Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

Özet

İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE'nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.

Özet

Retinal pigment epiteli (RPE) ve retina, ışık algısını ve görmeyi düzenlemek için birlikte çalışan fonksiyonel ve yapısal olarak bağlı dokulardır. RPE apikal yüzeyindeki proteinler, fotoreseptör dış segment yüzeyindeki proteinlerle sıkı bir şekilde ilişkilidir ve RPE'yi fotoreseptörlerden / retinadan tutarlı bir şekilde ayırmayı zorlaştırır. Fotoreseptörlerin ve RPE hücrelerinin ayrı hücresel analizi için tam RPE / koroid ve retina düz montajları üretmek üzere retinayı insan gözlerinin RPE'sinden verimli bir şekilde ayırmak için bir yöntem geliştirdik. RPE tarafından taşınmayan bir şeker olan yüksek ozmolariteli bir D-mannitol çözeltisinin intravitreal enjeksiyonu, RPE hücre bağlantılarına zarar vermeden RPE ve retinanın tüm arka oda boyunca ayrılmasını indükledi. Retinaya bağlı RPE yamaları gözlenmedi. Aktinin falloidin etiketlenmesi RPE şeklinin korunmasını gösterdi ve tüm epitelin morfometrik analizine izin verdi. RPE hücre sınırlarını doğru bir şekilde tanımak ve segmentlere ayırmak ve 30 farklı şekil metriğini ölçmek için yapay zeka (AI) tabanlı bir yazılım geliştirilmiştir. Bu diseksiyon yöntemi yüksek oranda tekrarlanabilir ve diğer hayvan modellerine kolayca genişletilebilir.

Giriş

Retinal pigment epiteli (RPE) ve nöral retina, fotoreseptörlerin RPE'ye güçlü fizyolojik bağımlılığı nedeniyle birbirleriyle güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Diseksiyon sırasında, nöral retinanın RPE'den mekanik olarak ayrılması, RPE hücrelerinin yırtılmasına neden olur, RPE'nin apikal kısımları retinal fotoreseptörlerin dış segmentlerine bağlı kalır. RPE-retinal adezyonun derecesi o kadar büyüktür ki, ayrılmadan sonra retinada kalan pigment miktarı, retinal adezyonun gücünü ölçmek için kullanılır¹. Spesifik olarak, apikal tarafta bulunan RPE sıkı kavşaklar ve bunları birbirine bağlayan aktin yapısı, mekanik ayırma sırasında kopar. Bu nedenle, hücre kenarlıkları için RPE düz montajlarının boyanması, birçok hücrenin eksik kenarlıklara sahip olduğu yamalı bir tek katmanla sonuçlanır. Bu etki, doku diseksiyondan önce paraformaldehit (PFA) ile sabitlendiğinde, proteinler çapraz bağlandıkça daha da şiddetlenir.

İntravitreal ilaç dağıtımı üzerine yapılan çalışmalar, arka kamaraya hiperozmotik solüsyon enjeksiyonlarının retina dekolmanı indüklediğini göstermiştir ^2,3. Bu deneylerde, orta vitreusa enjekte edilen 1.000 mOsm ila 2.400 mOsm arasında değişen 50 μL'lik farklı çözeltiler, dakikalar içinde retina dekolmanına neden oldu. Özellikle, yüksek ozmolariteli çözeltilere uzun süre maruz kaldıktan sonra bile, RPE sıkı bağlantıları, hem tavşan hem de maymun gözlerinin iletim elektron mikroskobik görüntülerinde bozulmadan ortaya çıktı³. Benzer bir stratejiyi takiben, RPE diseksiyonu yapmadan önce etkili bir retina dekolmanı indüklemek için orta vitreusa hiperozmotik bir D-mannitol çözeltisi enjekte ettik. D-mannitol RPE⁴ tarafından taşınmadığından, ozmotik bir gradyan oluşturarak yüksek bir intravitreal konsantrasyon korunur. RPE ve retinanın tüm arka kamara boyunca verimli bir şekilde ayrılması, RPE hücresel bağlantılarının korunmasını garanti eder ve tüm düz montajda RPE morfometrisinin incelenmesine izin verir. Buna ek olarak, floresan olarak etiketlenmiş RPE hücre sınırlarını tanıyan ve segmentlere ayıran, 30 farklı şekil metriğini ölçen ve görselleştirme^için her metriğin ısı haritalarını üreten yapay zeka (AI) tabanlı bir yazılım geliştirdik ^5,6.

