JoVE Logo

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Doku mühendisliği genellikle doku rejenerasyonu için Otogreft yaratmak için in vitro genişlemesinde içerir. Bu çalışmada, genişleme, doku, yenilenme ve in vivo olarak yeniden yapılanma için bir yöntem olup vücut dışında hücreleri ve biyolojik malzemelerin işlenmesi en aza indirmek için geliştirilmiştir.

Özet

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Giriş

Deri ve ürogenital sistem için transplantasyon en doku mühendisliği çalışmaları özel donanımlı hücre kültürleme tesislerde 1,2 sağlıklı doku ve hücre genişlemesi otolog hücre hasat içerir.

Hasta otogreft almaya hazır olduğunda hücre genişlemesi sonra hücreler, genellikle daha sonra kullanılmak üzere saklanır. Azot dondurucular -150 ° C veya daha düşük düşük sıcaklıklarda uzun süreli depolama izin. donma süreci dikkatli ve hücreleri kaybetmemek için kontrol olmalıdır. hücre ölümü biri risk hücre zarlarının yırtılmasına yol açabilir çözdürme işlemi sırasında hücre içi su kristalleşme olduğunu. Hücre dondurma, genellikle hücre, fetal sığır serumu ve dimetil sülfoksit yüksek konsantrasyonu kullanılarak, yavaş ve kontrollü bir soğutma (-1 ° C başına dakika) ile gerçekleştirilir. Çözündükten sonra, hücreler dondurma orta çıkarılması ve hücre kültürü plastik ya da ilgili kültürlenmesiyle yeniden işlenmesi gerekenhastaya geri transplantasyon öncesi biyomalzeme.

Yukarıda belirtilen adımları zaman alıcı ve zahmetli olan, 3 masraflı. Buna ek olarak, hasta transplantasyon için öngörülen hücrelerin in vitro işleme son derece düzenlenir ve iyi eğitimli ve akredite personel ve laboratuarlar 4 gerektirir. Sonuçta, teknik sadece teknik olarak gelişmiş merkezlerin çok az sayıda kurulabilir ve sık cerrahi hastalıklarda daha geniş bir kullanım şüpheli, güvenli ve güvenilir bir üretim süreci temin etmek.

Laboratuar ortamında hücre kültürü içinde sınırlamalarını aşmak için, in vivo olarak, hücre genişlemesi için kıyılmış doku nakli kavramı biyoreaktör olarak vücut kendisini kullanarak sokulur. Bu amaçlar için, otogreft tercihen i organı nihai yeniden düzenleme için gerekli olan şekle göre olan bir 3 boyutlu kalıp üzerinde nakledilen olacaktır5-7 nterest.

Başlangıçta, kıyılmış epitel nakli fikri o epiteli bir yara kenarlarından nasıl büyür açıklanan 1958 yılında Meek tarafından sunuldu. O cildin küçük bir parça (Şekil 1) 8 dik yönde iki parça kesilerek 100% oranında ve böylece hücre genişlemesi için potansiyel marjlarını artırmak ve olduğunu göstermektedir. Teori cilt transplantasyon 9 fileli kısmi kalınlıkta deri grefti kullanımı ile desteklenen ve deride modelleri 10 yara iyileşmesi olmuştur.

figure-introduction-2493
Şekil 1:. Meek teori Meek teorisine göre, epitel bir yara kenarlarından büyür. kıyma teknolojisi ile maruz alanını arttırarak, kıyılmış doku birçok noktalardan yaralar epithelializes.

Bu çalışma hipo dayanmaktadırAynı ilke, bir kalıp etrafında kıyılmış epitel yerleştirerek deri altı dokuya uygulanabilir tezi. (Iç vücuttan yabancı cisim (kalıp) yara alanı kaplar ve ayıran sürekli neoepithelium oluşturmak için epitel hücreleri yara alanları (göç) kapak, kıyılmış nakli (yeniden) den seferber olur ve bölme (genişletmek) Şekil 2).

figure-introduction-3200
Şekil 2:. Meek teorisine göre, in vivo vücut içi doku genişlemesi için kıyılmış epiteli ile 3D kalıp Karikatür deri altı dokuya bir kalıp üzerine yerleştirilir ve daha sonra nakledilen kıyılmış doku kullanarak, hipotez epitel hücreleri göç olduğunu kıyılmış doku kenarları, yeniden, ve yara alanı kaplar ve iç gövde arasında yabancı cisim (kalıp) ayıran bir kesintisiz neoepithelium oluşturacak şekilde genişler.

Önceki in vivo çalışmalar umut verici sonuçlar gösterse de rejenere epitel iyi 7 mekanik travma dayanacak, böylece daha fazla iyileştirmeler otogrefti takviye ile elde edilebilir. kolay besin ve atık ürünlerin yayılması, olasılık kalıbına 3D bir şekilde ve cerrahi işleme kolaylığı: Bu amaçla, başarılı bir biyomalzeme önemli bir önkoşul gibi, tespit edilmiştir. Sonuçlar bu ihtiyaçların kıyılmış dokuya kompozit biyo materyal ekleyerek karşılanabileceğini yapılmıştır.

kıyılmış dokudan oluşan bir iskele geliştirmeyi amaçlayan mevcut çalışma biyolojik olarak parçalanabilir bir kumaş takviye çekirdek içeren kollajen plastik sıkıştırılmış. Bu sayede, canlı hücreler kıyılmış doku parçacıklarının göç olabilir ve orijinal epiteli (deri veya ürotelyum) morfolojik özellikleri karakteristiği ile çoğalırlar. Plastik sıkıştırma kullanarak, iskele azaltmak olduyaklaşık 420 um kıyılmış parçacıkları olarak 1 cm arasında D üst katman kolajen kaplı edildi. Çekirdek kumaşın herhangi bir polimer olabilir, ancak kapsayan kollajen tabakaların 11, birbirleriyle amacıyla hidrofilik yüzey ile değiştirilmesi gereken olabilir.

yöntem kıyılmış mesane mukozasını veya domuz kıyılmış cilt kültürü için bir iskele olarak kullanarak iki plastik sıkıştırılmış kollajen jel içinde poli (ε-kaprolakton) oluşan bir örgü örgü (PCL) dahil ederek gelişmiş bir iskele bütünlüğü sağlanmış. Yapı, iyi konsolide hibrid yapısı üstünde tabakalı, çok katmanlı ürotelyum ve skuamöz deri epitelyumunun başarılı oluşumu gösteren in vitro en fazla 6 hafta içinde, hücre kültür koşullarında muhafaza edilmiştir. yapı işlemek için kolay oldu ve mesane büyütme amaçlı veya cilt kusurlarının örtülmesini yerine dikilir olabilir. Doku iskele tüm parçaları FDA onaylı ve teknik vardırDoku kıyma hasat, plastik sıkıştırma ve tek aşamalı müdahale olarak hastaya geri nakli tek aşamalı işlemleri için kullanılabilir. Prosedür herhangi bir genel cerrahi ünitesinde steril koşullar altında doku genişletme ve yeniden inşası için yapılabildi.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Hayvanlar Stockholm İl Komitesi tarafından önceden onaylanmış ve tüm işlemler hayvan kullanımı yanı sıra, ilgili federal yasalar için düzenlemeler uymuştur.

1. Hayvan Prosedürleri

  1. Cerrahi Hayvan Hazırlama
    1. steril koşullar altında çalışması için gerekli tüm malzeme ve enstrümanlar ile cerrahi tablo hazırlayın. enfeksiyon riskini azaltmak ve hayatta kalma cerrahi koşulları optimize etmek için steril koşullar altında sadece ameliyat.
    2. ameliyat öncesi 12 saat boyunca hayvan oruç ve ağırlığını ölçün. premedikasyonu azaperone bir kas içine enjeksiyon (2 mg / kg) uygulayınız. tiletamine hipoklorit (2.5 mg / kg), zolazepam hipoklorit (2.5 mg / kg), medetomidin (25 ug / kg) ve atropin (/ kg 25 ug) kas içine enjeksiyon ile hayvan anestezisi.
    3. phenobarbiturate enjekte (15 mg / kg) endotrache önceal entübasyon ve% 0.8 -2% izofluran ile genel anestezi devam eder. tek kulakta bir periferik ven kateteri yerleştirin ve hayvan refahını korumak için intravenöz işlem sırasında glikoz (25 mg / ml) demlenmeye.
    4. ısısını, kan basıncını, doygunluk ve periferik nabız kontrol etmek için kulak veya kuyruk izleme cihazları yerleştirin. kulakları veya toynakları ağrı stimülasyonu ile kontrol anestezi. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere merhem sürün.
  2. Mesane Biyopsi Numune eksizyonu
    1. Yarı steril koşullarda idrar boşaltmak için üretra görüntüleyebilir ve üretra yoluyla katater takmak bir spekulum tanıtarak ve mesane içine 10 Fransız silikon kateter kullanılarak mesaneye kateter. 20-25 cm H2O, yaklaşık 100-300 ml bir basınca, steril tuzlu su çözeltisi ile mesane doldurmak ve daha sonra, boş O 2 cm, H 20 (yakl. 8 ml / kg vücut ağırlığı).
    2. the domuz dikkatli bir yan konumuna döndürülmüş klorheksidin glukonat uygulama ile deri temel bir ameliyat öncesi sterilizasyon gerçekleştirin. Tıraş makası ile pelage kaldırdıktan sonra omuz bir diatermi plaka uygulayın.
    3. sırtüstü pozisyonda dikkatlice domuz çevirin ve tıraş makas kullanılarak karın pelage kaldırmak ve klorheksidin glukonat uygulaması ile karın derisinin temel preoperatif sterilizasyon yapmak.
      1. Yumuşak giysilerle ekstremite embed ekstremitelerde eklemlere hiperekstansiyon zarar görme riskini en aza indirmek için. klorheksidin glukonat ardışık uygulamaları ile hayvanın karın cildi sterilize ve cerrahi alan etrafında steril dökümlü yerleştirin.
    4. cilt insizyonu önce, göbek altındaki orta hat buprenorfin (45 ug / kg), karprofen (3 mg / kg) ve lidokain lokal enjeksiyonu içeren bir damar içi analjezik uygulanır. sk tutarak ağrı reaksiyonu kontrol edinforseps ile. fasya yoluyla daha düşük bir orta hat kesi yapmak ve kanama kontrolü için diatermi kullanarak periton. domuz tamamen intraperitoneal bir konuma sahiptir ve serbestçe cerrahi yara aracılığıyla seferber ederek maruz kalabilirler mesane yerelleştirilmesine.
    5. forseps ile mesanenin tutun ve steril bir ölçüm bandı ile ölçmek ve bir steril kalem kullanarak, uzunlamasına yaklaşık 2 cm ve enine 1 cm veya daha küçük bir eliptik şekilli biyopsi örneği işaretlemek (domuz mesane boyutu çeyrek azalma tahammül çok iyi). , Işaretli alana tüketim bir neşter kullanılarak, ve steril şartlar altında DMEM mesane biyopsi örneği yerleştirin.
    6. biotransplant ile ototransplantasyon gerçekleştirin veya iki kat 5-0 vicryl ile dikilmesi yoluyla mesane kapatın. 2-0 ya da 3-0 Vikril çalışan özenle karın fasya kapatın. 3-0 vicryl ile subkutiste ve 3-0 etilon ile cilt kapatın. Yaranın üzerine dikkatle bir pansuman yerleştirinanestezi yeterince kurtarıldı ve ağrıyı ifade etmez kadar hayvana eğilimindedir.
    7. postoperatif bakım koşullarını sağlamak için hayvan bakım tesisi için hayvan taşımak. bir ısıtma lambası ile tek bir kafeste hayvan koyun ve katılmak hayvana anestezi tam iyileşme kadar ve daha sonra hayvanlar çiftler halinde durmuş olsun.
    8. ağrı ve refahı ile ilgili olaysız bir kurtarma sağlamak ve beş gün boyunca günde bir kez üç gün boyunca günde iki kez intramüsküler postoperatif analjezi ve trimetoprim (4 mg / kg) ve sülfonamid (20 mg / kg) için buprenorfin (45 ug / kg) yönetmek ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltır.
  3. Cilt Biyopsi Numune eksizyonu
    1. gerekli tüm malzemeler ile cerrahi tablo hazırlayın. Daha önce 1.1 de tarif edildiği gibi hayvan anestezisi. , Balmumu kullanarak pelage çıkarın yıkayın ve betadin ve% 70 alkol ile kesi alan sterilize ve daha sonra steril dökümlü aroun koyunkesi alanı d.
    2. 0.3 mm parsiyel kalınlıkta deri biyopsi örneği hasat bir dermatom kullanın. 2.2 de tarif edildiği gibi, kıyma önce DMEM deri örneği yerleştirin. yağlı merhem ve bir pansuman ile yara alanı kapsayacak.

