Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi

Özet

Adipositlerde trigliserit lipoliz, serbest yağ asitlerinin ve gliserolün serbest bırakılmasıyla sonuçlanan önemli bir metabolik süreçtir. Burada, adipositlerde bazal ve uyarılmış lipolizi ve farelerden ex vivo yağ dokusunu ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Adipositler, lipit damlacıklarında trigliseritler şeklinde enerji depolar. Bu enerji, yağ asidi yan zincirlerinin gliserol omurgasından sırayla ayrıldığı ve serbest yağ asitlerinin ve gliserolün salınmasına neden olan lipoliz yoluyla harekete geçirilebilir. Beyaz adipositlerde gliserol kinazın düşük ekspresyonu nedeniyle, gliserol geri alım oranları ihmal edilebilirken, yağ asidi geri alımı, albümin gibi medya bileşenlerinin yağ asidi bağlama kapasitesi tarafından belirlenir. Hem gliserol hem de yağ asidinin ortama salınımı, lipolitik oranı belirlemek için kolorimetrik testlerle ölçülebilir. Bu faktörleri birden fazla zaman noktasında ölçerek, lipolizin doğrusal oranını yüksek güvenle belirleyebilirsiniz. Burada, farelerden in vitro diferansiye adipositlerin ve ex vivo yağ dokusunun lipoliz ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol ayrıca diğer preadiposit hücre hatları veya diğer organizmalardan yağ dokusu için optimize edilebilir; Dikkat edilmesi gereken noktalar ve optimizasyon parametreleri ele alınmıştır. Bu protokol, fare modelleri ve tedavileri arasındaki adiposit lipoliz oranını belirlemede ve karşılaştırmada yararlı olacak şekilde tasarlanmıştır.

Giriş

Fazla besinler, lipit damlacıklarının nötr lipit çekirdeğinde trigliseritler şeklinde beyaz yağ dokusunda depolanır. Trigliserit depoları, yağ asidi yan zincirlerinin yağ dokusu trigliserit lipaz (ATGL), hormona duyarlı lipaz (HSL) ve monogliserit lipaz (MGL) tarafından sırayla bölündüğü ve serbest yağ asitlerinin (FFA'lar) ve gliserol omurgasının ^1,2 salınımına neden olan bir süreç olan lipoliz yoluyla mobilize edilir. Lipoliz, yağ dokusunda katekolamin sinyalizasyonu ile aktive edilir. Sempatik sinir terminalleri, adiposit plazma zarındaki β-adrenerjik reseptörlere bağlanan katekolaminleri lokal ola....

Protokol

Tüm hayvanların kullanımı, Cornell Üniversitesi Weill Cornell Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Tamponların ve toplama plakalarının hazırlanması

1. 5 g BSA'yı 100 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içinde fenol kırmızısı olmadan çözerek% 5 sığır serum albümini (BSA) yapın. BSA'yı çözünmesi için hafifçe karıştırın (sallamak verimsizdir). BSA tamamen çözündükten sonra, ortamı 0,2 μm filtre ile filtreleyerek sterilize edin. BSA ortamını 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. Kontrol ve stimülasyon ortamının çalışma konsantrasyonlarını yapın....

Sonuçlar

İn vitro diferansiye adipositlerin bazal ve uyarılmış lipolitik oranlarını ölçtük. Kasık beyaz yağ dokusundan primer preadipositler, 5 μM deksametazon, 0.5 mM IBMX, 1 μg / mL insülin ve 1 μM troglitazon ile 4 gün boyunca konfluent hücrelerin tedavisi ile adipositlere farklılaştırıldı ve ardından 1 μg / mL insülin ile 3 günlük ek bir tedavi uygulandı. Hücreler lipoliz tahlilinden önce 24 saat boyunca insülinsülsüz ortamda inkübe edildi. Zaman = 0h'de, hücreler bir kez PBS ile y?.......

Tartışmalar

Burada, adipositlerde ve ex vivo yağ dokusunda lipoliz oranını ölçmek için temel bir protokol sunuyoruz. Lipolizi ölçmek için, doğrusal fazda lipolitik hızı ölçmek önemlidir. Ortamın büyük bir kısmının toplandığı ve düzenli aralıklarla taze ortamlarla değiştirildiği seri örnekleme tekniği kullanıyoruz. Bu yarı konservatif yöntem, FFA tamponlama kapasitesine sahip taze BSA'nın eklenmesine izin verir ve lineer lipoliz süresini uzatarak geri besleme inhibisyonunu geciktirir. Bu d.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work