Protokol

Kadavra insan küreleri Gelişmiş Görüş Ağı'ndan (Birmingham, AL) elde edildi. Kadavra dokusu üzerinde yapılan çalışmalar NIH Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından araştırma etik kurulundan muaf tutulur.

1. Göz küre sevkiyatı

1. Enükleasyondan sonra, taze göz kürelerini Ca 2 + ve Mg^{2 +} ile buz gibi soğuk DPBS 1x ile dolu bir kapta^gönderin.
   NOT: Enükleasyondan sonraki 24 saat içinde gözü diseke etmek daha iyidir. RPE morfolojisi bu süre zarfında değiştirilmez.

2. Silikon kalıp hazırlama

1. 25 mm çapında yuvarlak tabanlı bir tüpün alt 20 mm'sini kesin. Kare ağırlıklı bir teknenin tabanına yerleştirin (81 mm x 81 mm x 25 mm).
2. Silikon Elastomer Kitinin iki bileşenini 10:1 oranında karıştırın ve havayı hapsetmemeye dikkat edin. Karışımı, yuvarlak tabanlı tüpün küresel parçasını içeren tartım teknesine dökün.
3. Silikonu gece boyunca oda sıcaklığında kürleyin. Tartım teknesini ve yuvarlak tabanlı tüpü kürlenmiş silikon kalıptan çıkarın.

3. RPE diseksiyonu

1. Kasların ve bağ dokusunun taze göz küresinin sklerasını temizleyin. Skleradan geçirilmiş 27 G iğneleri kullanarak gözü silikon kalıba sabitleyin. Kalıbın boşluğunu DPBS 1x ile Ca 2+ ve Mg²⁺ ile doldurun.
   NOT: Göz odasını ihlal etmemeye dikkat edin. İğneler sadece skleradan geçmelidir.
2. Vitreusa ~ 400 μL 1.700 mOsm D-mannitol çözeltisi enjekte etmek için 1 mL'lik bir şırınga ve 21 G'lik bir iğne kullanın. Gözün ön odasını delmekten kaçınmak için iğneyi pars plana'dan geçirin. Gözü ~ 45 dakika oda sıcaklığında bırakın.
3. Ön odayı pars plana seviyesinde bir çift ince makas ve forseps kullanarak kesin. Arka göz odacığını DPBS 1x ile Ca 2+ ve Mg²⁺ ile doldurun. Stereomikroskop altında, makulayı (retinadaki sarı nokta) lokalize edin.
4. Cerrahi bir vitreus kesici varsa, vitreusu çıkarın ve Ca 2 +^{ve Mg 2 +} ile DPBS 1x ile değiştirin. Alternatif olarak, vitreusu forseps ile kaldırmaya çalışın ve ince makasla kesin.
5. Maküler bölgenin korunmasına dikkat ederek, gözü kadranlara ayırın: nazal, zamansal, üstün ve aşağı. İğneleri yoldaysa çıkarın.
6. Gözün tereyağlı arka odacığını, Ca 2+ ve Mg²⁺ ile DPBS 1x içeren 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Retinayı çıkarmadan önce, siliyer kenar boşluğunda biraz kesim (V şeklinde) yaparak makulayı içeren yaprakları işaretleyin. Retina üzerinde yatan tüm vitreusları kaldırın ve kesin.
7. Retinanın RPE'den ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek ve iki katman arasında bir miktar sıvının dolaşmasına izin vermek için retinayı kavisli bir spatula veya bir çift forseps ile birden fazla taraftan yavaşça kaldırın.
   NOT: Retina hala çok periferde (siliyer kenar boşlukları) ve optik sinirde tutulacaktır.
8. Retinayı tüm yapraklardaki siliyer kenar boşluklarından kesin ve RPE'yi çizmediğinizden emin olun. Dokuyu% 4 PFA'ya yerleştirin ve ~ 1 saat boyunca inkübe edin. DPBS 1x ile 3x'i Ca 2+ ve Mg²⁺ ile^yıkayın. Dokuyu Ca 2+^{ve Mg 2+} ile DPBS 1x ile doldurulmuş bir kaba aktarın ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Bu noktada, retina sadece optik sinire bağlanır. Bu, bu denemede bir duraklama noktasıdır.
9. Numuneyi, Ca 2+^{ve Mg 2+} ile DPBS 1x içeren 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Optik sinir kafasını 1,5 mm'lik bir biyopsi punch ile delin ve retinayı toplayın. Nöral retinayı DPBS 1x'te Ca 2+ ve Mg²⁺ ile 4 °C'de saklayın.
   NOT: Optik sinir kafasını delmeden önce, optik siniri skleral tarafta mümkün olduğunca kestiğinizden emin olun. Bu, zımbanın hassasiyetini artıracaktır. Düz montaj %4 PFA'da sabitlendikten sonra optik sinirin delinmesi, optik sinirin etrafında bulunan RPE hücrelerine verilen hasarı azaltır.
10. RPE / koroid tabakasını çevreden yavaşça kaldırarak ve sklera ile RPE arasındaki koroidal damarları ve bağ dokusunu bir çift Vannas yay makası ile keserek sklerayı RPE / koroidden çıkarın. RPE / koroid skleradan tamamen ayrıldıktan sonra, RPE / koroid katmanını toplayın. Dokuyu Ca 2+^{ve Mg 2+} ile DPBS 1x ile doldurulmuş bir kaba aktarın ve 4°C'de saklayın.
    NOT: Şu anda deneme duraklatılabilir.

