Name: laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
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Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

1. Micropipeta Produção <ol><li> micropipeta Injection <ol><li> Coloque um capilar de vidro de borossilicato (diâmetro externo (OD): 1,0 mm, diâmetro interior (ID): 0,75 mm) num puxador de micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo. </li><li> Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa seringueiro. (Exemplo: Calor: 825; Pull: 30; Velocidade: 120; Tempo: 200; Pressão: 500). </li><li> Remova cuidadosamente as pipetas puxados a partir do dispositivo e colocá-lo em um microforge em uma posição horizontal. </li><li> Traga a pipeta puxado e o filamento aquecedor microforge com a sua conta de vidro em foco. Utilizar o retículo ocular para medir a espessura desejada e mover a pipeta horizontalmente até que o filamento de aquecimento atinge o diâmetro interno alvo (5 uM). </li><li> Ajustar a aquecer a cerca de 45% e suavemente trazer a pipeta para baixo de modo que toque o filamento. Ativar o aquecedor brevemente. este wderreter doente ligeiramente a pipeta de modo que adere ao filamento e depois do arrefecimento, a pipeta vai quebrar no ponto de contacto gerar um corte a direito. Nota: Definir a temperatura apropriada é fundamental neste passo desde que as temperaturas demasiado elevadas fará com que a curva da pipeta e, portanto, um corte rectilíneo não será possível e temperaturas muito baixas, não será suficiente para derreter a pipeta (Figura 1A). </li><li> Fazer um ângulo de aproximadamente 30 ° perto da ponta da pipeta, posicionando-o a cerca de 10 uM de distância a partir do filamento de aquecimento. Ajustar a temperatura para 60% e activar o aquecedor. Nota: Este irá dobrar a pipeta sobre o filamento. Este ângulo é desejada para que a ponta da agulha é paralela à superfície da placa de injecção, quando montado no injector (Figura 1B). </li><li> Lidar com pipetas de microinjeção com cuidado, pois eles são extremamente afiada e frágil. </li></ol></li><li> segurando micropipeta <ol><li> Coloque um borosiliccomeu capilar de vidro (OD: 1,0 mm ID: 0,75 mm) em um extrator micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo. </li><li> Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa, mesmo cone e paredes paralelas (Exemplo: Calor: 815; Pull: 20; Velocidade: 140; Time: 175; Pressão: 200). </li><li> Remova cuidadosamente a pipeta puxado a partir do dispositivo extrator e colocá-lo no porta-microforge em uma posição horizontal. Ajuste o foco no filamento aquecedor e pipeta. </li><li> Utilizar o retículo ocular para medir o diâmetro da pipeta e mover a pipeta até que o seu diâmetro ao longo do filamento alcança de 180 um. </li><li> No tamanho indicado, marcar o capilar de vidro, com uma caneta de ponta de diamante, em seguida, pressione suavemente na ponta puxou para quebrar o vidro. Isso deve resultar em um corte reto (Figura 1C). </li><li> Mover a pipeta para uma posição vertical, com a sua ponta estreita para o filamento. Regule a temperatura<html> do microforge a 60%. </li><li> Fire-polonês a ponta da pipeta usando técnicas padrão 7 até que esta atinja um ID de 40 uM. Use o retículo ocular para verificar o ID (Figura 1D). </li><li> Faça um ângulo na pipeta. <ol><li> Traga a pipeta de volta para uma posição horizontal cerca de 10 um para longe do filamento e 5 mm de distância da sua ponta. Ajustar a temperatura para cerca de 60% e activar o aquecedor para dobrar a pipeta sobre o filamento. Continuar o aquecimento, até um ângulo desejado (de cerca de 30 °) é alcançado. Verifique o ângulo visual (Figura 1E). Nota: A pipeta é normalmente montado à microinjector com um ângulo aproximado de 60 ° em relação ao fundo do prato por injecção. A ponta da pipeta é dobrada de modo que é paralela à parte inferior do prato, que é necessário para a correcta injecção do embrião no seu plano médio. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. Setup Micromanipulator <ol><li> Verifique se as microinjetores são totalmente carregado com óleo e que não há bolhas de ar no sistema (bolhas no microinjetor impedir que o controle fino da injecção). </li><li> Verifique se os micromanipuladores estão na posição central. Isto irá permitir a uma ampla gama de movimento das pipetas. </li><li> Insira a pipeta segurando no suporte micromanipulador da esquerda e da pipeta de injeção no suporte micromanipulação direita. </li><li> Deixe o óleo entrar nas pipetas por capilaridade e verificar se o sistema está funcionando corretamente, movendo óleo cima e para baixo dentro da pipeta usando os controles microinjetor. Nota: Se não houver nenhuma circulação do óleo dentro das agulhas, pode haver uma obstrução. Neste caso, usar uma agulha nova. </li><li> Use os controlos micromaniplador para trazer as pipetas para o centro do campo do microscópio de vista. Usando uma ampliação de 4X, verifique se as dicas micropipeta estão no ângulo correto (parallel para a parte inferior do prato). Nota: Uma configuração correcta das agulhas é a chave para uma injecção de sucesso e resultados para a consistência. </li><li> Calibrar o sistema de laser seguindo o manual de calibração do fabricante. </li></ol> 3. Preparação do prato de injecção (Figura 2) <ol><li> Coloque uma gota de 50 ul de aquecido (37 ° C) SOF-HEPES (composição detalhado na secção de materiais) suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS) no centro da tampa de uma placa de petri de 100 mm. Coloque um 1 - 2 ul gota da solução a ser injectada próximo da gota injecção. Certifique-se de que os embriões não arrefecer abaixo RT. Nota: Neste protocolo, irá adicionar o corante Dextran-Vermelho para a solução de injecção para ser capaz de visualizar o local da injecção e segui-lo mais tarde. </li><li> Cobrir as gotas na placa de injecção, utilizando aproximadamente 10 ml de óleo mineral. </li><li> Colocar o prato de injecção na fase do microscópio invertido e trazer o PIPEttes na gota injecção. Verifique se as agulhas estão no foco dentro da gota. Ajustar a sua altura conforme necessário usando os controles micromaniplador. </li><li> Usando uma micro-distribuidor, carregar cerca de 20 - 30 zigotos (17-20 horas pós-fertilização (HPF)) no lado superior da gota injecção. Realizar a injecção à temperatura ambiente de modo que o número de embriões na queda de injecção é determinada pela velocidade à qual a pessoa pode injectar-los. Não carregue mais embriões do que os que podem ser injetadas em 30 min. <ol><li> Para carregar os embriões em no micro, pressionar o êmbolo totalmente e mergulhe a ponta na solução contendo os embriões. Tocam os embriões para ser apanhada com a ponta do capilar de vidro (um de cada vez) e liberam lentamente o êmbolo de modo que cada embrião entra no capilar. Repita este procedimento até todos os embriões são apanhados ou a capacidade de micro-distribuidor está cheio. </li><li> Para liberar os embriões carregados, pressionar o êmbolo suavemente até que todo o volume de containing os embriões é liberado do capilar. </li></ol></li></ol> 4. microinjeção <ol><li> Usando o objectivo 4X, carregar a solução a ser injectada para a pipeta de injecção por aplicação de pressão negativa (aspiração). Coloque solução suficiente para injetar 2 - 3 zigotos. Em seguida, passar para a queda de injeção. </li><li> Dentro da gota injeção, mover a pipeta segurando para que a ponta fica perto de um zigoto. Aplique pressão negativa (aspirado) com o microinjetor exploração de modo que o zigoto fica fixo para a pipeta holding e mudança para um objetivo 20X. </li><li> Uma vez que o zigoto está ligado à pipeta de exploração, verificar a sua qualidade utilizando a pipeta de injeção para mover suavemente o embrião ao redor sem separá-la. A qualidade zigoto bom deve ter os dois corpos polares (embora, por vezes, apenas um é visto) e um