Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

Resumo

A lipólise de triglicerídeos em adipócitos é um importante processo metabólico que resulta na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para medir a lipólise basal e estimulada em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos.

Resumo

Os adipócitos armazenam energia na forma de triglicerídeos em gotículas lipídicas. Essa energia pode ser mobilizada via lipólise, onde as cadeias laterais dos ácidos graxos são sequencialmente clivadas da espinha dorsal do glicerol, resultando na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Devido à baixa expressão de glicerol quinase em adipócitos brancos, as taxas de recaptação de glicerol são desprezíveis, enquanto a recaptação de ácidos graxos é ditada pela capacidade de ligação de ácidos graxos de componentes do meio, como a albumina. Tanto a liberação de glicerol quanto de ácidos graxos em meios pode ser quantificada por ensaios colorimétricos para determinar a taxa lipolítica. Medindo esses fatores em vários momentos, pode-se determinar a taxa linear de lipólise com alta confiança. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a mensuração da lipólise em adipócitos diferenciados in vitro e tecido adiposo ex vivo de camundongos. Este protocolo também pode ser otimizado para outras linhagens celulares de pré-adipócitos ou tecido adiposo de outros organismos; considerações e parâmetros de otimização são discutidos. Este protocolo foi projetado para ser útil na determinação e comparação da taxa de lipólise de adipócitos entre modelos e tratamentos em camundongos.

Introdução

Os nutrientes em excesso são armazenados no tecido adiposo branco na forma de triglicerídeos no núcleo lipídico neutro das gotículas lipídicas. Os estoques de triglicérides são mobilizados via lipólise, processo pelo qual as cadeias laterais de ácidos graxos são sequencialmente clivadas por lipase triglicérides do tecido adiposo (ATGL), lipase hormônio-sensível (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL), resultando na liberação de ácidos graxos livres (AGL) e da espinha dorsal do glicerol ^1,2. A lipólise é ativada pela sinalização de catecolaminas no tecido adiposo. Os terminais nervosos simpáticos liberam localmente catecolaminas, que se ligam aos receptores β-adrenérgicos na membrana plasmática dos adipócitos. Após a ligação do ligante, esses receptores acoplados à proteína G (GPCRs) ativam a adenilil ciclase via G_αs. A ativação subsequente da proteína quinase A (PKA) pelo AMPc resulta na regulação positiva tanto da ATGL quanto da HSL. A fosforilação da perilipina-1 pela PKA causa a dissociação da ABHD5 (também conhecida como CGI-58), que se liga e coativa a ATGL³. O PKA fosforila diretamente a HSL, promovendo sua translocação do citosol para a gota lipídica, onde a interação com a perilipina-1 fosforilada promove ainda mais sua atividade lipase 4,5,6,7. A terceira lipase envolvida na lipólise, a MGL, parece não ser regulada pela sinalização das catecolaminas⁸. É importante ressaltar que a síntese de triglicérides em adipócitos é mediada pela via de síntese lipídica do glicerol, que não envolve a formação de monoglicerídeos como intermediário; em vez disso, as glicerol-3-fosfato acilo transferases catalisam a formação de ácido lisofosfatídico, que é combinado com outro acil-CoA graxo para formar ácido fosfatídico e, em seguida, isomerizado em diglicerídeos antes da síntese final de triglicérides (Figura 1)9,10,11.

