Доступ к ранней дифференцировке вирус-специфических фолликулярных хелперных CD4+ Т-клеток у острых LCMV-инфицированных мышей

Summary

В текущем исследовании представлены протоколы для оценки ранней судьбы вирус-специфических клеток T_FH и манипулирования экспрессией генов в этих клетках.

Abstract

Фолликулярные хелперные Т-клетки (T_FH) воспринимаются как независимая линия CD4⁺ Т-клеток, которая помогает родственным В-клеткам вырабатывать высокоаффинные антитела, тем самым устанавливая долгосрочный гуморальный иммунитет. Во время острой вирусной инфекции приверженность к судьбе вирус-специфических Т-клеток_СГ определяется на ранней фазе инфекции, и исследования раннедифференцированных клеток_Т-СГ имеют решающее значение для понимания Т-клеточного гуморального иммунитета и оптимизации дизайна вакцины. В исследовании, используя мышиную модель инфекции, вызванной вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), и мышь TCR-трансгенную SMARTA (SM) с CD4⁺ Т-клетками, специфически распознающими эпитоп гликопротеина LCMV I-A^B_{GP 66-77}, мы описали процедуры доступа к ранней судьбе вирус-специфических клеток T_FH на основе окрашивания проточной цитометрией. Кроме того, использование ретровирусной трансдукции SM CD4⁺ Т-клеток также позволяет использовать методы манипулирования экспрессией генов в раннедифференцированных вирус-специфических клетках T_FH. Следовательно, эти методы помогут в исследованиях, изучающих механизм(ы), лежащие в основе раннего связывания вирус-специфических_{Т-FH-клеток}.

Introduction

Сталкиваясь с различными патогенами или угрозами, наивные CD4⁺ Т-клетки адаптируют свои иммунные реакции путем дифференцировки в различные субпопуляции Т-хелперных Т(_Т-H) клеток со специализированными функциями¹. При острой вирусной инфекции большая часть наивных CD4⁺ Т-клеток дифференцируется в фолликулярные хелперные Т-клетки (T_FH), которые оказывают помощь В-клеткам ^2,3. В отличие от других субпопуляций CD4⁺ T_{H-клеток} (например, клеток T_H1, T_H2, T_H9 и T_H17), клетки T_FH

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетами по уходу за животными и их использованию Третьего военно-медицинского университета. В настоящем исследовании использовались следующие линии мышей: мышь C57BL/6J (B6) (оба пола), в возрасте от 6 д?.......

Discussion

Исследования в области_{Т-клеток СГ} получили широкое распространение с момента открытия специализированной функции_{Т-клеток СГ} в оказании помощи В-клеткам. Накапливающиеся исследования показали, что дифференцировка клеток T_FH является многоступенчатым и многофакторны.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700