2. Kıyma Doku Hazırlanması

  1. mesane Mukoza
    1. DMEM içinde iki kez mesane biyopsisi yıkayın. yukarı bakacak şekilde mukoza ile steril diseksiyon tabağa mesane biyopsi örneği yerleştirin ve diseksiyon pimleri kullanarak plaka taraflardan biri düzeltmek.
    2. Ince makas ve forseps (Şekil 3) kullanılarak detrusor kas mukozal doku ayırın ve bunun üzerine tuz veya DMEM damlayan nemli mukoza tutun.
    3. mukoza üzerinde yerleştirerek kıyma cihazı kullanın ve daha sonra 0.8 mm x 0.8 mm kıyılmış doku parçalarını elde etmek için manuel basınç uygulayarak, dikey ve yatay bir uçtan diğer uca cihazı pass (0.8 mm rotatin arasındaki mesafeg) kesme bıçakları.
  2. cilt
    1. cilt biyopsisi ile eğer kalın: steril diseksiyon plaka üzerine cildi yerleştirin ve deri altı yağ ve dermis epidermis ayırmak için cerrahi makas kullanın. epidermis ince ve saydam (yakl. 0,3 mm) o kıyma için hazır olduğunda.
    2. epidermis üzerine yerleştirerek kıyma aygıtı kullanın. baskı ile, 0.8 mm X 0.8 mm kıyılmış doku parçalarını elde etmek için yatay olarak dikey olarak bir uçtan diğer uca cihazı geçerek.

Plastik Sıkıştırılmış PCL / Kollajen Otogreftlerin 3. hazırlanması

  1. soğuk tutmak için buz üzerinde tüm malzemeyi yerleştirin. gerekli Kaplar: Falcon tüp, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH ve sıçan kuyruğu kollajen tip 1.
    1. 1. 1 N NaOH, damla damla ekleme yoğun arasında değişen pH göstermelidir ortam içinde 7,4-8 (renk pH değerine getirmek için kollajen tip 12 ml 10x DMEM (dikkatli bir şekilde kabarcıklarını önlemek için) 2 ml karıştırın pin sarık). Buna ek olarak, bir pH kağıdının kullanımı.
    2. Dikkatle 1x DMEM 2 ml ekleyin ve çözüm karıştırın. Çelik levha dikdörtgen kalıp (20x30x10 mm) her kollajen, yaklaşık 2 ml, 37 ° C'de inkübe 10 dakika boyunca% 5 CO2 içinde ° C.
      Not: kolajen konsantrasyonu 2.06 mg /% 0.6 asetik asit ilave edin ve bir kolajen 1 mi / cm2 kadar olmalıdır.
    3. kollajen kalıba ayarladığında, kolajen jeli (20 mm x 30 mm) üzerine biyo materyal (PCL) yerleştirin ve üstünde kalan kollajen (yaklaşık 6 mi) dökün. 20 dakika boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
    4. kollajen jel üstünde: kıyılmış doku (6 genişleme 1) yerleştirin. Aşağıdaki gibi plastik sıkıştırma kullanarak mekanik kuvvet tarafından yapının suyu dışarı basın (Şekil 3 ve 4).
    5. steril bir yüzey üzerinde gazlı bez kalın bir tabaka yerleştirin. Gauz üstünde bir paslanmaz çelik hasır (kalın 400 mikron) yerleştirine yastıkları ve naylon örgü (kalın 110 mikron) ve daha sonra bir levha. Dikkatle naylon örgü üzerine kollajen jel / kıyılmış doku transferi ve dikkatli bir şekilde dikdörtgen çelik kalıp çıkarmak.
    6. kollajen jel / kıyılmış doku üstünde naylon örgü yeni bir katman yerleştirin. Naylon filtre üzerine kurulu bir ikinci çelik örgü yerleştirin. Pozisyonda, 5 dakika boyunca 120 g (yani, cam plaka) en az ağırlık basıncı veya yükleme plaka koyun.
    7. ağırlık, naylon ve çelik kafes çıkarın. Otogreftleri şimdi tam kalınlıkta deri yaraları domuz mesane dikilir ya da in vitro kültür için hazırız.
    8. In vitro kültür için, 12 gözlü levhalar monte küçük parçalar halinde ince bir yapı kesti. keratinosit ortamın 1 ml ilave edilir. 37 ° C, 6 haftaya kadar% 5 CO 2 ve kültür kuvöz tabak yerleştirin ve haftada orta 3 kez değiştirin.