citoplasma homogêneo. Não injectar zigotos anormais (Figura 3A). </li><li> Se necessário, reposicionar o embrião para uma injecção adequadalocalização. Um bom posicionamento seria aquele em que existe um espaço entre a ZP e o PM, de modo que o PM não seja danificada pelo laser. </li><li> Verificar que a pipeta de injecção está posicionado no plano médio do embrião tocando suavemente o zigoto no local da injecção. Se ele não está no seu plano médio, a agulha irá tendem a fazer rodar o embrião em vez de punção. Ajustar a altura da pipeta de injecção conforme necessário. </li><li> Fazer um buraco na ZP usando um laser (Figura 3B). <ol><li> Utilizando software lugar do laser, a retícula de laser na ZP onde o furo vai ser feita (no lado oposto ao onde o embrião está ligado à pipeta de exploração). Usando a janela, clique em controle de laser sobre o botão de fogo. Certifique-se de que o tamanho do orifício é suficientemente grande para criar uma abertura no ZP para a agulha para passar através sem danificar o PM (Exemplo: 0,662 ms de largura de impulso / 6,9 uM O tamanho do orifício). </li></ol></li><li> Passe a agulha de injeçãoatravés do orifício na ZP e fazer contato com a PM. Continue a empurrar a pipeta para a frente até que a agulha é ¾ da forma para o embrião (Figura 3C). </li><li> Observar a posição do menisco na interfase solução de óleo, tal como este será utilizado para controlar o volume de injecção consistente. </li><li> Aplicar pressão negativa (aspiração) na pipeta de injecção, o que irá resultar em PM e citoplasma sendo aspirado para a agulha de injecção. Continuar até que o movimento do citoplasma para dentro da agulha ou acelera quando o conteúdo citoplasma misturando-se com uma solução de injecção pode ser visto. Estes irão indicar a ruptura da PM (Figura 3D). </li><li> Injectar de volta o conteúdo citoplasmático seguido da solução para dentro do citoplasma do zigoto pela aplicação de pressão positiva (que se injectam), até que o menisco na interfase solução-óleo tem avançado diâmetro equivalente de um zigoto passado o ponto de partida. Nota: Nas nossas condições, este representa cerca de 7 pl de solução injectada (Figura 3E). </li><li> Mudar para um objectivo 4X e mover o injectado embrião / s para o lado de baixo da gota de injecção. Liberar o embrião através da aplicação de pressão positiva sobre o microinjetor exploração. Manter os embriões não injectados no lado superior e os injetados no lado inferior da queda para ajudar a manter o controle dos embriões injetados / não-injetado e trabalhar de forma eficiente. </li></ol> 5. Embrião de recuperação e Injeção Resultados <ol><li> Adicione 3 gotas de cerca de 200 ul numa nova placa com pré-aquecido SOF-HEPES. Recolher os embriões injectados utilizando uma micro-distribuidor (como descrito acima). Lavar os embriões injectados movendo-os através do SOF 3-HEPES gotas. </li><li> Conte os embriões lisadas durante a microinjeção e descartá-las. Nota: Um zigoto lisadas podem ser facilmente distinguidos a partir de um único intacta desde o primeiro aparece translúcido, preencher toda a ZP, e, geralmente, tem citoplasmáticateor de vazamento para o exterior do embrião. </li><li> Opcionalmente, verificar a eficiência microinjecção utilizando um microscópio de fluorescência. Esteja ciente de que a exposição à luz UV pode induzir danos embrião que pode afetar o desenvolvimento subsequente. </li><li> Grupos de cultura de 25 embriões injectados em 50 gotas ul de meio simplex optimização de potássio (KSOM) suplementado com 4 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em óleo mineral a 38,5 ° C, 5% CO 2 em ar, e humidade de saturação. </li><li> Suplementar o meio de cultura com 5% de FBS dois dias após a injecção. </li><li> Verifique blastocisto (BL) taxas de 7 dias após a injeção. Calcular as taxas de BL como o número total de embriões de blastocisto / número total de embriões cultivados em que a queda. </li></ol>

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	<li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle,+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida.">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta.">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li><li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development.">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li><li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR/Cas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes.">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li><li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos.">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li><li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+(iVF)+micro-pipettes.">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2015 P-97 &amp; P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , (2014).</li><li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of cloning. , (2002).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes.">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A microinjecção de zigotos é um método bem estabelecido para a introdução de soluções em embriões de mamíferos. Com algumas variações dependentes das espécies e o objectivo da experiência, esta técnica pode ser usado de forma ampla. Mostramos como executar microinjecção intracitoplasmática usando um laser para ajudar na entrada de uma micropipeta de extremidade romba. Os zigotos de algumas espécies animais (tais como gado bovino, ovelhas, e porcos) têm um citoplasma escuro, dificultando a visualizaç...

microinjecção citoplasmática de embriões de 1 célula é uma técnica muito potente. Ele pode ser usado para a entrega de qualquer solução para o embrião com, por exemplo, produzir gene knock-out para estudar a função do gene ou para gerar animais editado por genes. Zigotos de animais de exploração agrícola mais relevantes têm uma composição de ácidos graxos muito elevado que faz com que seu citoplasma opaco e escuro 1. Eles também têm uma membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características fazem microinjeção usando pronuclear injeção convencional / citoplasmática como usado em espécies de roedores desafiadoras e muitas vezes imprecisas. Microinjecção citoplasmática tem vantagens sobre microinjecção pronuclear, uma vez que é mais fácil de executar e também causa menos danos para os embriões injectados, resultando em maior viabilidade 2. O objetivo geral deste protocolo é demonstrar um método bem sucedido para a entrega de soluções para o citoplasma de zigotos de animais de exploração. Para ser capaz de realizarmicroinjecção citoplasmática com alta eficiência em embriões de gado, é usado um laser para gerar um furo na zona pelúcida (ZP) e então, uma agulha de extremidade romba de vidro é usado para a microinjecção. Esta estratégia visa reduzir os danos mecânicos impressa no embrião durante a injeção. Em seguida, o conteúdo citoplasmático de aspiração no interior da agulha de injecção permite a quebra eficiente e confiável do PM assegurar que a solução é fornecida para dentro do citoplasma do embrião. Esta técnica já sido utilizado com sucesso em embriões de bovinos para entregar siRNA para o citoplasma zigótica 3,4 e para gerar mutações que utilizam as repetições curtas em cluster regularmente interespaçadas palindrómicos (CRISPR) / CRISPR associada do sistema 9 de sistema (Cas9) 5. É igualmente apropriado (com pequenas modificações) para injetar bovina oócitos inclusos-cumulus 6. Aqui, descrevemos nosso protocolo de injeção de entregar um corante, que podem ser aplicáveis ​​a injeção de qualquer dessolução Ired no zigoto, e mostrar que usando esta técnica provoca lise mínima e não afeta o desenvolvimento embrionário precoce.

<table><tbody><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Equipped with 10X magnification lense.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Active laser.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.</td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>These dishes are used for culturing the embryos in 50 &amp;mu;l drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Any incubator that can be set to 38.5 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; conditions can be used.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.</td></tr><tr><td>Control Unit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Heated Microscope Stage</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Keep the mineral oil at room temperature and&amp;nbsp; protected from light using foil paper.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Use a stem-cell qualified FBS.</td></tr><tr><td>Zygotes</td><td></td><td></td><td>Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be &lt;em&gt;in-vitro&lt;/em&gt;- or &lt;em&gt;in-vivo&lt;/em&gt;-derived.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium DL-lactate</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>D-(&amp;minus;)-Fructose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Final concentration: 5 &amp;mu;g/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Water for embryo transfer</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES medium</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 &amp;plusmn; 10 mOs. Filter sterilized through a 22 &amp;mu;m filter can be stored in the fridge at 4 &amp;deg;C for 1 month. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr></tbody></table>

laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Microinjecção citoplasmática assistida por laser é um protocolo potente e fiável para fornecer soluções para o citoplasma de zigotos de gado. A Figura 3 mostra um esquema geral dos zigotos, antes e depois da injecção, bem como o contorno geral da técnica. Dextrano-vermelho é usado como injeção de solução para permitir site de rastreamento de injeção e injeção de eficiência e precisão. O sucesso da entrega a solução está ilustrada na Figura...

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Biologia do Desenvolvimento

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genética

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Entrega de gene lentiviral assistida por laser em óvulos fertilizados de camundongos

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Técnicas de Microinjeção de Zebrafish

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Education

JoVE Science Education

Biologia Básica

Biologia II: Camundongo, Zebrafish e Galinha

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Source: Martin, N. P., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58327">Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Entrega de genes lentivirais assistida por laser: uma técnica para permeabilizar óvulos fertilizados com camundongos para facilitar a entrega de genes lentivirais

Source: Martin, N. P., et al. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...