Figura 1: Vias de lipólise e síntese lipídica do glicerol. Topo: Via lipolítica; enzimas mostradas em vermelho: lipase triglicerídica do tecido adiposo (ATGL), lipase sensível ao hormônio (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL). Fundo: via de síntese lipídica do glicerol; enzimas mostradas em verde: diglicerídeos aciltransferase (DGAT), fosfatase do ácido fosfatídico (PAP), ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAT, também conhecido como LPAATs) e glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT). Lipídios: triglicerídeos (TG), diglicerídeos (DG), monoglicerídeos (MG), ácidos graxos livres (AGL), acil-CoA graxo (FA-CoA), ácido lisofosfatídico (LPA) e ácido fosfatídico (AP). Outros metabólitos: fosfato inorgânico (Pi) e glicerol 3-fosfato (G3P). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A adenosina extracelular é outro importante regulador da lipólise, atuando através de GPCRs acoplados a G_s e G_i para impactar a atividade da adenil ciclase. O receptor de adenosina predominante nos adipócitos, ADORA1, inibe a adenilil ciclase e, assim, a lipólise através da ativação de G_i¹². Expressa em níveis mais baixos, e principalmente em adipócitos marrons, a ADORA2A ativa a lipólise via sinalização_{de G s} ¹³. ADORA1 afeta tanto a lipólise basal quanto a resposta aos agonistas adrenérgicos. O efeito da adenosina na lipólise pode ser controlado pela adição de adenosina desaminase para neutralizar a adenosina, assim como o agonista específico ADORA1 fenilisopropiladenosina^14,15. A ativação hormonal de GPCRs acopladas a G_q também pode afetar a lipólise via ativação da fosfolipase C e da proteína quinase C^16,17,18,19. Sinais inflamatórios também afetam as taxas lipolíticas. A ativação de TLR4 pelo LPS (e outras endotoxinas) aumenta a taxa lipolítica pela ativação da ERK, que fosforila perilipina-1 e HSL²⁰. O TNF-α também ativa a lipólise via ativação de ERK e NF-κB, bem como downregulation transcricional da fosfodiesterase PDE-3B e CIDEC^21,22,23. A IL-6 também tem sido associada ao aumento da lipólise dos adipócitos, especialmente no tecido adiposo mesentérico, cuja liberação de AGL afeta a esteatose hepática e a gliconeogênese^24,25,26.

A lipólise é suprimida durante o estado alimentado pela insulina. AKT fosforila e ativa PDE-3B para suprimir a sinalização de AMPc e impedir a ativação de PKA²⁷. A insulina também diminui transcricionalmente a ATGL²⁸. A obesidade promove resistência às catecolaminas através de uma variedade de mecanismos, incluindo a diminuição da regulação dos receptores β-adrenérgicos nos adipócitos 29,30,31,32,33. Os adipócitos expressam os três receptores β-adrenérgicos (β-1, β-2 e β-3). Enquanto os receptores adrenérgicos β-1 e β-2 são expressos de forma ubíqua, o receptor adrenérgico β-3 é predominantemente expresso em adipócitos de camundongos^34,35. A expressão de Adrb3 é induzida por C/EBPα durante a adipogênese³⁶. O receptor adrenérgico β-3 é altamente expresso em adipócitos maduros. A ativação dos receptores adrenérgicos β-1 e β-2 é autolimitada devido à inibição por feedback pela β-arrestina³⁷. A inibição por feedback do receptor adrenérgico β-3 é mediada por outras vias de sinalização, que reduzem^{a expressão de} Adrb33,38,39.

Numerosos compostos podem ser usados para ativar a lipólise dos adipócitos. As catecolaminas são os principais ativadores fisiológicos da lipólise. A noradrenalina (ou noradrenalina) e a epinefrina (ou adrenalina) ativam os três receptores β-adrenérgicos⁴⁰. A noradrenalina e a adrenalina também afetam a lipólise via ativação da sinalização dos receptores α-adrenérgicos⁴¹. Os agonistas dos receptores β-adrenérgicos comumente usados incluem o isoproterenol, que é um agonista não seletivo dos receptores β-adrenérgicos, e os agonistas dos receptores adrenérgicos β-3 CL-316,243 e mirabegron⁴². Como os adipócitos expressam predominantemente o receptor adrenérgico β-3, utilizamos a CL-316,243 como exemplo. Sua especificidade para o receptor adrenérgico β-3 também o torna um ativador relativamente específico da sinalização de catecolaminas de adipócitos, que também pode ser usado com segurança in vivo. Note-se que a concentração comumente usada de 10 μM CL-316,243 em cultura celular é ordens de magnitude maior do que a dose de ~0,1 μM necessária para atingir uma resposta máxima³³. Forskolin contorna o receptor adrenérgico, ativando diretamente adenilil ciclase e sinalização lipolítica a jusante. Existem muito mais ativadores, bem como supressores de lipólise. Ao selecionar um composto para estimular a lipólise, a especificidade do receptor e as vias de sinalização a jusante devem ser cuidadosamente consideradas dentro do planejamento experimental.

A taxa de lipólise no tecido adiposo branco é um importante fator metabólico que afeta a tolerância ao frio e a disponibilidade de nutrientes durante o jejum ou exercício^43,44,45,46. O objetivo deste protocolo é medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo, o que facilitará o entendimento do metabolismo dos adipócitos e como ele pode afetar o fenótipo metabólico de vários modelos murinos. Para quantificar a taxa lipolítica, medimos a aparência dos produtos lipolíticos na mídia (i.e., AGL e glicerol). O método baseia-se na liberação de produtos lipolíticos do adipócito para o meio. Como os adipócitos brancos expressam baixos níveis de glicerol quinase, as taxas de recaptação do glicerol são baixas⁴⁷. Por outro lado, a produção de AGL e glicerol por outras vias metabólicas que não a lipólise também deve ser considerada. Os adipócitos parecem expressar uma fosfatase com atividade contra o glicerol-3 fosfato, possibilitando a produção de glicerol a partir do glicerol-3-fosfato derivado da glicose^48,49,50. A glicólise é uma fonte de glicerol-3-fosfato usado para reesterificação de AGL em adipócitos brancos. Quando os níveis de glicose são limitados, a gliceroneogênese requer outras fontes de carbono 3, como lactato e piruvato⁵¹. A canalização dos AGL liberados pela lipólise dentro da célula e seu destino metabólico é pouco compreendido; Os AGL liberados pela lipólise devem ser convertidos em acil-CoA graxo, antes de serem reesterificados ou submetidos à β-oxidação. Parece que os AGL liberados pela lipólise provavelmente saem da célula antes de serem retomados e convertidos em acil-CoA gorduroso 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Os AGL podem ser sequestrados fora da célula pela albumina. É importante ressaltar que os AGL de cadeia longa são conhecidos por inibir a lipólise se não forem sequestrados pela albumina 63,64,65,66,67. Assim, a otimização da capacidade tampão dos AGL do meio durante o ensaio de lipólise é fundamental. O procedimento aqui descrito é semelhante aos métodos publicados anteriormente para medir a taxa lipolítica em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos e humanos 15,68,69,70,71. Esse protocolo difere pelo uso de amostragem seriada; Ao realizar amostragens seriadas, podemos validar internamente que a lipólise está sendo medida na fase linear e utilizar múltiplas medidas para calcular a taxa de lipólise, reduzindo assim o erro de medição para aumentar a confiança no valor final calculado. A desvantagem da amostragem seriada é que o ensaio requer mais tempo e reagentes; no entanto, o prazo mais longo reduz o impacto do erro de medição no erro padrão das estimativas da taxa. Além disso, esse protocolo mede tanto a liberação de AGL quanto a de glicerol e considera a relação AGL:liberação de glicerol com o objetivo de atingir uma relação de 3:1, como seria esperado a partir da lipólise completa e liberação de produtos lipolíticos na mídia⁷².

Protocolo

O uso de todos os animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Weill Cornell Medical College da Cornell University.

1. Preparação de tampões e placas coletoras

1. Produzir albumina de soro bovino (BSA) a 5% dissolvendo 5 g de BSA em 100 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sem vermelho de fenol. Mexa suavemente o BSA para dissolver (agitar é contraproducente). Uma vez que a BSA esteja totalmente dissolvida, filtre-esterilize o meio com um filtro de 0,2 μm. Conservar o suporte BSA a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
2. Fazer concentrações de trabalho de meios de controle e estimulação. Meios de controle: 5% de mídia BSA com controle veicular. Meio de estimulação: meio BSA 5% com CL-316,243 μM 0,5 μM. Faça novos meios de estimulação para cada experimento.
3. Aquecer o meio a ser utilizado a 37 °C. Rotule uma placa de 96 poços para coleta de mídia.

2. Preparo da amostra

1. Realizar cultura celular conforme descrito abaixo. Realize todo o trabalho celular em uma capela de fumaça estéril para minimizar a contaminação externa.
   1. Isolar e diferenciar pré-adipócitos primários, como em^73,74.
      1. Pré-adipócitos primários em placa de alta densidade, como 1 x 10⁵ células/poço em placa de 24 poços em meio de cultura de 1 mL/poço (15% de soro fetal bovino (SFB) e 1x penicilina-estreptomicina-glutamina em DMEM/F12).
      2. Após as células atingirem 100% de confluência, diferenciar com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de tiazolidinediona (TZD) em meios de cultura por 3 dias. Em seguida, mude para o meio de cultura com 1 μg/mL de insulina por pelo menos 3 dias para crescer gotículas lipídicas. Utilizar 1 mL/poço de meio na placa de 24 poços.
      3. Troque o meio de cultura (1 ml/poço) com insulina a cada 2 ou 3 dias. As células podem ser mantidas em meio com insulina por até 2 semanas. Use apenas culturas em que as taxas de diferenciação são superiores a 90% e são semelhantes entre os grupos para este ensaio, pois a diferenciação reduzida pode ser mal interpretada como uma redução na taxa lipolítica.
      4. Cultivar as células em meio livre de insulina por 24 h antes da dosagem da lipólise.
         NOTA: A insulina na mídia mantém as gotículas lipídicas, mas também inibe a lipólise. A incubação sem insulina por 24 h permite a ativação lipolítica completa sem perda do volume lipídico das gotículas. Em alguns sistemas, o tempo de cultura sem insulina pode precisar ser encurtado ou prolongado.
   2. Lavar as células com DPBS uma vez para remover o soro residual dos meios de cultura.
      NOTA: Este protocolo não inclui a inanição de soro, que pode ativar a lipólise. A inanição de soro pode ser empregada a critério do pesquisador.
2. Realizar cultura ex vivo conforme descrito abaixo.
   1. Prepare uma placa de 6 poços, com um poço para cada tecido a ser coletado de cada camundongo. Colocar 4 mL de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado.
      NOTA: BSA na mídia de coleta não é necessário.
   2. Preparar uma placa de 48 poços para o ensaio de lipólise, com um orifício para cada repetição. Colocar 400 μL de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado. Utilizar dois a quatro poços controle e dois a quatro poços estimulados por tecido por camundongo.
   3. Eutanásia do camundongo por luxação cervical sob anestesia, com um método secundário como pneumotórax bilateral. Utilizou-se um camundongo fêmea C57BL/6J, com 32 g de 7 meses de idade, alimentado com dieta hiperlipídica a 45% por 4 meses.
      NOTA: Este protocolo também pode ser usado para o sexo masculino, bem como outras cepas, dietas e idades.
   4. Borrifar com etanol a 70% e usar tesoura para fazer uma pequena incisão lateral (~ 1 cm) no centro da pele abdominal, afastar a pele apertando cada lado com polegar e indicador e dobrar a pele abdominal inferior para revelar os depósitos subcutâneos posteriores. Localizar e remover o linfonodo inguinal e dissecar o tecido adiposo inguinal imediatamente posterior ao linfonodo inguinal usando pinças.
   5. Para coletar o tecido adiposo gonadal, fazer uma incisão lateral e uma vertical no peritônio para acessar a cavidade peritoneal. Segure o coxim gorduroso gonadal com uma pinça e corte ao longo do útero (ou epidídimo para os machos) para remover o tecido adiposo gonadal. Coloque os depósitos coletados em um prato de 6 poços.
   6. Retire bem o tecido, coloque em um tapete de silicone e corte em pedaços de 5 a 7 mg com tesoura.
   7. Pesar 25 a 30 mg (cinco ou seis pedaços) para cada ensaio bem e colocar em uma placa de ensaio de 48 poços. Coloque o tecido em uma toalha limpa antes de pesar para remover qualquer meio. Pesar o barco de peso após a remoção do tecido e registrar o peso de qualquer resíduo deixado para trás. Limpe o barco de peso entre as amostras e re-tar, se necessário. Use um novo barco de peso para cada tecido.
   8. Depois de pesadas todas as amostras de tecido, colocar a placa de ensaio de 48 poços em uma incubadora de 37 °C e 10% de CO₂ por 15 minutos.

3. Ensaio de lipólise

1. Executar coleta de mídia. Realizar a transferência do meio e posterior coleta de amostras em um exaustor de fumaça estéril para minimizar a contaminação potencial de fontes externas.
   1. Em t = 0, remova o meio e adicione 400 μL por poço de controle ou meio de estimulação e coloque a placa em uma incubadora de 37 °C e 10% de CO₂ . Para cultura de tecidos ex vivo , remover cuidadosamente o meio usando uma pipeta; A sucção nunca deve ser usada.
      NOTA: Alternativamente, prepare uma segunda placa com meios de controle e estimulação, e transfira os tecidos.
   2. Em t = 1, 2, 3 e 4 h, coletar 200 μL de meio, substituir por 200 μL do meio de controle ou estimulação apropriado e retornar a placa de ensaio à incubadora. Conservar a placa de recolha a 4 °C. Para determinar a capacidade de tamponamento FFA da mídia BSA, use uma coleta adicional em 24 h.
      NOTA: Os experimentos podem ser interrompidos aqui, e o meio coletado pode ser armazenado a -20 °C.

4. Ensaio colorimétrico de AGL

1. Aqueça os reagentes à temperatura ambiente e dissolva um frasco de reagente de cor A com um frasco de solvente A e um frasco de reagente de cor B com um frasco de solvente B. A partir da data de reconstituição, esses reagentes são melhor utilizados dentro de 1 semana. Descarte 1 mês após a reconstituição.
2. Descongele e misture as amostras.
3. Crie uma curva padrão FFA. A solução padrão é de 1 mM. Use o seguinte volume com os reagentes para a curva padrão: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (diluição 1:2), 10 μL (diluição 1:4), 10 μL (diluição 1:8) e 10 μL de água para a faixa máxima. Para baixos níveis de AGL, 10 μL de 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0,05 mM podem ser mais aplicáveis.
4. Pipetar padrões e amostras em uma placa de ensaio de 96 poços. O volume de amostra recomendado é de 10 μL. Inclua três poços com o mesmo volume de meio BSA que as amostras para correção de fundo.
   NOTA: Se as concentrações da amostra se situarem fora do intervalo da curva padrão, repetir o ensaio, ajustando o volume da amostra para 2-25 μL.
5. Adicionar 150 μL de reagente A a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.
6. Leia a absorbância da placa a 550 nm e 660 nm de referência (Leitura A).
7. Adicionar 75 μL de reagente B a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.
8. Leia novamente a absorbância da placa a 550 nm e 660 nm de referência (Leitura B).

5. Ensaio colorimétrico de glicerol

1. Reconstituir o reagente glicerol livre com 36 mL de água ultrapura e aclimatar-se à temperatura ambiente. Esses reagentes são melhor usados dentro de algumas semanas. Descarte 2 meses após a reconstituição.
2. Descongele e misture as amostras.
3. Crie uma curva padrão de glicerol fazendo uma diluição em série de sete pontos e 2 vezes da solução padrão de glicerol e um branco de água.
   NOTA: A curva padrão é relativamente linear até 25 μL de glicerol 2,8 mM, mas não linear em concentrações mais elevadas.
4. Pipetar 25 μL cada um do padrão e amostras para a placa de ensaio de 96 poços. Inclua três poços com a mídia BSA para correção de fundo.
5. Adicionar 175 μL de reagente de glicerol livre a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.
6. Leia a absorbância da placa a 540 nm.

6. Cálculo da taxa lipolítica

1. Comece com valores de densidade óptica (OD). Para glicerol, use A₅₄₀ OD valores diretamente. Calcular o DO do ensaio de AGL de acordo com a seguinte fórmula:
   OD = (Leitura B: A 550 - A 660) - (Leitura A: A₅₅₀ - A₆₆₀)
2. Utilizar a curva padrão para calcular os níveis de AGL e glicerol nas amostras coletadas. Plotar os valores padrão OD no eixo y e, no eixo x, usar concentrações padrão em relação ao volume da amostra (ou seja, a concentração dos poços com 20 μL do padrão FFA 1 mM em uma placa com amostras de 10 μL é igual a 2 mM). Ajuste uma linha de tendência linear:
   y = mx + b
3. Inspecione visualmente a curva padrão e remova quaisquer pontos fora da faixa linear do ensaio. Calcule as concentrações das amostras utilizando a equação:
   Concentração da amostra: x = (OD - b) ÷ m
4. Ajustar e reensaiar amostras que estejam fora do intervalo de ensaio linear. Para obter a concentração final da amostra, subtraia a concentração dos poços de fundo contendo apenas meios BSA da concentração das amostras.
5. Calcular os moles de AGL e glicerol produzidos por cada amostra em cada ponto de tempo, de acordo com a fórmula:
   
   onde C n = concentração no tempo t = n; V_t = volume total no poço; V_s = volume de coleta da amostra; e M, n = moles produzidos no tempo t = n (quando as concentrações estão em mM e os volumes estão em mL, o débito é μMol).
   Por exemplo, em vários momentos:
   M 1 = C₁ × V_t
   M 4 = C₄ × V_t + (C₁ + C₂+ C₃)V_s
   ou
   M 4 = C₄ × V_t + C₃ × V s + C₂ × V s + C₁ ×V _s
6. Normalizar para o peso do tecido dividindo pelo peso do tecido para cada amostra em gramas para obter unidades de μmol/g. Para células cultivadas, os valores são apresentados como μmol/poço. Certifique-se de que o número de células e a eficiência da diferenciação sejam comparáveis de poço para poço.
   NOTA: Diferenças na eficiência de proliferação ou diferenciação complicarão a interpretação dos resultados e exigirão outro método de normalização (por exemplo, normalização para proteína; ver discussão).
7. Calcular a inclinação do μmol/g produzido (eixo y) versus o tempo (eixo x) para cada amostra individualmente.
   1. Em uma planilha, isso pode ser feito usando a função =SLOPE(known_ys,known_xs). Em uma nova célula, digite "=SLOPE" (em seguida, use o cursor para realçar os valores de glicerol ou FFA da amostra em μmol/g e, em seguida, para realçar os valores de tempo correspondentes).
   2. Verifique a linearidade dos dados. Os valores de R² são uma maneira rápida de determinar a linearidade das amostras. Em uma planilha, isso pode ser feito usando a função =RSQ(known_ys,known_xs), da mesma maneira descrita na etapa 6.7.1, mas a entrada inicial é =RSQ. Certifique-se de que os valores de R² estejam > 0,98; valores mais baixos indicam desvio da linearidade. Isso pode resultar de um erro de medição/amostragem ou perda de linearidade.
      1. Outra forma de testar a linearidade é realizar uma regressão linear para cada amostra e plotar os resíduos. Em um software de análise estatística, gere uma tabela XY com um único valor Y para cada ponto de tempo. Selecione Analisar > regressão linear simples e selecione a caixa para Gráfico residual antes de pressionar OK. O gráfico residual aparecerá como um novo gráfico.
8. Use o FFA e a taxa de produção de glicerol (ou seja, inclinação [(μmol/g/h]) para cada amostra como um ponto de dados individual para realizar análise estatística e plotar valores se diferentes condições lipolíticas estiverem sendo comparadas. Se as taxas lipolíticas estiverem sendo comparadas entre genótipos, use duas ou três amostras por animal como réplicas técnicas e use a média para um ponto de dados por animal, de modo que o tamanho da amostra seja igual ao número de animais.

Resultados

Medimos a taxa lipolítica basal e estimulada de adipócitos diferenciados in vitro. Os pré-adipócitos primários do tecido adiposo branco inguinal foram diferenciados em adipócitos pelo tratamento de células confluentes com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de IBMX, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de troglitazona por 4 dias, seguidos por um tratamento adicional de 3 dias com 1 μg/mL de insulina. As células foram incubadas em meio sem insulina por 24 h antes do ensaio de lipólise. No tempo = 0h, as células fora...

Discussão

Aqui, fornecemos um protocolo básico para medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo ex vivo . Para quantificar a lipólise, é importante medir a taxa lipolítica na fase linear. Usamos uma técnica de amostragem seriada, onde uma grande fração de meios é coletada e substituída por meios frescos em intervalos regulares. Este método semiconservador permite a adição de BSA fresco com capacidade tamponante de AGL e retarda a inibição do feedback, estendendo a duração da lipólise linear....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work