Bu protokol, otomatik mikroskopi için uygun bir çok kuyu plakasının her bir kuyucuğunda birkaç yüz çok hücreli tümörlü sferoid üretmek için bir yöntem sağlar. Üretilen sferoid farklı boyut sınıflarına ayrılabilir ve hücre altı bilgi her hücreden çıkarılabilir. Teknik, doğrudan tarama ve RNA girişim çalışmalarında kullanılabilecek yeterli serum üretir.
ECM bodrum malzemesini, eksi 20 santigrat derecede tutulan önceden soğutulmuş uçları kullanarak soğuk fenol kırmızı serum serbest ortamda seyreltin. 15 mikrolitre ECM bodrum malzemesi ve orta boy solüsyonu 96 kuyucuklu bir görüntüleme plakasına yatırıyorum. Plakayı dört santigrat derecede 91 kez G'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın.
Plakayı 37 santigrat derecede 30 dakikadan fazla olmayan bir süre için kuluçkaya yatırın. Hücrelere geziler ve EDTA ekleyin. Kuluçka sonunda hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin, hücreleri% 10 FBS içeren tam bir ortamda askıya alırız.
Pipet, hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini, bir hemositometre sayma odasına yerleştirin. Odanın dört çeyreğindeki hücre sayısını sayın. Centra, hücreleri oda sıcaklığında dört dakika boyunca 135 kez G'de görüntüler.
Biri bu hücreler peletlenir, süpernatantı aspire eder ve mililitre başına altı hücreye 10 ila 10 konsantrasyon elde etmek için hücreleri fenol kırmızısı serbest tam bir ortamda yeniden askıya alır. Hücreleri fenol kırmızısı serbest tam bir ortamda seyreltin. Hücreleri, kuyu başına toplam 35 mikrolitre hacimde dairesel bir hareketle damla halinde görün.
Hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. 1.2 mikrolitre ECM bodrum malzemesinde, kuyu başına 23.8 mikrolitre fenol kırmızısı serbest tam ortama kadar, kuyu başına 60 mikrolitrelik bir son hacimle sonuçlanır. Hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, ortamı 100 mikrolitre taze fenol kırmızısı serbest tam ortam ile değiştirin. Sferoidler içeren 96 kuyucuklu plakayı konfokal yüksek içerikli bir tarama mikroskobuna yerleştirin. Kullanılan zeminleri uyarmak için uygun lazerleri seçin.
Çapraz konuşmayı önlemek için kanalları sırayla edinin, uygun hedefleri kullanarak sferoidleri görüntüleyin. Sferoidlerin morfolojisini analiz etmek için, sferoidleri floresan konjuge FLoid ve boyamaya göre bölümlere ayırın. Çekirdekleri altıgen üç, dört, iki boyamaya göre bölümlere ayırın.
Her hücrenin sitoplazmasını, hücre sitoplazmasında bulunan artık altıgen üç, üç, dört, iki leke ile bölümlere ayırın. Sferoidlerin hacim, yüzey alanı, sferisite ve sferoidleri başına çekirdek sayısı dahil olmak üzere farklı morfolojik özelliklerini hesaplayın. Ross, 75 metreküp mikrometreden küçük ve 900.000 metreküpten daha büyük olan sferoidleri çıkarmak için daha fazla görüntüye sahip.
Sferoidler içindeki tek bir hücreyi analiz etmek için, sferoidleri floresan konjuge sferoid boyamaya göre bölümlere ayırın. Çekirdekleri altıgen üç, dört, iki boyamaya göre bölümlere ayırın. Her hücrenin sitoplazmasını, hücre sitoplazmasında bulunan artık altıgen üç, üç, üç, dört, iki leke ile bölümlere ayırın.
Sekonder antikor boyamasına göre lizozomları segmentlere ayırın. Her bir sferoid içindeki hücrelerin, hücre başına lizozom sayısı, hücre hacmi ve hücre yüzey alanı dahil olmak üzere farklı morfolojik özelliklerini hesaplayın. Şekil, farklı konfokal düzlemlerdeki görüntüler de dahil olmak üzere üç farklı sferoid türüne genel bir bakış açısı göstermektedir.
Tüm sferoidlerin hacimsel bir görünümü de gösterilmiştir. Şekil pH segmentasyon işlemini gösterir, panel A tüm sferoidleri hacimsel bir görünümde gösterir. Panel B, tek bir sferoidin tüm hücreleri içindeki sitoplazmanın, çekirdeklerin ve lizozomların ayarlanmış segmentasyonunu görüntüler.
Sitoplazma ve çekirdekler altıgen üç, dört, iki boyamaya göre bölümlere ayrılır. Lizozomlar, anti laboratuvar bir antikor boyamasına dayanarak bölümlere ayrılır. C panelleri, B paneli ile aynı segmente edilmiş, ancak üç düz görünümde gösterilir.
Sferoidler düzeyinde çeşitli morfolojik ölçümler yapılabilir. Bu ölçümler, sferoidler başına çekirdek sayısının yanı sıra pH'ın bu Felicity, hacim ve yüzey alanının hesaplanmasını içerir. Üç küresel tipteki her hücrenin tipik hacmi.
Hücre başına lizozom sayısının yanı sıra bu şekilde gösterilmiştir. SP üretiminin başlangıcında ilk hücre oturma yoğunluğunu optimize etmek kritik bir adımdır. Şekil, çok fazla hücre eklemenin hala sferoidlerin oluşumuna izin verdiğini göstermektedir.
Bununla birlikte, bu, sferoidler için füzyona neden olabilir. Bu şekilde üretilen sferoidler transkriptomik ve proteomik analizlere tabi tutulabilir. Bu teknik, bu tür nano parçacıkların ilaç dağıtımının alımını nicel olarak analiz etmek ve sferoidlerdeki bireysel hücrelere toksisitelerini değerlendirmek için kullanılır.