4. Boyama

1. RPE/koroidi 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. DPBS 1x'te numuneyi Ca 2+ ve Mg²⁺ ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 sığır serum albümini (BSA), %0,5 Ara²⁰ ve %0,5 Triton X-100 ile bloke edin ve geçirgenleştirin.
2. Numuneyi, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 BSA,% 0.5 Aralık 20 ve% 0.5 Triton X-100 ile Ca²⁺ ve Mg 2+ ile DPBS 1x'te 1:²⁵⁰ seyreltmede 647 florofor ile konjuge edilmiş falloidin ile inkübe edin. DPBS 1x'te 3x'i Ca 2+ ve Mg²⁺ ile yıkayın.
3. RPE/koroid numunesini 50 mm x 75 mm cam kızağa aktarın ve düzleştirin. Numuneyi daha düz hale getirmek için her "yaprağı" ikiye bölün. Makala dikkat edin. Hidrofobik bir kalemle düz montajın bir konturunu çizin.
4. Lipofuscin otofloresansını söndürmek için,% 70 etanol içinde 1:20'ye seyreltilmiş 500 μL otofloresan söndürücü çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
5. DPBS 1x'te Ca 2+^{ve Mg 2+} ile iyice (en az 3x) yıkayın. DPBS'yi çıkarın ve montaj ortamını ekleyin. Düz montaja bir kapak camı yerleştirin ve oje ile kapatın.
6. Flatmount'u bir floresan mikroskobu ile görüntüleyin (tercihen 10x veya 20x objektif kullanarak).

5. REShAPE analizi

NOT: REShAPE AI tabanlı algoritma 10x ve 20x görüntüler üzerinde eğitildiğinden, görüntüleme sırasında 10x veya 20x objektif kullanılması şiddetle tavsiye edilir . Aksi takdirde, görüntülerin buna göre yeniden ölçeklendirilmesi gerekir.

1. Görüntüler birden fazla floresan kanalla elde edilirse, hücre sınırlarını elde etmek için kullanılan kanalı izole edin. Görüntüleri 16 bit gri tonlamalı TIF dosyaları olarak dışa aktarın.
   NOT: .czi dosya uzantısıyla alınan görüntülerin TIF dosyaları olarak dışa aktarılması gerekmez, ancak hücre kenarlıklarını içeren kanalın yine de yalıtılması gerekir.
2. Yazılımı Windows x64 veya Linux (Centos 7) platformlarına yükleyin.
   NOT: Yazılım ve kurulum talimatları https://github.com/nih-nei/REShAPE bulunabilir.
3. Yazılımı açın (Şekil 1).
4. Dizinler sekmesinde, giriş ve çıkış klasörlerini seçin. Giriş dizininde, görüntüleri içeren klasörü seçin. Çıktı dizininde, yazılımın yolu otomatik olarak "giriş dizini/İşlenmiş" olarak değiştirmesine izin verin. Alternatif olarak, çıkış dizinini el ile değiştirin.
   NOT: Yazılım, giriş klasöründe bulunan tüm görüntüleri yineleyecektir.
5. NN Segmentasyon Seçenekleri sekmesinde, görüntü segmentasyonu için aşağıdaki ayarları seçin:
   1. Toplu İş Boyutu: İyi bir başlangıç noktası olarak metin kutusuna 20 değerini yazın, ancak sistemde grafik işleme birimleri (GPU'lar) biterse bu değeri düşürün.
      NOT: Orijinal görüntü, işlenmek üzere daha küçük kutucuklara bölünmüştür. Toplu iş boyutu, aynı anda kaç kutucuğun işlenebileceğini belirtir.
   2. GPU mu kullanıyorsunuz?: Sistemde yeterli GPU kaynağı yoksa Hayır kutusunu işaretleyin.
   3. Dahili Ölçek: Açılır menüyü kullanarak, görüntülerin 10x veya 20x hedefiyle alınmadığı durumlarda dahili ölçeklendirmeyi Yok'tan değiştirin. Örneğin, 1/2 düğmesini kullanarak 40x görüntüyü boyutun yarısına küçültün. Açılır menüde bulunan yeniden ölçeklendirme seçenekleri aşağıdaki gibidir: 5x, 2x, Hiçbiri, 1/2, 1/5.
      NOT: Makine öğrenimi, 10x ve 20x görüntülerle eğitilmiştir. Diğer büyütmelerde çekilen görüntülerden hücre sınırlarını tanımayabilir. Bu durumda, ikili görüntüler tamamen siyah görünecektir.
   4. Arti Filtresi: Görüntüde bulunabilecek ve hücre sınırı segmentasyonuna müdahale edebilecek çok parlak parçacıkları (retinanın veya optik sinirin etrafındaki bağ dokusunun kalıntılarını veya küçük kısımlarını) çıkarmak için artefakt filtresi sekmesini kullanın. Varsayılan olarak filtre kullanılmaz. Açılır menüdeki yapay filtre seçenekleri aşağıdaki gibidir: Normal, Güçlü ve Zayıf.
6. Döşenmiş Görüntü Seçeneği sekmesinde, Pad Tiles By parametresini ayarlayarak görüntü kutucukları arasındaki örtüşme miktarını belirtmek için metin kutusuna bir değer ekleyin. 100 piksellik bir örtüşme genellikle iyi çalışır.
7. Çıktı Grafiği Seçenekleri sekmesinde, ısı haritası oluşturma ayarlarını yapın:
   1. Döşenmiş Görüntüleri Yeniden Yapılandır?: Sistemde büyük görüntülerin analizi için yeterli kaynak yoksa, yazılımın tüm görüntüyü yeniden oluşturmadan tek tek döşemeleri kaydederek analizi tamamlamasına izin vermek için Hayır kutusunu işaretleyin.
   2. Renkli Görüntüler Oluştur: Isı haritaları oluşturmak için açılır menüden Tümü'nü seçin.
   3. Boyama için, açılır menüde bulunan farklı renk paletlerinden birini seçin: Termal, Yeşil, Mpl-magma, Faz, Ateş, Jet, Camgöbeği Sıcak.
   4. Görüntü Biçimi için, sekmedeki seçeneklerden birini belirleyerek görüntüleri TIF veya PNG olarak kaydedin.
   5. Kullanım Kılavuzu Sınırları? özelliği ile ilgili olarak, yazılımın her görüntüde algılanan minimum ve maksimum değerleri kullanmasına izin vermek için Hayır kutusunu işaretleyin. Her şekil metriği ısı haritası için değer aralığını el ile ayarlamak üzere Evet kutusunu işaretleyin ve metin kutularına değerler ekleyerek tek tek parametreler için aralıkları seçmek üzere Sınırları Ayarla düğmesini tıklatın. İlgilenilen değerleri değiştirdikten sonra, Kaydet'e tıklayın. Tüm sınırları sıfırlamak için Varsayılanları Yükle'ye tıklayın.
      NOT: Birden fazla görüntüden gelen ısı haritalarının karşılaştırılması gerekiyorsa, örneğin farklı bileşiklerin hücre şekli üzerindeki etkilerini karşılaştırırken manuel sınırlar kullanın. Bu şekilde, aynı değer aralığı kullanılır. Manuel olarak girilecek değerler kümesi, numunenin türüne bağlı olarak değişir. En uygun aralığı seçmek için birkaç yineleme çalıştırmanız önerilir.
8. Analiz için Hücre Boyutu Kısıtlamaları sekmesinde, analiz için bir hücre boyutu eşiği seçin:
   1. Alt Hücre Boyutu'nda, metin kutusuna analize dahil edilecek en küçük hücrenin boyutunu ekleyin.
   2. Üst Hücre Boyutu'nda, metin kutusuna analize dahil edilecek en büyük hücrenin boyutunu ekleyin.
      NOT: Hücre boyutu birimi, Otomatik Birim Dönüştürme sekmesinde seçilen seçeneğe bağlı olarak piksellerden mikrometre kareye değişir.
9. Otomatik Birim Dönüştürme sekmesinde, analiz için tercih edilen birimi seçin:
   1. Pikselleri gerçek birimlere dönüştür?'de, analizi piksel birimlerinde çalıştırmak için Hayır kutusunu işaretleyin. Analizi mikrometre cinsinden çalıştırmak için Evet kutusunu işaretleyin.
   2. Ölçek çubuğunun uzunluğu (Piksel) alanına, metin kutusuna piksel değerini girin.
   3. Ölçek çubuğunun uzunluğu (Mikronlar) alanına, metin kutusuna karşılık gelen mesafeyi mikrometre cinsinden girin.
10. Analizi başlatmak için, Go For It tuşuna basın.
    NOT: Yazılım, hücreler 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve propidium iyodür (CZI seçenekleri sekmesi) ile boyandığında hücre canlılığını da ölçebilir, ancak bu RPE flatmount'lar için geçerli değildir.

Şekil 1: REShAPE grafik kullanıcı arabirimi. GUI, çalışma dizinlerini seçmek (Dizinler sekmesi), segmentasyon seçeneklerini değiştirmek (NN Segmentasyon Seçenekleri ve Döşenmiş Görüntü Seçenekleri sekmeleri), analiz parametrelerini belirtmek (Analiz ve Otomatik Birim Dönüştürme sekmeleri için Hücre Boyutu Kısıtlamaları) ve ısı haritası oluşturma (Çıktı Grafikleri Seçenekleri sekmesi) için farklı sekmelere sahiptir. Kısaltma: GUI = grafik kullanıcı arayüzü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Bu protokol, doğru tanımlanmış her RPE hücresi için hücre konumunun ve 30 şekil metriğinin ölçüldüğü düz montajın tek düzlemli bir görüntüsüyle sonuçlanır (Şekil 2). Giriş dizininin içinde otomatik olarak "İşlenmiş" adlı bir klasör oluşturulur. Bu klasör, "Analiz", "Renk Kodlu", "Birleşik Dosyalar" ve "Bölümlere Ayrılmış Görüntüler" adlı dört alt dizin ve analiz sırasında oluşturulan bazı geçici dosyalar içerir. "Birleşik Dosyalar" klasörü, tüm şekil ölçümlerini içeren bir elektronik tablo ve birleştirilen tüm dosyaların hücre komşu sayımlarının sıklıklarını içeren bir elektronik tablo içerir. "Analiz" klasörü, tüm şekil ölçümlerini içeren bir elektronik tablo ve her görüntü için ayrı ayrı hücre komşusunun sayımlarının sıklıklarını içeren bir elektronik tablo içerir. "Segmente Edilmiş Görüntüler" dizini, RPE hücre sınırlarının son ikili maskelerini içerir; segmentasyonun kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. "Renk Kodlu" dizini, her görüntüdeki şekil desenlerini görselleştirmek için her şekil ölçümü için ısı haritaları içerir. Şekil metriği tanımları ve kısaltmaları Tablo 1'de bulunabilir.

Bazen RPE flatmounts, özellikle optik sinirin etrafında, temiz bir şekilde çıkarılmamış artık retina parçaları içerebilir. Numunenin falloidin boyanması, retinadan gelen güçlü bir sinyalle sonuçlanır ve bu, RPE hücre sınırı segmentasyonu için sorunlara neden olabilir. Bazı fayanslar tamamen siyah görünürken, çevredeki fayanslar normal segmentasyon gösterecektir. Görüntüde bulunabilecek diğer parlak nesneler de siyah karoların oluşmasına neden olacaktır (Şekil 3). Bu gibi durumlarda, Arti Filtresi açılır menüsünde bulunan filtreleme seçeneklerinden birini (Zayıf, Normal, Güçlü) seçmek siyah karoların oluşmasını önleyecektir.

REShAPE, 8 bit veya 16 bit gri tonlamalı görüntüleri giriş olarak alır, ancak RGB görüntüleri almaz. REShAPE analizi için RGB görüntülerin kullanılması tamamen siyah ikili görüntüler üretecektir. Bu durumda, RGB görüntülerin gri tonlamaya dönüştürülmesi doğru şekilde bölümlere ayrılmış ikili görüntüler üretecektir (Şekil 4). RPE sınırlarının doğru tanınmadığı bazı durumlarda, örneğin, boyama optimal değilse veya numune bir çizik nedeniyle hasar görmüşse (Şekil 5A), büyük hücre kümeleri tek bir çok büyük hücre olarak tanımlanabilir (Şekil 5B). Bu durumda, hücre boyutu eşiği azaltılarak büyük nesneler analizin dışında bırakılabilir (Şekil 5C). Bu, Üst Hücre Boyutu metin kutusuna daha düşük bir değer eklenerek elde edilebilir. Ancak bu, ısı haritasının aralığında bir değişikliğe neden olacaktır. Bir araştırmacı bunu yapmayı seçerse, Manuel Sınırları Kullan? özelliğindeki Evet kutusunu işaretleyerek orijinal ısı haritası aralığını (Şekil 5D) korumak da mümkündür. Daha sonra, araştırmacı Sınırları Ayarla düğmesine sol tıklamalı ve manuel sınırları belirtmek için metin kutularına istenen değerleri eklemelidir.

Şekil 2: Tüm insan RPE monokatmanının tam morfometrik analizi. (A) Tüm insan RPE / koroid flatmount'un (macenta: falloidin) düşük büyütmeli bir görünümü. (B) Falloidin boyalı RPE hücrelerinin yakınlaştırılmış görünümü. (C) Tüm insan RPE/koroid düz montajı için RPE hücre sınırlarının REShAPE tarafından oluşturulan segmentasyonu ve (D) karşılık gelen yakınlaştırılmış görünüm. (E) Tüm insan düz montajındaki bireysel RPE hücrelerinin hücre alanını gösteren yazılım tarafından oluşturulmuş bir ısı haritası. Sol üst köşedeki termal ölçek, kullanılan değerlerin aralığını gösterir. (F) Alana göre renklendirilmiş tek tek RPE hücrelerini gösteren karşılık gelen yakınlaştırılmış görünüm. Ölçek çubukları = (B,D,F) 50 μm, (A,C,E) 5 mm. Kısaltma: RPE = retinal pigment epiteli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Parlak eserlerin filtrelenmesi. (A) Hücre sınırları (macenta: falloidin) için boyanmış bir insan RPE düz montajı, segmentasyona müdahale eden parlak alanlar (yeşil dikdörtgenler) sunabilir. (B) Tüm düz montajın RPE hücre sınırı segmentasyonu, parlak floresan bölgelerine karşılık gelen üç tamamen siyah karo (yeşil ok) içerir. (C,E) Siyah karolardan ikisi, muhtemelen bazı döküntüler olan parlak noktalar içeren alanlara karşılık gelir. (D) Siyah karolardan biri, optik sinirin etrafındaki doğru şekilde çıkarılmamış bir nöral retina parçası tarafından üretildi. Nöral retina parçaları RPE tabakasından önemli ölçüde daha parlaktır ve hücre segmentasyonunu engeller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Giriş görüntüsü gereksinimi. Hücre kenarlıkları için boyanan RPE hücreleri, REShAPE analizi için (A) RGB veya (B) gri tonlamalı 16 bit görüntüler olarak kaydedildi. (C) RBG görüntü analizinin çıktısı siyah bir ikili görüntüdür, (D) gri tonlamalı görüntünün analizi ise hücre kenarlıklarının doğru şekilde bölümlere ayrılmış bir ikilisini üretir. REShAPE yalnızca 8 bit veya 16 bit gri tonlamalı görüntüleri analiz edebilir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Suboptimal sonuçlar . (A) RPE tek katmanının bir kısmının faloidin ile boyanmış hücrelerin yanlışlıkla çizildiği bir görüntüsü. (B) Hücre alanının boyutuna göre renklendirilmiş RPE hücrelerinin ısı haritası. Büyük bir üst hücre boyutu eşiği, analizde büyük nesneler içerir. (C) Büyük nesneleri analizden dışlamak için daha küçük bir üst hücre boyutu eşiğinin seçildiği bir hücre alanı ısı haritası. (D) Daha küçük bir üst hücre boyutu eşiğinin seçildiği ve orijinal olarak kullanılan ısı haritası aralığını korumak için manuel sınırların ayarlandığı bir hücre alanı ısı haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: REShAPE parametreleri. Tablo, her parametrenin tanımını ve ham elektronik tablolarda ("_Data.csv" dosyaları) ve ısı haritalarında kullanılan kısaltmaları bildirir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

İnsan RPE ve retinalarının tutarlı ve verimli bir şekilde ayrılması bu protokol kullanılarak sağlanabilir. Bu yöntem, tüm insan retinalarında RPE şeklindeki bölgesel farklılıkların incelenmesine izin verir⁵. Protokoldeki önemli bir adım, RPE ve retinanın fiziksel olarak ayrılmasıdır. İki doku bazı bölgelerde tamamen ayrılmamışsa, retinayı hafifçe kaldırmalı ve dokuların kırılmamasını sağlamalıdır. Büyük düz montajların REShAPE analizi, önemli RAM kaynaklarına sahip sistemlerin kullanılmasını gerektirebilir. Bu durumda, tüm görüntünün yeniden montajı, yazılımın işlem kaynaklarının eksikliğine rağmen analizi başarıyla tamamlamasına izin vermek için devre dışı bırakılabilir.

İnsan RPE düz montajlarını segmentlere ayırmak için REShAPE kullanmanın ana sınırlaması, AI algoritmasının çoğunlukla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı RPE görüntüleri üzerinde eğitilmiş olmasıdır. Sonuç olarak, insan RPE flatmount'larının segmentasyonu daha az doğrudur. Yaşlı donörlerden elde edilen RPE hücreleri çok miktarda lipofuscin⁷ içerir ve otofloresansının geniş spektrumu hücre sınır segmentasyonuna müdahale eder. Gelecekte, bu tür bir örnekte hücre sınırı segmentasyonunu iyileştirmek için RPE düz montajlarının daha fazla görüntüsü kullanılacaktır. Bu sınırlamaya rağmen, REShAPE, RPE hücre sınırlarını tanımak ve segmentlere ayırmak için özel olarak eğitilmiştir ve RPE hücrelerinin Voronoi⁸ ve CellProfiler⁹ segmentasyonu gibi diğer mevcut yöntemlerden daha iyi performans gösterir.

Ayrıca, manuel segmentasyon 10 ile karşılaştırıldığında, REShAPE büyük görüntüleri hızlı bir şekilde analiz etme avantajı sağlar (~ 130.000 piksel x^130.000 piksel test edilmiştir). Sonuç olarak, bu diseksiyon yöntemi yüksek oranda tekrarlanabilir ve diğer hayvan modellerine kolayca genişletilebilir. Ek olarak, yazılım, belirli tedavilerin etkisini incelemek için göz düzlüklerinde veya hücre kültürü modellerinde RPE şeklini incelemek için kullanılabilir. Son olarak, REShAPE'nin çok yönlülüğü, diğer epitel hücrelerinin analizi için geniş çapta uygulanabilir olmasını sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biopsy punch 1.5 mm	Acuderm Inc.	P1525
Bovine albumin	MP Biomedicals	160069
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness	Brain Research Laboratories	5075-1.5D
Curved spatula	Katena	K3-6600
D-Mannitol	Sigma	M9546
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+	Gibco	14040-133
Fine Scissors	Fine Science Tools	14558-11
Fluormount-G	Southern Biotech	0100-01
Forceps - Dumont #5	Fine Science Tools	11252-23
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm	Brain Research Laboratories	5075
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic	Becton Dickinson (BD)	305167
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic	Becton Dickinson (BD)	305136
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Petri dish 100 mm	Corning	430167
Phalloidin-iFluor 647	Abcam	ab176759
Razor blades	PAL (Personna)	62-0177
Round bottom tubes 50 mL	Newegg	9SIA4SR9M88854
Silicon Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	4019862
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm)	Sigma	W2876
Surgical Vitrectomy System	BD Visitrec	585100	optional
Syringe 1 mL	Becton Dickinson (BD)	309659
Triton X-100	Sigma	T9284
TrueBlack	Biotium	23007	autofluorescence quencher
Tween 20	Affymetrix	20605
Vannas Spring Scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-10