Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Антимикробные изменения архитектуры биопленки Pseudomonas aeruginosa различаются среди клинических изолятов, культивируемых у пациентов с муковисцидозом и хронической легочной инфекцией. После конфокальной микроскопии программное обеспечение COMSTAT может быть использовано для количественной оценки вариаций в архитектуре биопленки (например, площади поверхности, толщины, биомассы) для отдельных изолятов с целью оценки эффективности противоинфекционных агентов.
Биопленки представляют собой агрегаты микроорганизмов, которые полагаются на самостоятельно производимую матрицу внеклеточного полимерного вещества для защиты и структурной целостности. Известно, что внутрибольничный патоген, Pseudomonas aeruginosa, принимает биопленочный режим роста, вызывая хроническую легочную инфекцию у пациентов с муковисцидозом (МВ). Компьютерная программа COMSTAT является полезным инструментом для количественной оценки антимикробных изменений в архитектуре биопленки P. aeruginosa путем извлечения данных из трехмерных конфокальных изображений. Тем не менее, стандартизированная работа программного обеспечения рассматривается реже, что важно для оптимальной отчетности о поведении биопленки и кросс-центрового сравнения. Таким образом, целью данного протокола является обеспечение простой и воспроизводимой основы для количественного определения биопленочных структур in vitro в различных антимикробных условиях с помощью COMSTAT. Метод смоделирован с использованием изолята CF P. aeruginosa , выращенного в виде репликатов биопленки и подвергнутого воздействию тобрамицина и моноклонального антитела против Psl Psl0096. Пошаговый подход направлен на уменьшение неопределенности для пользователя и минимизацию вероятности пропуска важных этапов обработки изображений. В частности, в протоколе подчеркивается устранение субъективных вариаций, связанных с ручной работой COMSTAT, включая сегментацию изображений и выбор соответствующих функций количественного анализа. Несмотря на то, что этот метод требует от пользователей дополнительных затрат времени на обработку конфокальных изображений перед запуском COMSTAT, он помогает свести к минимуму искаженную гетерогенность биопленки при автоматизированных выводах.
Биопленки представляют собой агрегаты микроорганизмов, ориентированные в матрице самостоятельно производимых внеклеточных полимерных веществ (ЭПС). Матрица ЭПС очень сложна и состоит в основном из бактериальных клеток, воды, белков, полисахаридов, липидов и нуклеиновых кислот1, которые делают биопленки заметно отличающимися от свободно живущих планктонных клеток. Биопленочные ЭПС прилипают друг к другу и к различным поверхностям. Матрица EPS обладает свойствами, которые опосредуют межклеточный обмен метаболитов, генетического материала и соединений, используемых для межклеточной передачи сигналов и защиты2. Эти свойства в совокупности обеспечивают структурную целостность биопленки и защиту от внешних стрессоров, способствуя уклонению от иммунитета и устойчивости к противомикробным препаратам3.
Pseudomonas aeruginosa является хорошо известным внутрибольничным патогеном, который, как известно, использует стратегию уклончивого роста биопленки в ответ на противомикробные препараты. Ярким примером этого являются пациенты с рецессивным генетическим заболеванием, муковисцидозом (МВ). Биопленки играют ключевую роль в развитии устойчивой к противомикробным препаратам P. aeruginosa4 и позволяют установить хроническую легочную инфекцию у пациентов с муковисцидозом, вызывающую ускоренное снижение функции легких и преждевременную смертность5. В связи с этим проводятся исследования биопленки in vitro для проверки эффективности антибиотиков и новых противоинфекционных средств против изолятов P. aeruginosa, полученных от пациентов с CF 6,7. После формирования биопленки противомикробные препараты наносятся наружно на структуру, а конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) используется для создания трехмерных реконструкций сегментов биопленки с высоким разрешением. Обычной практикой является использование компьютерного программного обеспечения COMSTAT в качестве плагина к ImageJ для количественной оценки изменений в архитектуре биопленки 8,9,10,11.
Несмотря на то, что COMSTAT полезен для количественной оценки структуры биопленки, воспроизводимость и стандартизация анализа изображений рассматриваются реже. Например, процедура обработки изображений, выполняемая до запуска COMSTAT, является объективной, но содержит элемент субъективности при установке пороговых значений изображения12,13. Аналогичным образом, программа COMSTAT позволяет оператору выбирать от базовых до расширенных условий и параметров для сегментации изображения, а также десять функций количественного анализа (например, распределение толщины, площадь поверхности, биомасса, коэффициент безразмерной шероховатости). Множество пользовательских опций в сочетании с различным уровнем квалификации оператора может привести к ошибочному представлению информации о поведении биопленки.
Таким образом, целью данного протокола является представление относительно простого метода количественного сравнения биопленочных структур in vitro с использованием COMSTAT. В данной работе трехмерные изображения сегментов биопленки изолята CF P. aeruginosa захватываются с помощью CLSM с использованием модели покровного стекла в камере14 — признанной методики, используемой для проведения воспроизводимых экспериментов с биопленкой in vitro . Используя COMSTAT в качестве плагина к ImageJ, этот метод позволяет исследователям количественно идентифицировать изменения в архитектуре биопленки в присутствии противомикробных препаратов в различных условиях. В целом, этот метод направлен на устранение субъективных вариаций, связанных с ручным управлением COMSTAT, тем самым способствуя стандартизации протоколов в разных центрах.
1. Сбор бактериальных изолятов
2. Образование биопленки in vitro
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте камерный методпокровного стекла 1 для формирования биопленки in vitro с модификациями. Общий рабочий процесс этой модели показан на рисунке 1.
3. Биопленочное флуоресцентное окрашивание
4. Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура обработки изображений и анализа COMSTAT представлена на рисунке 2. Получите снимки лунок в тот же день окрашивания биопленкой. Если задержка в визуализации превышает 1 ч, камерное покровное стекло поставьте в холодильник в темное время суток до дальнейшей обработки.
5. Анализ COMSTAT
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественно анализируйте изображения с помощью свободно доступной компьютерной программы COMSTAT16,17, переписанной в виде плагина (Comstat2) для ImageJ. Ознакомьтесь с общими инструкциями по анализу стеков изображений биопленок в загруженном пакете. В этом материале представлен обобщенный протокол с выбранными этапами обработки ImageJ и функциями COMSTAT, рекомендованными для количественной оценки влияния противомикробных препаратов на образование биопленки.
Изолят P. aeruginosa, культивируемый у инфицированного пациента с муковисцидозом, используется для демонстрации преимуществ этого подхода в точном количественном определении антимикробных индуцированных изменений в архитектуре биопленки in vitro . Общий рабочий процесс этой модели...
Не существует предписанного метода количественного сравнения трехмерных изображений биопленочных структур in vitro , и процедуры, описанные в этом контексте, часто трудно стандартизировать из-за межоператорной вариабельности. Таким образом, этот протокол предлагает пр...
Никакой
Авторы выражают признательность Фонду муковисцидоза за предоставление финансирования для этого исследования.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Psl mAb, Psl0096 | Medimmune | ||
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium | Fisher Scientific | R01200 | |
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Thermo Fisher Scientific | S34854 | |
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized | BioShop Canada | LBL666 | |
Tobramycin, 900 µg/mg | Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific | J66040 | It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency |
Quorum Volocity 6.3 | Quorum Technologies | Image analysis software |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены