A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
В текущем исследовании представлены протоколы для оценки ранней судьбы вирус-специфических клеток TFH и манипулирования экспрессией генов в этих клетках.
Фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH) воспринимаются как независимая линия CD4+ Т-клеток, которая помогает родственным В-клеткам вырабатывать высокоаффинные антитела, тем самым устанавливая долгосрочный гуморальный иммунитет. Во время острой вирусной инфекции приверженность к судьбе вирус-специфических Т-клетокСГ определяется на ранней фазе инфекции, и исследования раннедифференцированных клетокТ-СГ имеют решающее значение для понимания Т-клеточного гуморального иммунитета и оптимизации дизайна вакцины. В исследовании, используя мышиную модель инфекции, вызванной вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), и мышь TCR-трансгенную SMARTA (SM) с CD4+ Т-клетками, специфически распознающими эпитоп гликопротеина LCMV I-ABGP 66-77, мы описали процедуры доступа к ранней судьбе вирус-специфических клеток TFH на основе окрашивания проточной цитометрией. Кроме того, использование ретровирусной трансдукции SM CD4+ Т-клеток также позволяет использовать методы манипулирования экспрессией генов в раннедифференцированных вирус-специфических клетках TFH. Следовательно, эти методы помогут в исследованиях, изучающих механизм(ы), лежащие в основе раннего связывания вирус-специфическихТ-FH-клеток.
Сталкиваясь с различными патогенами или угрозами, наивные CD4+ Т-клетки адаптируют свои иммунные реакции путем дифференцировки в различные субпопуляции Т-хелперных Т(Т-H) клеток со специализированными функциями1. При острой вирусной инфекции большая часть наивных CD4+ Т-клеток дифференцируется в фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH), которые оказывают помощь В-клеткам 2,3. В отличие от других субпопуляций CD4+ TH-клеток (например, клеток TH1, TH2, TH9 и TH17), клетки TFH
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетами по уходу за животными и их использованию Третьего военно-медицинского университета. В настоящем исследовании использовались следующие линии мышей: мышь C57BL/6J (B6) (оба пола), в возрасте от 6 д?.......
Характеристика раннедифференцированных вирус-специфическихТ-СГ-клеток при острой LCMV-инфекции
Чтобы выяснить раннюю приверженность к судьбе вирус-специфичныхТ-клеток FH, наивные конгенные SM CD4+ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп LCMV GP I-AB
Исследования в областиТ-клеток СГ получили широкое распространение с момента открытия специализированной функцииТ-клеток СГ в оказании помощи В-клеткам. Накапливающиеся исследования показали, что дифференцировка клеток TFH является многоступенчатым и многофакторны.......
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 32300785 до X.C.), Китайской национальной программы постдокторантуры для инновационных талантов (No 100). BX20230449 в X.C.) и Национальный крупный проект в области науки и техники (No 2021YFC2300602 в Лос-Анджелес).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
EDTA | Sigma | E9884 | |
FACSFortesa | BD Biosciences | ||
Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
MigR1 | addgene | #27490 | |
NaN3 | Sigma | S2002 | |
Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
pCL-Eco | addgene | #12371 | |
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
Polybrene | Solarbio | H8761 | |
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved