Protokol, bir fare modelinde IL-33 tayininden sonra pulmoner IMS'nin izolasyonunu ve adoptif transferini açıklamaktadır ve bu da idiyopatik pulmoner fibrozisin in vivo çalışmasını kolaylaştırabilir. Bu teknik, araştırmacıların IPF gelişiminde geleneksel sitokinler tarafından simüle edilen makrofajların işlevini keşfetmelerini sağlar. Başlamak için, klodronatlı lipozomların şişesini buzdolabından çıkarın.
Oda sıcaklığında 30 dakika ısınmasına izin verin ve düzgün bir karıştırma sağlamak için birkaç kez ters çevirin. Steril emme ucuna sahip bir pipet kullanarak 60 mikrolitre klodronat lipozomu aspire edin. Kontrol ve ilacı anestezi uygulanan farenin burun boşluğuna damla damla uygulayın.
Her damladan sonra, farenin ilacı tamamen soluduğundan ve eşit şekilde nefes aldığından emin olun. Alıcı farede alveoler makrofajların tükenmesinden sonra, anestezi uygulanan konakçı farenin derisini% 75 alkol ve iyot ile dezenfekte ederek başlayın. Cildi kesmek ve kardiyopulmoner dokuyu açığa çıkarmak için makas kullanın.
20 ayarlı bir iğne ile donatılmış bir şırıngada 10 mililitre PBS aspire edin ve iğnenin ucunu farenin sağ atriyumuna yerleştirin. Daha sonra farenin inferior vena kavasını cerrahi makasla kesin ve akciğer dokusu beyaza dönene kadar fareyi PBS ile dakikada 10 ila 20 mililitre sabit bir hızda manuel olarak perfüze edin. Ayrıca, akciğer dokusunu eksize edin ve bir kültür kabında buz gibi PBS'ye aktarın.
Akciğer dokusunu parçalara ayırın ve makrofajları izole etmek için% 1 kollajenaz A içeren 15 mililitre DMEM ortamı ekleyin, ardından 37 santigrat derece sallama masasında 30 dakika boyunca 100 RPM'de inkübe edin. Akciğer dokusu süspansiyonunu, ince hale getirmek için 10 mililitrelik bir şırıngadan yaklaşık 20 kez aspire edin. Süspansiyonu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.
Filtreyi 400 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, kırmızı kanı iki ila üç dakika boyunca buz üzerinde üç mililitre hücre lizis tamponu ile lize edin. Beş dakika boyunca 150 G'de santrifüj yapın ve hücre peletini 10 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın.
Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri 10 santimetrelik yapışkan bir hücre kültürü kabına tohumlayın ve akciğer interstisyel makrofajlarını bulaşıklara yapıştırmak için 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, süpernatant ve yüzen hücreleri aspire edin.
10 mililitre taze, eksiksiz kültür ortamı ekleyin ve sekiz saatten fazla veya bir gecede inkübe edin. İzole interstisyel makrofajları uyarmak için, harcanan kültür ortamını tam bir orta interlökinler 33 ile değiştirin. Ayrıca interlökinler 33 yerine PBS ekleyerek bir kontrol plakası hazırlayın.
Plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Pulmoner interstisyel makrofajları ayrıştırmak için, beş dakika boyunca bir mililitre% 0.25 tripsin ile tedavi edin. Daha sonra sindirimi söndürmek için üç mililitre taze kültür tam ortamı ekleyin ve pulmoner makrofajları toplamak için hücre süspansiyonunu santrifüj edin.
Hücreleri saydıktan sonra, PBS'deki hücreleri 50 mikrolitre başına beş kez 10 ila beşinci hücrelerin son konsantrasyonuna geri getirin. İnterstisyel makrofajların transferine başlamak için, anestezi altındaki alıcı farenin uzuvlarını tıbbi bantla dikey bir plakaya sabitleyin ve pamuklu çubukla farenin dilini yavaşça bir tarafa çekin. Entübasyon lambasını açtıktan sonra, dilin tabanına yakın olması gereken trakeayı görmek için farenin boğazına parlatın.
22 gauge entübasyon lambasını ve 0,4 milimetre çapındaki kılavuz telini kullanarak yerleşik iğne kanülünü trakeaya yerleştirin. Entübasyonu bitirmek için, kılavuz teli çıkarın ve kanülü fare trakeasına itin. Şimdi hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini, kanülün trakeaya girdiği görüldüğünde trakea yoluyla alıcı fareye enjekte edin.
24 saat sonra, idiyopatik pulmoner fibrozisi indüklemek için trakea yoluyla bleomisin uygulayın. Ayrıca kontrol grubuna eşit miktarda salin uygulayın. 21 gün sonra, fibroz için belirteçlerin ekspresyonunu ve Ashcroft skorlarını değerlendirerek pulmoner fibrozun ciddiyet derecesini belirleyin.
HE boyaması, interlökinlerin 33 uyarılmış makrofajların evlat edinilerek transferinin, akciğer dokusu yıkımının derecesini şiddetlendirdiğini ve bleomisin ile uyarılmış farelerde fibroblast agregasyonunu arttırdığını göstermiştir. Ashcroft skorundaki artış ayrıca pulmoner fibrozun derecesini de göstermektedir. Alıcı farenin akciğer dokularında alfa SMA ve fibronektinin mRNA'sının ekspresyon seviyeleri, evlat edinilen interlökinler içeren 33 uyarılmış interstisyel makrofajlar ve bleomisin ile tedavi edildi, BLM ile tedavi edilen vahşi tip farelerinkilere kıyasla daha yüksekti.
Kanüldeki hücre süspansiyonunun akciğer dokusuna tamamen girebilmesini sağlamak için bir milimetrelik bir şırınga ile akciğerlere hemen 500 mikrolitre hava girilmelidir.
