мышь SM через 16-18 ч после инъекции пептида (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Приобретите спленоциты после вышеупомянутых процедур на шаге 1.
    Примечание: В качестве альтернативы, способ стимуляции in vitro анти-CD3/анти-CD2827,28 может быть использован для активации SM CD4+ Т-клеток вместо пептидной стимуляции in vivo, описанной на этапах 5.1 и 5.2.
  3. Суспензируйте спленоциты с 2% RPMI и отрегулируйте плотность клеток примерно до 1 ×10 8 клеток на мл в конической пробирке объемом 15 мл. Держите трубку на льду.
  4. Дозируйте 50 мкл клеточной суспензии в 96-луночный планшет с круглым дном и добавьте 150 мкл буфера для окрашивания на лунку.
  5. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C для гранулирования клеток, осторожно удалите надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно переведите планшет в вихревую среду и добавьте 200 мкл окрашивающего буфера на лунку.
  6. Повторите шаг 5.5 и повторно суспендируйте клетки 50 мкл поверхностного коктейля антител, включая CD4, CD25 и CD69, чтобы определить статус активации SM CD4+ Т-клеток. Тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз и выиграйте на льду в течение 30 минут в темноте.
  7. Долить в каждую лунку буфер для окрашивания до 200 μл, после чего центрифугировать планшет при 800 × г в течение 1 минуты при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания и кратковременно закрутите пластину.
  8. Повторите шаг 5.7 два раза.
  9. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и перенесите их в пробирку проточной цитометрии.
  10. Проанализируйте клетки, окрашенные флуоресцентными конъюгированными антителами, с помощью проточной цитометрии для оценки статуса активации SM CD4+ Т-клеток.
    Активированные SM CD4+ Т-клетки демонстрировали высокую экспрессию CD25 и CD69 по сравнению с наивными клетками, что позволяло проводить последующие процедуры трансдукции.
  11. Добавьте 1 × 106 SM CD4+ Т-клеток (из шага 5.3) на лунку в 24-луночный планшет. Подавите ячейки при 800 × г в течение 3 мин при 4 °C, затем осторожно удалите среду путем декантации.
  12. Добавьте 1 мл ретровирусной среды, как описано на шаге 4.13, и 8 мкг полибрена в каждую лунку.
  13. Спин-трансдукцию клеток при 800 × g в течение 2 ч при 37 °C.
  14. Осторожно отбраковывайте ретровирусную среду с помощью пипетирования и добавляйте в каждую лунку по 1 мл предварительно подогретого 10% RPMI с добавлением рекомбинантного мышиного IL-2 в концентрации 10 нг/мл.
  15. Инкубируйте клетки в течение 48 ч в инкубаторе с температурой 37 °C, содержащем 5%CO2.
  16. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и вращайте клетки при 800 × г в течение 6 минут при 4 °C.
  17. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и ресуспендируйте клетки с соответствующим объемом 2% RPMI, чтобы получить плотность клеток 1 × 108 клеток на мл в конической трубке объемом 15 мл. Держите трубку на льду.
  18. Дозируйте 50 мкл клеточной суспензии в 96-луночный планшет с круглым дном и добавьте 150 мкл буфера для окрашивания на лунку.
  19. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 800 × г в течение 1 мин при 4 °C для гранулирования клеток, осторожно удалите надосадочную жидкость путем декантации, кратковременно переведите планшет в вихревую среду и добавьте 200 мкл окрашивающего буфера на лунку.
  20. Повторите шаг 5.19 и повторно суспендируйте клетки 50 мкл поверхностного коктейля антител, включая CD4, Vα2 и антитела, ассоциированные с векторной меткой. Тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз и выиграйте на льду в течение 30 минут в темноте.
  21. Долить в каждую лунку буфер для окрашивания до 200 μл, после чего следует центрифугирование планшета при 800 × г в течение 1 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания и кратковременно закрутите пластину.
  22. Повторите шаг 5.21 два раза.
  23. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и перенесите их в пробирку проточной цитометрии.
  24. Проанализируйте клетки, окрашенные флуоресцентными конъюгированными антителами, с помощью проточной цитометрии для оценки эффективности трансдукции в SM CD4+ Т-клетках.
    Примечание: Эффективно трансдуцированные SM CD4+ Т-клетки продемонстрировали высокую экспрессию метки ретровируса, такой как GFP, в исследовании.
  25. Суспензии клеток с шага 5.17 центрифугируют при 800 × г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость путем декантации. Ресуспендируйте клеточную гранулу с помощью RPMI и отрегулируйте плотность клеток до 1 ×10 7 CD4+Vα2+ SM клеток/мл.
  26. Адоптивно перенесите общее количество 1 × 106 CD45.1+ SM CD4+ Т-клеток каждой мыши-реципиенту C57BL/6 (в возрасте от 6 до 8 недель) путем внутривенной инъекции 100 мкл клеточной суспензии на этапе 5.25.
  27. На следующий день инфицировали мышей-реципиентов C57BL/6 1 ×10 6 бляшкообразующими единицами LCMV Armstrong путем внутривенной инъекции.

6. Анализ проточной цитометрии трансдуцированных ретровирусом клеток SM TFH на ранней стадии острой инфекции LCMV

  1. Получите спленоциты от мышей C57BL/6 с шага 5.25 на 3-й день после заражения.
  2. Проведите окрашивание проточной цитометрией поверхностных маркеров, включая CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 и другие заинтересованные молекулы, в спленоцитах, как описано на шаге 3.
  3. Для обнаружения транскрипционных факторов в SM CD4+ Т-клетках, трансдуцированных ретровирусом, меченным флуоресцентными белками, добавляют 200 мкл 2% PFA в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.
  4. Выполните фиксацию/пермеабилизацию, окрашивание проточной цитометрией заинтересованных транскрипционных факторов и выполните анализ проточной цитометрии, как описано на шаге 3.

Результаты

Характеристика раннедифференцированных вирус-специфическихТ-СГ-клеток при острой LCMV-инфекции
Чтобы выяснить раннюю приверженность к судьбе вирус-специфичныхТ-клеток FH, наивные конгенные SM CD4+ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп LCMV GP I-AB

Обсуждение

Исследования в областиТ-клеток СГ получили широкое распространение с момента открытия специализированной функцииТ-клеток СГ в оказании помощи В-клеткам. Накапливающиеся исследования показали, что дифференцировка клеток TFH является многоступенчатым и многофакторны...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 32300785 до X.C.), Китайской национальной программы постдокторантуры для инновационных талантов (No 100). BX20230449 в X.C.) и Национальный крупный проект в области науки и техники (No 2021YFC2300602 в Лос-Анджелес).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

Ссылки

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

TFHTFHLCMVSMARTATCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены