Bu protokol, malzeme bilgisi olan ve mikroskopi ile tamamen uyumlu yüzlerce organoidin büyümesi için tasarlanmış bir mikrodoku hücre kültürü çanağını göstermektedir. Tekniğimiz, uzun süreli görüntüleme ve uzun süreli hücre kültürü ile tamamen uyumlu, binlerce organoid üretilmesini verimli bir şekilde sağlar. Bu protokol, ilaç tarama boru hattı ve kanser araştırma alanları gibi biyomedikal uygulamalar için büyük ilgi görmektedir.
Bu protokolde sunulan tekniğin, laboratuvar prosedürleri ve optik mikroskopi konusunda tecrübesi olan herkes tarafından yapılan birkaç denemeden sonra ustalaşması kolaydır. Başlamak için, PDMS kalıbının küçük kısımlarını son cihaz için gereken boyuta kesin. Bunları dizinin XY yönlerine paralel olarak kesin.
Hazırlanan PDMS kalıp zarlarından birini düz PDMS bölümüne yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Daha sonra bir pipet kullanarak, kalıbın bir tarafına yaklaşık 0,1 ila 0,2 mililitre UV kürlenebilir yapıştırıcı ekleyin. 10X büyütmede ters çevrilmiş bir optik mikroskop kullanarak boşluğun içindeki sıvının ilerlemesini takip edin.
Yapıştırıcıyı iyileştirmek için UV ışığına maruz bırakın. Metin yazısında açıklandığı gibi UV kaynağının güç yoğunluğuna bağlı olarak maruz kalma süresini ayarlayın. Bir kenardaki fazla miktarda yapıştırıcıyı kullanarak, kürlenmiş yapıştırıcıyı düz PDMS substratı üzerinde parmağınızla hafifçe bastırarak tutun.
Bu arada, cımbız kullanarak, kalıbın bir köşesini tutulan aynı kenarın yanına sıkıştırın ve dokulu filmin kaldırılmamasını sağlarken kalıbı yavaşça soyun. Kürlenmiş, dokulu ve yapışkan tabakayı PDMS üzerinde düz bırakmak için fazla yapışkan ve PDMS substratını bir tıraş bıçağı kullanarak kesin ve fazla substrat yalnızca bir kenarda tutun. Hidrofilisitesini iyileştirmek için temiz bir kapak kaymasını kısa bir oksijen plazma işlemiyle tedavi edin.
Plazma aktivasyonundan sonra, kapak kaymasını standart bir spin kaplayıcının vakum mandren üzerine yerleştirerek ve kapak kapağının ortasına küçük bir damla yapıştırıcı dökerek ince UV kürlenebilir yapıştırıcı tabakasını spin kaplayın. Spin kaplama işlemini metin yazısında açıklandığı gibi çalıştırın. Spin kaplama kullanılamıyorsa, pipet kullanarak temiz bir kapak kapağına yaklaşık 0,1 mililitre UV kürlenebilir yapıştırıcı bırakın.
İkinci bir kapak kapağı alın ve sıvı yapıştırıcının iki kapak kapağı arasında eşit olarak yayılmasını sağlamak için birincisinin üzerine yerleştirin. Yapıştırıcı kapak kapaklarının kenarına ulaştığında, birbiri üzerine kaydırarak yavaşça ayırın. Ayrıldıktan sonra, her iki kapak kapağı da ince bir sıvı yapıştırıcı tabakası ile tamamen kaplanacaktır.
Spin kaplamasından sonra, yapıştırıcıyı UV'ye maruz bırakarak önceden kürleyin. Kullanılan UV kaynağının güç yoğunluğuna bağlı olarak maruz kalma süresini ayarlayın. Dokulu filmlerden birini alın ve yapışkan kaplı kapak kapağı ile temas ettirin. Kısmen kürlenmiş yapıştırıcı ile dokulu film arasındaki temasın mümkün olduğunca düzgün olduğundan emin olun.
Bu aşamada, kapak kayması üzerindeki yapıştırıcı, tekrar akmayı önleyecek kadar sağlam olmalıdır ve kontak, kapak kaymasına hafifçe bastırılarak optimize edilebilir. Kaplanmış yapışkan tabaka tamamen kürlenene kadar kapak kapaklarını UV ışığına maruz bırakın. Bu, dokulu filmi kapak kayması üzerinde kapatacak ve çevre boşlukları arasında sızdırmaz izolasyon sağlayacaktır.
Daha sonra cımbız kullanarak, PDMS'yi kırpmadan sonra fazla malzemenin bırakıldığı kenarda sıkıştırın ve PDMS düz substratını soyun. Bu adım, dokulu film tabakasının, hücre tohumlaması için üstte açık erişimli kapak kapağına yapışmasını sağlar. Hücre tohumlamadan önce, makalede açıklandığı gibi biyometrik kopolimer ile pasifleştirilmiş bir cihazda, 35 milimetre hücre kültürü Petri kaplarına bir mililitre steril PBS dağıtın.
Vakum odasını kullanarak kabı steril PBS ile 10 dakika boyunca gazdan arındırın, ardından tüm kabarcıkları çıkarmak için birkaç tur pipetleme yapın. PBS'yi steril kültür ortamı ile değiştirin ve plakayı bir hücre kültürü başlığı altında 30 dakika boyunca UV ışığıyla sterilize edin. Metin makalesinde açıklandığı gibi ilgilenilen hücreler için tripsinizasyon veya hücre süspansiyonu hazırlama önerilerini izleyerek bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
Önerilen hücre kültürü ortamında hücre konsantrasyonunu mililitre başına 500.000 hücreye sayın ve ayarlayın. PBS arabelleğini 35 milimetrelik hücre kültürü kabından çıkarın ve ardından ayarlanmış hücre süspansiyonunun bir mililitresini dağıtın. Hücre kültürü kabını 10 dakika boyunca hücre inkübatörüne geri yerleştirin.
Her çevre boşluğuna yaklaşık 80 ila 100 hücre girecektir. Yaklaşık 10 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre kültürü çanağını inkübatörden geri kazanın ve sıkışmamış hücreleri çıkarmak için hücresel süspansiyonu yavaşça aspire edin. Kültür kabına bir mililitre kültür ortamı ekleyin ve tekrar hücre inkübatörüne yerleştirin.
İsteğe bağlı olarak, organoidleri kuyucuklarda büyüdükten sonra almak için, dokulu yapışkan tabakayı cımbız kullanarak kesilmiş kenara sıkıştırın ve cam kapak kaymasından yavaşça soyun, ancak ortama batırılmış halde tutun. Biyometrik kopolimer konsantrasyonunun arttırılması, kaplama kalınlığını arttırdı. Hücre kültürü kaplarının gazdan tamamen arındırılması, çevre boşluklarında sıkışmış hava kabarcıklarını gidermek için gerekliydi.
Organoidler, kültürlemenin iki ve 15. günlerinden sonra oluştu. Dönen disk konfokal mikroskopi, organoidlerin temsili görüntülerini ve 3D rekonstrüksiyonunu gösterdi. Kültür tabağını hazırlarken, kalıp veya substrat yığınının montajına dikkat etmek ve dokulu film ile kapak kayması arasında iyi bir temas sağlamak önemlidir.
Mikro boşluklarımızın sağladığı kontrol ve malzeme kaybının olmaması, mikro yerçekiminin organoid homeostaz üzerindeki etkisini incelemek isteyen uzay biyolojisi araştırmacılarının dikkatini çekmiştir.