Otogreftlerin 4. Dikiş

  1. otogreftin sütür ileDomuz mesaneye kıyılmış mesane mukozası
    1. bekleme süresi boyunca DMEM nemli otogreft tutun. İnce çalışan monofilament sütür ile otogreft dikin. araştırma amaçlı emilmeyen 5-0 etilon kullanın.
    2. üriner kateter aracılığıyla serum fizyolojik ile mesane doldurularak su geçirmez olmadığını kontrol edin. Mümkünse, büyük omentum bir tabaka ile otogreft kapsamaktadır. 1.2.6 açıklandığı gibi karın duvarı, deri altı dokusu ve cilt kapatın. bir yara pansuman uygulayın.
  2. Tam kat Yara için Kıyma Cilt Epidermis ile otogreftin sütür
    1. bekleme süresi boyunca DMEM nemli otogreft tutun.
    2. yakından alttaki yüzeye bağlı otogreft tutmak için köşelerde suturlarla ve otogreftin ortasında yara cilt tam kalınlıkta altına otogreft dikin.
    3. yara nemli tutan plastik bir örtü ile yarayı örtün.

5. Sonlandırma

  1. kas içi zolazepam hipoklorit enjeksiyonu (2.5 mg / kg) ve medetomidin'den (25 ug / kg) önce fesih ve kulak veya kuyruk izleme cihazları uygulamak ile oturaklı hayvan nabız ve kan basıncı kontrol etmek için.
  2. intravenöz pentobarbital sodyum (60-140 mg / kg) öldürücü bir miktarının uygulanması ile hayvan öldürülür. ölüm meydana gelmiştir kadar nabız ve kan basıncını kontrol edin.

6. İn Vitro Kültür


Not: histolojik, in vitro olarak PCL / kollajen yapılarında kıyılmış doku ilerlemesini değerlendirmek için, kollajen / PCL / kıyılmış yamalar keratinosit ortamı kullanılarak 12 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi.

  1. keratinosit ortamının hazırlanması:
    1. 500 ml'lik bir cam şişe sterilize edin.
    2. (1: Karışım 4) Ham F12, 100 ml DMEM 400 ml karıştırın. % 10 fetal bovin serumu ile takviyesi, 5 ug / ml insülin,0.4 ug / ml hidrokortizon, 21 ug / ml adenin, 10 -10 mol / L kolera toksin, 2 x 10 -9 mol / L triiyodotironin / ml transferin, 10 ng / ml, epidermal büyüme faktörü, 50 U / ml penisilin 5 ug ve / ml streptomisin 50 ng.
    3. 0.2 um'lik bir filtre içinden filtre etme ile sterilize ve steril 500ml şişe içinde süzüntü toplanır.

7. İmmünhistokimya

NOT: immünhistokimya protokolü genellikle aşağıdaki adımları ayrılır: (1) tespit ve parafin gömme, (2) mikro-kesit 5 mikron dilimleri, slaytlar, deparaffination ve rehidrasyon yerleştirme için, (3) antijen maskesinin düşürülmesi, boyama ve montaj . immünhistokimya prosedüründe son adımları başlamadan önce, yıkama tamponlar ve antijen maskesinin düşürülmesi solüsyonu (ayrı malzeme detaylarını görmek) hazırlar. Kullanmadan önce, ABC kompleksi çözeltisi, en azından 30 dakika hazırlayın.

  1. tespit
    HAYIRT: aşağıdaki gibi in vitro kültürü sonunda, yamalar gidermek:
    1. % 4 tamponlu formaldehit (PFA) 1 ml Eppendorf tüpleri hazırlayın (Dikkat:.. Formaldehit zehirli olan bu kimyasal ile çalışmaya başlamadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını okuyun eldiven ve koruyucu gözlük takın ve bir davlumbaz içine solüsyon hazırlanır Lütfen).
    2. % 4 PFA içeren bir Eppendorf tüpüne, kolajen yamalar her transfer. Oda sıcaklığında gece boyunca sabitleyin.
    3. 4 ° C'de uzun süreli depolama için% 70 etanol içinde Örnekleri. Numuneler artık dehidratasyon hazır ve kesit önce parafin bloklarda gömme vardır.
  2. rehidrasyon
    1. 15 dakika boyunca X-tra Solv bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. X-tra Solv ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. 10 dakika boyunca mutlak etanol ile bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. mutlak etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. % 95 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar, 10 dakika boyunca ve daha sonra, koyun10 dakika süre ile,% 70 etanol olan bir boyama kavanoza. Son olarak damıtılmış su ile 5 dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın.
  3. antijeninin ortaya çıkartılması
    1. TE çözeltisi ile Coplin kavanoza slaytlar koyun ve 20 dakika için kaynamaya bir su banyosu içinde kavanoza koyun. dikkatle su banyosu dışında kavanoz alın. 30 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar slaytlar soğutun ve Tris tamponu içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkanır. 10 dakika süre ile% 3 hidrojen peroksit ile boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. Tris tampon maddesi içinde 5 dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın. kalem işaretleme bir su itici kullanarak numunelerin etrafında bir daire çizin.
    2. bloklama çözeltisi 100-300 ul kullanılarak antikorun spesifik olmayan bağlanmayı bloke eder. Engelleme çözeltisini çıkarın ve Tris tamponu içinde önerilen yoğunlukta çözüldü birincil antikor 100-300 ul ekle. gece inkübe edin. Antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca iki kez Tris tamponu bölümleri yıkayın.
    3. oda sıcaklığında bir 1 saat için ikincil antikor ile inkübeure. Tris tampon maddesi içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkanır. ABC Elite Kiti (üreticinin talimatlarına uyun) kullanılarak 30 dakika inkübe edin. Tris tampon maddesi içinde iki kez yıkayın.
    4. üreticinin talimatlarına (1-7 dk inkübasyon genellikle açık mor yoğunluğu üretir), Vektör VIP Kit kullanarak takip ederek antikor reaksiyonu geliştirin. distile su slaytlar koyun. 30 sn Mayer'in hematoksilen ile counterstain.
    5. 5 dakika boyunca akan su içinde yıkayın. 1 dakika boyunca% 70 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. % 70 etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. 1 dakika boyunca% 95 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. % 95 etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın.
    6. 5 dakika boyunca X-tra Solv bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. nemli tutmak için bir seferde, tek çıkarın. Her bir slayt üstüne montaj orta bir damla koyun ve üstüne bir cam kapak (hava kabarcıklarını önlemek için çok dikkatle yapmak) koyun. slaytlar gecede kurumasını bekleyin ve bir mikro altında slaytları görüntülemekkapsamı.

Sonuçlar

Bu çalışma, kollajen ve kıyılmış doku plastik sıkıştırma kullanarak nakli için bir biyo materyal üretmek için nasıl gösteren bir yöntem sunar.

Mesane mukozasının ve cilt hasat edilmiş ve daha sonra mekanik olarak küçük parçacıklar (Şekil 3) içine kıyılmış edilebilir. Plastik sıkıştırma ile, kıyılmış partiküller bir kollajen jel (Şekil 4) dış tabakaları içinde mekanik olarak güçlü olan bir merkezi olarak yerleş...

Tartışmalar

Bu çalışma, cerrahi masada transplantasyon için otolog doku ile mesane duvar yamaları üretmek için kolay kullanımlı bir yaklaşım sunuyor. Yamalar ve plastik sıkıştırma ile kombinasyon halinde, dış yüzeylerde kıyılmış doku olmayan orta ve kollajen biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer örgü kombinasyonu ile oluşturulur. Plastik sıkıştırma yöntemi daha önce başka yazarlar tarafından tanımlanan ve kolajen jellerin 12,13 sıvının hızla dışarı itilmesini olarak tanıml...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

