Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Özet

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Özet

Biyofilmler, koruma ve yapısal bütünlük için kendi ürettiği hücre dışı polimerik madde matrisine dayanan mikroorganizma kümeleridir. Nozokomiyal patojen Pseudomonas aeruginosa'nın , kistik fibrozisli (KF) hastalarda kronik akciğer enfeksiyonuna neden olan bir biyofilm büyüme modunu benimsediği bilinmektedir. Bilgisayar programı, COMSTAT, üç boyutlu konfokal görüntülerden veri çıkararak P. aeruginosa biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri ölçmek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, yazılımın standartlaştırılmış çalışması daha az yaygın olarak ele alınır, bu da biyofilm davranışının en iyi şekilde raporlanması ve merkezler arası karşılaştırma için önemlidir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, COMSTAT aracılığıyla değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm yapılarının miktarını belirlemek için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlamaktır. Teknik, biyofilm kopyaları şeklinde büyütülen ve tobramisin ve anti-Psl monoklonal antikoru Psl0096'ya maruz bırakılan bir CF P. aeruginosa izolatı kullanılarak modellenmiştir. Adım adım yaklaşım, kullanıcı belirsizliğini azaltmayı ve önemli görüntü işleme adımlarını gözden kaçırma olasılığını en aza indirmeyi amaçlar. Spesifik olarak, protokol, görüntü segmentasyonu ve uygun nicel analiz fonksiyonlarının seçimi de dahil olmak üzere, COMSTAT'ın manuel çalışmasıyla ilişkili öznel varyasyonların ortadan kaldırılmasını vurgular. Bu yöntem, kullanıcıların COMSTAT'ı çalıştırmadan önce konfokal görüntüleri işlemek için ek zaman harcamasını gerektirse de, otomatik çıktılarda yanlış temsil edilen biyofilm heterojenisitesini en aza indirmeye yardımcı olur.

Giriş

Biyofilmler, kendi kendine üretilen hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan bir matrise yönlendirilmiş mikroorganizma kümeleridir. EPS matrisi çok karmaşıktır, esas olarak bakteri hücreleri, su, proteinler, polisakkaritler, lipitler ve nükleik asitlerden¹ oluşur ve bunların tümü biyofilmleri serbest yaşayan planktonik hücrelerden belirgin şekilde farklı kılar. Biyofilm EPS birbirine ve çeşitli yüzeylere yapışır. EPS matrisi, hücreler arası sinyalleşme ve savunma² için kullanılan metabolitlerin, genetik materyalin ve bileşiklerin hücreden hücreye değişimine aracılık eden özelliklere sahiptir. Bu özellikler toplu ola....

Protokol

1. Bakteriyel izolat toplama

1. SickKids'te (Toronto) inhale tobramisin ile eradikasyon tedavisi gören KF'li pediatrik hastalardan oluşan bir kohorttan P. aeruginosa izolatları elde edin. İzolatları kullanımdan önce en az üç kez -80 ° C'de gliserol sitrat ve alt kültürde dondurun.

2. İn vitro biyofilm oluşumu

NOT: Modifikasyonlarla in vitro biyofilm oluşumu için odacıklı bir kapak camı yöntemi¹ kullanın. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. P. aeruginosa'yı triptik soya agar ve....

Sonuçlar

KF'li enfekte bir hastadan kültürlenen bir P. aeruginosa izolatı, in vitro biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmede bu yaklaşımın güçlü yönlerini göstermek için kullanılır. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de temsil edilmektedir. ImageJ'deki görüntü işleme ve COMSTAT analiz prosedürü Şekil 2'de gösterilmiştir. ImageJ'de görüntü segmentasyonu için bir CLSM z-s.......

Tartışmalar

İn vitro biyofilm yapılarının üç boyutlu görüntülerini kantitatif olarak karşılaştırmak için önceden belirlenmiş bir yöntem yoktur ve bu bağlamda açıklanan prosedürlerin, operatörler arası değişkenlik nedeniyle standartlaştırılması genellikle zordur²⁰. Bu nedenle, bu protokol, değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm mimarisindeki değişiklikleri ölçmek isteyen COMSTAT uygulamaları için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Psl mAb, Psl0096	Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium	Fisher Scientific	R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells	Thermo Fisher Scientific	155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Thermo Fisher Scientific	S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized	BioShop Canada	LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg	Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific	J66040	It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3	Quorum Technologies		Image analysis software