3D in vitro modeli hücresel ve hücre altı çözünürlükte karakterize etmek, tam kullanım için çok önemlidir, ancak zor olabilir. Bu nedenle, 100 mikrometreden birkaç milimetreye kadar değişen sabit 3D in vitro modellerin boyama ve hücre altı çözünürlüklü görüntülemesi için ücretsiz protokol sağladık. 3B yapılar radyaldir ve dikkatlice manipüle edilmelidir.
Pipetlemeden önce, herhangi bir aspirasyonu önlemek için tüp içindeki 3B yapılarınızın konumunu kontrol edin. Organoidler veya sferoidler gibi küçük yapıların gömülmesi için klasik teknikleri uyarladığımızdan, görselleştirilmiş talimatlar ilk kez kullanıcıların görevi daha kolay yerine getirmelerine yardımcı olabilir. Prosedürü benimle birlikte gösteren, Patoloji Araştırma Platformu'ndan bir laboratuvar teknolojisi olan Laura Scols olacak.
3D tam montaj boyama için numuneler hazırlamak üzere BSA ile önceden kodlanmış bir mililitrelik pipet ucu kullanarak 500 mikrolitrelik PBS tüpüne bir mililitrelik 3D yapı süspansiyonu ekleyin. 3D yapılar tüpün dibine yerleştiğinde, PBS'yi dakikada 30 ila 50 devirde yumuşak yatay ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için 500 mikrolitre geçirgenlik engelleme çözeltisi ile dikkatlice değiştirin. Kuluçkanın sonunda, 3D yapıları, yıkama başına üç dakika boyunca BSA ile desteklenmiş% 0.1 PBS'lik bir mililitrede iki kez dikkatlice yıkamadan önce 3D yapıların tekrar tortulanmasına izin verin.
Son yıkamadan sonra, 3D yapıları PBS'de 250 mikrolitre birincil antikor ile iki ila üç gün boyunca dört santigrat derecede hafif yatay ajitasyon ile etiketleyin. Kuluçkanın sonunda, numuneyi yıkama başına% 0.1 PBS BSA'lık bir mililitrede beş üç dakika ve iki 15 dakikalık yıkama ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, 3D yapıları, ışıktan korunan nazik yatay ajitasyon ile dört santigrat derecede 24 saat boyunca PBS'de 250 mikrolitre uygun ikincil antikor ile etiketleyin.
Ertesi gün, 3D yapıları, nazik yatay ajitasyonla dört santigrat derecede iki saatlik bir inkübasyon için uygun Hoechst 3342 konsantrasyonundan 250 mikrolitre ile etiketleyin. Kuluçkanın sonunda, 3D yapıları üç dakika boyunca beş kez ve 15 dakika boyunca iki kez, gösterildiği gibi yıkama başına bir mililitre PBS'de yıkayın. Son yıkamadan sonra, 3D yapıları 96 kuyucuklu siyah polistiren mikro plakaya aktarın ve kabarcıklardan kaçınarak yapılara nazikçe 200 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin.
Ardından, alüminyum folyo ile kaplı plakayı en az 48 saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Büyük 3B hücre kültürü modellerini gömmek için, BSA kaplamalı bir mililitrelik pipet ucu kullanarak 3B yapıları PTFE astarlı şişe kapağına sahip düz tabanlı cam bir tüpe dikkatlice aktarın. Yapılar yerleştikten sonra, PBS'yi oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için% 70 etanol ile dikkatlice değiştirin.
Kuluçka sonunda,% 70 etanol'ü bir mililitre kullanıma hazır eozin Y çözeltisi ile değiştirin. Tüpe hafifçe vurun ve yapıları en az 30 dakika boyunca lekeleyin. Kuluçka sonunda, yapıları yıkama başına bir mililitre% 100 etanol içinde üç ardışık 30 dakikalık yıkama ile dehidrate edin.
Son dehidrasyondan sonra, 3D yapıları, kimyasal bir başlık altında yıkama başına bir mililitre ksilen içinde üç ardışık 30 dakikalık yıkama ile temizleyin. Son ksilen daldırmasından sonra, beyaz bir mikroikiz doku kasetinin bir bölmesine bir parça ksilen batırılmış biyopsi pedi yerleştirin ve 3D yapıları pedin üzerine aktarmak için BSA kaplı iki mililitrelik plastik Pasteur pipet kullanın. 3D yapıları yerinde tutmak ve kaseti kapatmak için 3D yapıları başka bir ksilene batırılmış biyopsi pedi ile örtün.
Tüm numuneler aktarıldığında, kasetleri gece boyunca taze bir 65 santigrat derece parafin banyosuna yerleştirmeden önce kasetleri 30 dakika boyunca 65 santigrat derece parafin banyosuna yerleştirin. Ertesi sabah, numune başına bir 65 santigrat derece ısıtılmış gömme kalıbına sıvı parafin ekleyin ve her kalıba bir parafin gömülü numune yerleştirin. Tüm 3D yapılar diplere düşene kadar kalıpları nazikçe çalkalayın ve 3D yapıları her kalıbın merkezine yerleştirmek için 65 santigrat derece ısıtılmış ince forseps kullanın.
Parafin ince bir katı tabaka oluşturana kadar kalıbı soğutun ve 3D yapıyı yerine sabitleyin. Bir doku kaseti yerleştirin ve kalıbın üzerine sıcak parafin ekleyin. Parafin tamamen katılaştığında kalıbı çıkarın.
Küçük 3B hücre kültürü modellerini gömmek için, 3B yapıları yıkama başına bir mililitre TBS'de üç kez nazikçe yıkayın. Son yıkamadan sonra, yapılara dokunmadan mümkün olduğunca fazla TBS'yi çıkarın ve ticari bir parafin gömme kitinden iki damla reaktif ekleyin. Dokunarak hafifçe karıştırın ve jel katılaşana kadar iki damla reaktif ekleyin.
Jeli önceden monte edilmiş kasetin kuyusundan kitten aktarmak için ince forseps kullanın ve jel gömülü numuneyi, belirtildiği gibi bir duman davlumbazında 30 dakikalık artan etanol ve ksilen inkübasyonları ile dehidre edin. Son ksilen daldırmasından sonra, parafin gömülü numuneyi 65 santigrat derece ısıtılmış gömme kalıbının ortasına aktarmak için ince forseps kullanmadan önce kaseti gece boyunca 65 santigrat derece parafin banyosuna yerleştirin. Ardından, 3D yapıyı, büyük 3D hücre kültürü modelleri için gösterildiği gibi bir tane daha parafin tabakasıyla sabitleyin.
Üç boyutlu tam montaj boyama ve konfokal mikroskopi, 3D kültür modellerinin hücresel bileşimi ve uzamsal konumu hakkında 200 mikrona kadar derinlik alanına görsel bilgi sağlar. Bu protokolü kullanarak 3D yapılar için elde edilebilen yüksek çözünürlük, hücre sayısının ölçülmesi ve farklı hücre alt tipleri içindeki çeşitli hücre belirteçlerinin tespiti için hücresel ve hücre altı segmentasyon algoritmalarının uygulanmasına izin verir. 3D bütün montaj analizi, tüm yapılardan bağımsız olarak 200 mikron derinliğe kadar görselleştirilmiş hücrelere uygulanabilir.
Aksine, 2B bölüm analizi, herhangi bir boyuttaki hücrelere ilişkin içgörüler sağlayabilir.