The authors thank the Swedish Society for Medical Research, the Promobilia Foundation, the Crown Princess Lovisa Foundation, the Freemason Foundation for Children’s Welfare, the Swedish Society of Medicine, the Solstickan Foundation, Karolinska Institutet, and the Stockholm City Council for financial support.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicone catheter 10-FrenchPreparing the animal for surgery, Section 1
DMEM 10xGibco31885-023Plastic compression section 4
24 well platesFalcon08-772-1Plastic compression section 4
3',3',5-TriiodothyronineSigma-AldrichIRMM469In vitro culture; Section 5
4% PFALabmed Solutions200-001-8Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanolHistolabImmunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kitVectorPK6102Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanolHistolab1399.01Immunocytochemistry; Section 6
AdenineSigma-AldrichA8626In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kgTemgesic, RB Pharmaceuticals, Great BritainPreparing the animal for surgery, Section 1
Azaperone 2 mg/kg Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, AustriaPreparing the animal for surgery, Section 1
Biosafety Level 2 hood Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.VectorThe blocking solution depends of the  origin of  first antibodyImmunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kgAtropin, Mylan Inc, Canonsburg, PAPreparing the animal for surgery, Section 1
Carprofen 3 mg/kg   Rimadyl, Orion Pharma, SwedenPreparing the animal for surgery, Section 1
Chlorhexidine gluconate Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, EnglandPreparing the animal for surgery, Section 1
Cholera toxinSigma-AldrichC8052In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boilingHistolab6150Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom madePlastic compression; Section 4
DMEMGibco3188-5023Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factorSigma-AldrichE9644In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)EthiconSurgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)Gibco10437-036Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)Preparing the animal for surgery, Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse) Preparing the animal for surgery, Section 1
Ham's F12Gibco31765-027Plastic compression section 4
HematoxylinHistolab1820Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamberDALABImmunocytochemistry; Section 6
HydrocortisoneSigma-AldrichH0888In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%Sigma-AldrichH1009Immunocytochemistry; Section 6
InsulinSigma-AldrichI3536In vitro culture; Section 5
IsofluraneIsoflurane, Baxter, Deerfield, ILPreparing the animal for surgery, Section 1
Lidocaine 5 mg/mlXylocaine, AstraZeneca, SwedenPreparing the animal for surgery, Section 1
Lucose 25 mg/mlBaxter, Deerfield, ILPreparing the animal for surgery, Section 1
Marker pen pap penSigma-AldrichZ377821-1EAImmunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg Domitor, Orion Pharma, SwedenPreparing the animal for surgery, Section 1
Mincing deviceApplied Tissue Technologies LLCMinced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)EthiconSurgery, Section 1
NaClSigma-AldrichS7653Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1 NMerck Millipore106462Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmmPlastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protectionAPLVnr 336164Surgery, Section 1
PBSGibco14190-094Plastic compression section 4
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kgPentobarbital, APL, SwedenPreparing the animal for surgery, Section 1
PCL Knitted fabricPlastic compression; Section 4
Rat-tail collagenFirst LINK, Ltd, UK60-30-810Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade - 15Preparing the animal for surgery, Section 1
Shaving shearsPreparing the animal for surgery, Section 1
Stainless stell mesh, 400 μM thick pore sizePlastic compression; Section 4
Steril glovesPreparing the animal for surgery, Section 1
Sterile gownsPreparing the animal for surgery, Section 1
Sterile drapes
SteriliumBode Chemie HAMBURGPreparing the animal for surgery, Section 1
Suture Thread EthilonPreparing the animal for surgery, Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.010 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kgPreparing the animal for surgery, Section 1
TransferrinSigma-AldrichT8158In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC Sigma-AldrichT6066Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate kitVectorSK4600Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)EthiconSurgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water.
X-tra solv (solvent)DALAB41-5213-810Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochlorideZoletil, Virbac, FrancePreparing the animal for surgery, Section 1
Depilatory wax stripsVeetPreparing the animal for surgery, Section 1
Pentobarbital sodiumLundbeckTermination, Section 3

Referanslar

  1. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
  2. Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
  3. Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
  4. Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
  5. Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
  6. Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
  7. Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
  8. Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
  9. Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
  10. Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
  11. Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
  12. Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
  13. Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
  14. Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
  15. Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
  16. Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
  17. Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
  18. Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 108Doku M hendisli iBiomaterialDoku skeleH cre Geni lemeMesanePlastik S k t rmaKolajenK y lm DokuPolimerOtogreft

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır