Yazarlar, UT Southwestern'den Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi ve Lacey Stearman'a, intratekal enjeksiyon için genç sıçanların yarattığı zorluğun verimli bir tartışması için teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Jaguar Gen Terapisi'nden (JLFK'ye) sağlanan fonlarla desteklendi.

Bu çalışma Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Sprague-Dawley cinsi sıçanlar (28-30 günlük, yaklaşık 90-135 g aralığında kitle, erkek ve dişiler) kullanıldı.
1. Vektörün hazırlanması
<ol><li>Prosedürün başında AAV9 vektörünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözün.</li>
	<li>Sıvının tamamının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için vektörü içeren mikrosantrifüj tüpünü kısa bir süre masa üstü bir santrifüjde santrifüjleyin.</li>
	<li>Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için mikrosantrifüj tüpünü hafifçe vurun.</li>
</ol>2. Kurtarma kafesinin hazırlanması
<ol><li>Elektrikli battaniyenin üzerine temiz bir kafes yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın), böylece kafesin sadece yarısı battaniyeyle temas eder.</li>
	<li>Battaniyenin sıcaklığını ~37 °C'ye ayarlayın.</li>
</ol>3. Cerrahi platformun hazırlanması
<ol><li>Bir izotermal pedi ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir mikrodalga veya su banyosunda 39 ° C'ye ısıtın, böylece içerik sıvı hale gelir.</li>
	<li>İzotermal pedi cerrahi platforma yerleştirin ve temiz bir emici tezgah pedi ile örtün.</li>
</ol>4. Hayvan hazırlama
<ol><li>Sıçanları şeffaf bir kutuda izofluran ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Anestezi indüksiyonuna %5 izofluran kullanarak başlayın ve %2'ye ulaşana kadar dakikada %1 azaltın. Hayvanı 3 dakika daha% 2'de tutun.</li>
	<li>Hayvanı tutan kutuyu bir davlumbazın üzerine getirin ve kutuyu açın. NOT: Bu, cerrahın anesteziye maruz kalmasını sınırlar.</li>
	<li>Elektrikli saç kesme makineleri kullanarak hayvanın arkasındaki tüyleri alın. NOT: Alternatif olarak, tüy dökücü krem veya manuel tıraş bıçağı ve tıraş kremi kullanılabilir.</li>
	<li>Hayvanı, burnu anestezi burun konisinde olacak şekilde cerrahi platforma yerleştirin. NOT: Kürk ameliyat bölgesinden çıkarılırken hayvan bilincini yeniden kazanmaya başlayabilir. Bu olursa, yukarıda anlatıldığı gibi tekrar uyuşturun.</li>
	<li>İşlem sırasında korneaların kurumasını önlemek için her göze kayganlaştırıcı göz merhemi sürün.</li>
	<li>Povidon-iyot ve izopropanol mendillerin üç alternatif uygulamasını kullanarak cerrahi alanı dezenfekte edin.</li>
	<li>Analjezik (ler) i deri altına enjekte edin. NOT: Buprenorfin genellikle her 12 saatte bir verilen 0.01-0.05 mg / kg'lık bir dozda kullanılır. Alternatif olarak, bu ilacın yavaş salınan bir formu, 72 saat boyunca yeterli ağrı kontrolü sağlamak için 1 mg / kg'da bir kez verilebilir. Ağrı yönetimi ile ilgili yönergeleri için kurumun IACUC'sine danışın.</li>
	<li>Lokal anestezi sağlamak için L2 ila L6 spinöz işlemlerinin üzerine deri altından 100 μL% 1 lidokain enjekte edin.</li>
	<li>Hayvanın altına bir rulo kağıt havlu veya 1,5 cm çapında bir tüp yerleştirin, sadece kalçalara kadar uzanın. Bu, omurganın esnemesine yardımcı olur ve iğneyi iki lamina arasına sokmayı kolaylaştırır.</li>
	<li>Hayvanın üzerine fenestre bir örtü yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve fenestrasyonu bel omurgası üzerinde ortalayın.</li>
</ol>5. Lomber omurganın açığa çıkarılması
<ol><li>Hayvanın pençelerinin her birini sıkıştırarak ve geri çekilme tepkisinin olmadığını arayarak anestezi derinliğini onaylayın.</li>
	<li># 11 neşter bıçağı kullanarak, L2'den L6'ya kadar orta hattan aşağı doğru deride yaklaşık 3 cm uzunluğunda bir kesi oluşturun.</li>
	<li>Kas ile cilt arasına steril kavisli bir çift cerrahi makas sokarak ve ardından uçları açarak cildi kastan gevşetin.</li>
	<li>L2-L5 spinöz süreçleri kaplayan fasyayı çıkarın.</li>
</ol>6. Şırınganın yüklenmesi
<ol><li>Vektörün 25-35 μL'sini (istenen dozu elde etmek için) steril bir mikrosantrifüj tüpünün kapağına pipetleyin.</li>
	<li>Tüm hacmi insülin şırıngasına çekin. NOT: Bu işlem sırasında hava çekmemeye özen gösteriniz.</li>
</ol>7. Enjeksiyonun yapılması
<ol><li>L5 ve L4 spinöz süreçlerini tanımlayın. NOT: L6 doğrudan iki iliak tepe arasında yer alır ve dikenli sürecinin, künt bir aletle sondalama yoluyla tanımlanması kolay olmalıdır. Cihaz daha sonra L5 ve L4 işlemlerinin sınırlarını bulmak için yavaşça arkaya doğru hareket ettirilebilir.</li>
	<li>Bir elinizi, başparmağınız hayvanın kuyruğuna ve bir bacağına nazikçe dayanacak şekilde yerleştirin. Şırıngayı sabitlemek için parmağınızı kullanın.</li>
	<li>Şırınganın iğnesini, L5 dikenli işlemin solunda olacak ve kaudal ucu ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırın. Şırıngayı, orta hattan yaklaşık 30° uzakta ve masanın düzleminden 30° yukarıda olacak şekilde konumlandırın. NOT: Yer işaretlerini daha iyi tanımlamak ve iğnenin ucunu konumlandırmak için cerrahi mikroskop kullanmak yardımcı olabilir.</li>
	<li>Şırınga iğnesini yaklaşık 8 mm ileri, L5 laminasının üstünden ve ardından L4 laminasının altından kemiğe vurulana kadar bel rezervuarına ilerletin. Doğru yerleştirme, bacak/kuyruk üzerinde duran başparmak tarafından görülebilen veya hissedilebilen bir bacak ve/veya kuyruk seğirmesine neden olacaktır. Seğirme yoksa, iğneyi çıkarın ve işlemi sol taraftan deneyin. Hala seğirme yoksa, prosedürü gerektiği gibi L4/L3 ve L3/L2 arasında tekrarlayın.</li>
	<li>Pistona yaklaşık 5 saniye boyunca yavaşça bastırın. NOT: Enjeksiyon sırasında bacakta veya kuyrukta seğirme olabilir.</li>
	<li>İğne geri çekildiğinde basıncın dengelenmesini sağlamak ve enjeksiyonun geri akışını en aza indirmek için pistona tamamen bastırdıktan sonra şırıngayı yaklaşık 30 saniye yerinde tutun.</li>
	<li>İğneyi yavaşça çıkarın.</li>
</ol>8. Kesinin kapatılması
<ol><li>Kesiğin kenarlarını yaklaşık olarak ölçün.</li>
	<li>Yaranın bir ucundan başlayarak, kesiyi kapatmak için 4-0 dikiş (Malzeme Tablosuna bakınız) veya cerrahi zımba kullanın.</li>
</ol>9. Kurtarma ve izleme
<ol><li>Hayvanı önceden ısıtılmış kafese yerleştirin.</li>
	<li>Hayvanı tamamen gezdirilene kadar en az 15 dakikada bir kontrol edin. NOT: Bu işlem 15 dakika ile 45 dakika arasında sürmelidir.</li>
	<li>Önümüzdeki üç gün boyunca, en az her gün sağlık kontrolleri yapın. Ameliyattan sonraki ilk 2 gün veya IACUC'un gerektirdiği şekilde analjezik sağlayın.</li>
	<li>Ameliyattan bir hafta sonra dikişleri veya zımbaları çıkarın.</li>
</ol>10. Takip prosedürü
NOT: Enjeksiyon tekniğinin doğruluğunu belirlemek için, yukarıda tarif edildiği gibi tripan mavisi boya enjekte edin ve ardından hayvanı hemen ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ve sonucu görselleştirmek için bir laminektomi yapın.
<ol><li>Hayvan anestezi altında kalırken, 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla öldürücü bir dozda pentobarbital uygulayarak ötenazi yapın.</li>
	<li>Solunum ve kardiyak aktivite durduğunda, ölümü sağlamak için göğüs boşluğunu açın. Cerrahi kesiyi sırttan boynuna kadar uzatın.</li>
	<li>Spinöz işlemlerin her iki tarafında omurgaya paralel kas içine 4 cm uzunluğunda bir kesi yapın ve işlemlere mümkün olduğunca yakın tutun.</li>
	<li>İnce forseps veya makas kullanarak, kasları dikenli süreçler arasından çıkarın.</li>
	<li>Bir rongeur kullanarak L6'dan alt torasik omurgaya kadar olan dikenli süreçleri çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Rongeurlara zarar verebileceğinden bükme hareketlerinden kaçının.</li>
	<li>Rongeur'un alt ucunu L5 laminanın altına yerleştirin ve omuriliğin üzerindeki kemiği birkaç "ısırık" alarak çıkarın. NOT: L6 dikenli işlemi geri çekmek, rongeur'un ucunu yerleştirmeyi kolaylaştırabilir. Omuriliğin zarar görmesini önlemek için özen gösterilmelidir.</li>
	<li>Laminektomiyi rostral olarak en az dört lamina genişletmeye devam edin. Laminaların iç yüzeyini, başarısız bir enjeksiyonu gösterebilecek boya belirtileri açısından inceleyin.</li>
</ol>

CNS Gen Tedavisi için Juvenil Sıçanlarda AAV9'un Lomber Delinme Verilmesi

<ol>
	<li>Wurster, C., Petri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+spinal+muscular+atrophy+research.">Progress in spinal muscular atrophy research.</a> Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+Novel+therapeutic+targets+and+drug+development.">Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development.</a> Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).</li><li>Larkin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+FDA-approved+gene+therapy+for+hemophilia.">First FDA-approved gene therapy for hemophilia.</a> JAMA. 329 (1), 14 (2023).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nadofaragene+firadenovec:+First+approval.">Nadofaragene firadenovec: First approval.</a> Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).</li><li>Taghian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safe+and+reliable+technique+for+CNS+delivery+of+AAV+vectors+in+the+cisterna+magna.">A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna.</a> Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).</li><li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+delivery+of+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+9+to+the+adult+rat+brain.">Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain.</a> Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).</li><li>Pellot, J. E., Jesus, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboccipital+puncture.+[Updated+2022+Jul+25].">Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25].</a> StatPearls [Internet]. , (2022).</li><li>Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+lysosomal+storage+in+brains+of+MPS+vii+mice+treated+by+intrathecal+administration+of+an+adeno-associated+virus+vector.">Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector.</a> Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).</li><li>De La Calle, J. L., Paino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+direct+lumbar+puncture+in+rats.">A procedure for direct lumbar puncture in rats.</a> Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).</li><li>O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lot-to-lot+variation+in+adeno-associated+virus+serotype+9+(AAV9)+preparations.">Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations.</a> Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).</li><li>Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9:+A+potential+blood-brain+barrier+buster.">AAV9: A potential blood-brain barrier buster.</a> Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).</li><li>Hudry, E., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+AAV+gene+transfer+to+the+nervous+system:+A+clinical+reality.">Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality.</a> Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).</li><li>Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins,+helper+dependence,+and+seroepidemiology+of+a+new+human+parvovirus.">Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus.</a> Virology. 134 (1), 64-71 (1984).</li><li>Schulz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+neutralizing+anti-aav+antibodies:+Detection+and+implications+for+rAAV-mediated+gene+therapy.">Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy.</a> Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).</li><li>Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+gene+delivery+and+evasion+of+anti-aav-neutralizing+antibodies+by+intrathecal+aav+administration+in+non-human+primates.">Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates.</a> Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).</li><li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+sma:+A+dose-response+study+in+mice+and+non-human+primates.">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li><li>Hinderer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intrathecal+routes+of+administration+for+adeno-associated+viral+vectors+in+large+animals.">Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals.</a> Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).</li><li>Wang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+leakage+and+headache+after+lumbar+puncture:+A+prospective+non-invasive+imaging+study.">Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study.</a> Brain. 138, 1492-1498 (2015).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-induced+dorsal+root+ganglion+pathology).">Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology).</a> Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).</li><li>Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+development+in+rodents+and+humans:+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species.">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+adeno-associated+virus+serotypes+and+delivery+methods+for+cardiac+gene+transfer.">Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).</li></ol>

Dr. Donsante, AAV9 vektörlerinin BOS uygulamasıyla ilgili bekleyen bir patentin mucididir.

Çok çeşitli hastalıklar CNS'yi etkiler. Viral bir vektör aracılığıyla ilgili genin fonksiyonel bir kopyasını sağlamak, spinal müsküler atrofi gibi doğası gereği resesif ve monogenik olanlar için çekici bir tedavi stratejisidir. Bununla birlikte, kan-beyin bariyeri (BBB), intravenöz olarak verilen gen terapisi vektörlerinin çoğunu dışlar11. AAV9 gibi BBB'yi geçebilenler, periferik transdüksiyon12'ye bağlı vektör kaybının üstesinden gelmek iç...

Viral aracılı gen terapilerinin vaadi, son yıllarda spinal müsküler atrofi, retinal distrofi, faktör IX hemofili, kanser ve daha fazlası için tedavilerin FDA onayı ile nihayet gerçekleşmiştir 1,2,3,4. Sayısız başka terapötik şu anda geliştirilme aşamasındadır. Gen terapisi, bir hastanın hücrelerine terapötik bir gen iletmeyi amaçlar. Bu yeni genin ürünleri, eksik bir endojen genden eksik aktivitenin yerini alabilir, toksik bir geni inhibe edebilir, kanserli hücreleri öldürebilir veya başka bir yararlı işlev sağlayabilir.
Merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen hastalıklar için, gen terapisi vektörünün doğrudan hedef dokuya verilmesi genellikle arzu edilir. Sistemik olmayan yaklaşımlar iki fayda sağlar: periferik transdüksiyonun neden olabileceği hedef dışı yan etkileri en aza indirirler ve hedef dokuda yeterli transdüksiyon seviyelerine ulaşmak için gereken vektör miktarını büyük ölçüde azaltırlar5.
Gen terapisi vektörlerini CNS'ye iletmek için çeşitli yaklaşımlar vardır. Bir vektörün doğrudan omuriliğe veya beyin dokusuna enjekte edilmesi olan intraparankimal enjeksiyon, tanımlanmış bir bölgeye vermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, birçok hastalık için, CNS'nin geniş transdüksiyonu arzu edilir. Bu, beyin ve omurilik içinde ve çevresinde akan sıvı olan beyin omurilik sıvısına (BOS)5 bir vektör verilerek gerçekleştirilebilir. Vektörleri CSF'ye iletmenin üç ana yolu vardır. En invaziv yaklaşım, kafatasından bir çapak deliği açmayı ve beyinden lateral ventriküllere bir iğne ilerletmeyi içeren intraserebroventriküler doğumdur. Bu, beyin boyunca transdüksiyon sağlar. Bununla birlikte, prosedür intrakraniyal kanamaya neden olabilir ve yaklaşım genellikle omuriliğin sadece sınırlı transdüksiyonunu sağlar6. Kafatasının tabanındaki cisterna magna'ya enjeksiyon daha az invazivdir, ancak beyin sapına zarar verme riski taşır. Hayvan araştırmalarında sıklıkla kullanılsada5, cisterna magna'ya enjeksiyon artık klinikte rutin olarak kullanılmamaktadır7. Lomber ponksiyon, BOS'a erişmek için en az invaziv yaklaşımdır. Bu, iki bel omuru arasına ve bel sarnıcına bir iğne yerleştirilmesini içerir.
Vektör iletimi için lomber ponksiyon, yetişkin sıçanlarda ve farelerde ve yenidoğan farelerde rutin olarak gerçekleştirilir 8,9. Bu çalışmanın yazarları yakın zamanda adeno ilişkili virüs serotip 9 (AAV9) vektörleri sağlamak için genç sıçanlarda (28-30 günlük) lomber ponksiyonlar gerçekleştirdiler. Yetişkin sıçanlarda, L3 ve L4 omurları9 arasına dikey olarak bir neonatal lomber ponksiyon iğnesi yerleştirildi. Doğru yerleştirme, bir kuyruk hareketi ve BOS'un iğne haznesine akmasına neden olur. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu okumaların hiçbiri elde edilemedi. Yazarlar daha sonra L5 ve L610 arasında bir açıyla yerleştirilmiş 27 G'lik bir insülin şırıngası kullanarak yetişkin bir fare prosedürünü uyarlamaya çalıştılar. Tipik olarak P28 sıçanlarından daha küçük olan yetişkin farelerde, bu bir kuyruk hareketine neden olmaz, ancak yanlış iğne yerleşimi, enjeksiyonun geri akışı ile belirgindir. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu yaklaşım, muhtemelen yetişkin fareler ile omuriliği çevreleyen doku katmanlarının genç sıçanları arasındaki farklı elastikiyetten kaynaklanan, enjekte edilen enklavatın epidural olarak verilmesine eşit şekilde yol açmıştır. Daha sonra kateter yaklaşımları değerlendirildi. Spesifik olarak, lomber sarnıcın durasında ve orta torasik omuriliğe kadar bir kesiden bir kateter sokuldu; Bununla birlikte, bu yaklaşım, enjeksiyon sırasında enjeksiyonun insizyon bölgesinden önemli ölçüde geri akışına yol açmıştır. Kateteri bir kılavuz iğne kullanarak perkütan olarak intratekal boşluğa yerleştirme girişimleri de başarısız oldu. İnterlaminar genişliğin darlığı nedeniyle, kateter muhtemelen rostral laminaya çarpacak ve ilerleymeyecektir.
Burada, juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon yoluyla başarılı ve tekrarlanabilir solüsyon iletimi elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım viral vektörler için ve muhtemelen hücreler, farmasötikler ve diğer terapötikler için de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-200RK-FL</td>
			<td>Pipetting virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-GFP</td>
			<td>Vector Builder</td>
			<td>P200624-1005ynr</td>
			<td>AAV9 vector expressing GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>J422H</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braintree Scientific Isothermal Pads, 8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-195-4664</td>
			<td>Maintains body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1013922</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-ER (1 mg/mL)</td>
			<td>Zoopharma</td>
			<td></td>
			<td>Extended-release analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-365-409</td>
			<td>Blood removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape, Mouse, Clear Plastic, 12&#34; x 12&#34;, with Adhesive Fenestration</td>
			<td>Steris</td>
			<td>1212CPSTF</td>
			<td>Surgical drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Blanket</td>
			<td>CVS Health</td>
			<td></td>
			<td>CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20&#8211;200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>Pipetting virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>Curved surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td>Needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>328431</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>803250</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-031-350</td>
			<td>Skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine, 1%</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>239935</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Loading the syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-118-0481</td>
			<td>Skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td>Scalpel blade holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-17</td>
			<td>Anesthesia box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4-111</td>
			<td>#11 Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection

Gen terapisi, işlevsel bir geni tanıtmak, toksik bir geni etkisiz hale getirmek veya ürünü hastalığın biyolojisini modüle edebilen bir gen sağlamak için olsun, hastalığın tedavisi için bir hastaya yeni genler sağlamak için güçlü bir teknolojidir. Terapötik vektör için uygulama yöntemi, sistemik uygulama için intravenöz infüzyondan hedef dokuya doğrudan enjeksiyona kadar birçok şekilde olabilir. Nörodejeneratif bozukluklar için, transdüksiyonun beyne ve / veya omuriliğe doğru çarpıtılması genellikle arzu edilir. Tüm merkezi sinir sistemini hedeflemek için en az invaziv yaklaşım, beyin omurilik sıvısına (BOS) enjeksiyonu içerir ve terapötiğin merkezi sinir sisteminin büyük bir kısmına ulaşmasını sağlar. Bir vektörü BOS'a iletmek için en güvenli yaklaşım, omuriliğin bel sarnıcına bir iğnenin sokulduğu lomber intratekal enjeksiyondur. Lomber ponksiyon olarak da bilinen bu teknik, yenidoğan ve yetişkin kemirgenlerde ve büyük hayvan modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik, türler ve gelişim aşamaları arasında benzer olsa da, intratekal boşluğu çevreleyen dokuların boyut, yapı ve elastikiyetindeki ince farklılıklar, yaklaşımda konaklama gerektirir. Bu makale, adeno ilişkili bir serotip 9 vektörü sağlamak için juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon gerçekleştirme yöntemini açıklamaktadır. Burada lomber rezervuara 25-35 μL vektör enjekte edildi ve her enjeksiyondan elde edilen transdüksiyon profilini değerlendirmek için yeşil floresan protein (GFP) raportörü kullanıldı. Bu yaklaşımın yararları ve zorlukları tartışılmaktadır.

The promise of viral-mediated gene therapies has finally been realized in recent years with the FDA approval of treatments for spinal muscular atrophy, retinal dystrophy, factor IX hemophilia, cancer, and more1,2,3,4. Countless other therapeutics are currently in development. Gene therapy aims to deliver a therapeutic gene to a patient&#39;s cells. The products of this new gene can replace the missing activity from a deficient endogenous gene, inhibit a toxic gene, kill cancerous cells, or provide some other beneficial function.
For diseases affecting the central nervous system (CNS), delivering the gene therapy vector directly to the target tissue is often desirable. Non-systemic approaches provide two benefits: they minimize off-target side effects that may be caused by peripheral transduction, and they greatly reduce the amount of vector needed to achieve adequate levels of transduction in the target tissue5.
There are a variety of approaches to delivering gene therapy vectors to the CNS. Intraparenchymal injection, the injection of a vector directly into the spinal cord or brain tissue, can be used for delivery to a defined region. However, for many diseases, broad transduction of the CNS is desired. This can be accomplished by delivering a vector to the cerebrospinal fluid (CSF)5, the fluid that flows in and around the brain and spinal cord. There are three primary ways to deliver vectors to the CSF. The most invasive approach is intracerebroventricular delivery, which involves drilling a burr hole through the skull and advancing a needle through the brain into the lateral ventricles. This yields transduction throughout the brain. However, the procedure may cause intracranial hemorrhage, and the approach generally produces only limited transduction of the spinal cord6. Injection into the cisterna magna at the base of the skull is less invasive, but carries the risk of damage to the brainstem. While often used in animal research5, injection into the cisterna magna is no longer used routinely in the clinic7. Lumbar puncture is the least invasive approach to access the CSF. This involves placing a needle between two lumbar vertebrae and into the lumbar cistern.
Lumbar puncture for vector delivery is routinely performed in adult rats and mice and in neonatal mice8,9. The authors of this study recently performed lumbar punctures in juvenile rats (28-30 days of age) to deliver adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vectors. In adult rats, a neonatal lumbar puncture needle was placed vertically between the L3 and L4 vertebrae9. Proper placement results in a tail flick and CSF flowing up into the needle reservoir. In juvenile rats, though, neither of these read-outs could be achieved. The authors then attempted to adapt an adult mouse procedure using a 27 G insulin syringe inserted at an angle between L5 and L610. In adult mice, which are typically smaller than P28 rats, this does not produce a tail flick, but incorrect needle placement is evident by the backflow of the injectate. In juvenile rats, however, this approach uniformly led to the injectate being delivered epidurally, likely resulting from different elasticity between adult mice and juvenile rats of the tissue layers surrounding the spinal cord. Catheter approaches were evaluated next. Specifically, a catheter was introduced through an incision in the dura of the lumbar cistern and up to the mid-thoracic spinal cord; however, this approach led to substantial reflux of the injectate back out of the incision site during delivery. Attempts to place the catheter into the intrathecal space percutaneously using a guide needle were also unsuccessful. Due to the narrowness of the interlaminar width, the catheter would likely hit the rostral lamina and fail to advance.
Here, a method is described to achieve successful and reproducible solution delivery via a lumbar puncture in the juvenile rat. This approach can be used for viral vectors, and likely also for cells, pharmaceuticals, and other therapeutics.

Yazar Spotlight: Juvenil Sıçanlarda İntratekal Gen Terapisi Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Juvenil Sıçanlarda Lomber Sarnıç Enjeksiyonu ile İntratekal Vektör Verilmesi

Our research focuses on the development of gene therapies for diseases that affect the central nervous system. As of December, 2023, the FDA has approved AAV-based gene therapies for a handful of genetic stores, including spinal muscular atrophy, Leber congenital amaurosis, Duchenne muscular dystrophy, and Hemophilia A and B.Many more treatments are currently being investigated in preclinical and clinical trials. Devising safe and effective interventions for genetic diseases requires leveraging a range of approaches from careful natural history studies in patients to preclinical work in tissue culture and animal models, and gene therapy is really only one of several technologies that are used for this purpose.Many gene therapy experiments use neonatal or adult animals. Few evaluate treatments in juveniles, even though this represents a significant patient population for genetic disorders. So, for older children, body size and the immune system pose significant barriers to intravenous delivery of gene therapies.Intrathecal delivery may overcome this, but we need appropriate models to test this hypothesis. This procedure that we have developed will allow us to evaluate the efficacy of this approach in juvenile rats.

Enjeksiyon tekniğinin doğruluğunu belirlemek için, terapötik için bir vekil olarak bir boya, tripan mavisi kullanıldı. Bu boya proteinlere kolayca bağlanır, bu nedenle genellikle enjekte edildiği yapı içinde kalır. Bu, boyanın terapötiğin enjeksiyon sonrası dağılımını doğru bir şekilde tahmin edemeyebileceği anlamına gelir; Sadece enjeksiyonun doğruluğunu ortaya çıkarmak için kullanılır. Bel sarnıcına başarılı bir şekilde sokulduğunda, tripan mavisi dura mater'e bağlanır ve omur...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Assessing Intrathecal Gene Therapy Efficacy in Juvenile Rats at JoVE.com

Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

Araştırmamız, merkezi sinir sistemini etkileyen hastalıklar için gen terapilerinin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Aralık 2023 itibariyle FDA, spinal müsküler atrofi, Leber konjenital amauroz, Duchenne kas distrofisi ve Hemofili A ve B dahil olmak üzere bir avuç genetik mağaza için AAV tabanlı gen terapilerini onayladı. Genetik hastalıklar için güvenli ve etkili müdahaleler tasarlamak, hastalarda dikkatli doğal tarih çalışmalarından doku kültürü ve hayvan modellerinde klinik öncesi çalışmalara kadar bir dizi yaklaşımdan yararlanmayı gerektirir ve gen terapisi bu amaç için kullanılan birkaç teknolojiden sadece biridir.Birçok gen terapisi deneyi yenidoğan veya yetişkin hayvanları kullanır. Genetik bozukluklar için önemli bir hasta popülasyonunu temsil etmesine rağmen, gençlerde tedavileri çok az kişi değerlendirmektedir. Bu nedenle, daha büyük çocuklar için, vücut büyüklüğü ve bağışıklık sistemi, gen terapilerinin intravenöz olarak verilmesinde önemli engeller oluşturmaktadır.İntratekal doğum bunun üstesinden gelebilir, ancak bu hipotezi test etmek için uygun modellere ihtiyacımız var. Geliştirdiğimiz bu prosedür, bu yaklaşımın genç sıçanlardaki etkinliğini değerlendirmemize izin verecektir.

intrathecal-vector-delivery-juvenile-rats-via-lumbar-cistern

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

576 Görüntüleme.  Emory University. Araştırmamız, merkezi sinir sistemini etkileyen hastalıklar için gen terapilerinin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Aralık 2023 itibariyle FDA, spinal müsküler atrofi, Leber konjenital amauroz, Duchenne kas distrofisi ve Hemofili A ve B dahil olmak üzere bir avuç genetik mağaza için AAV tabanlı gen terapilerini onayladı. Genetik hastalıklar için güvenli ve etkili müdahaleler tasarlamak, hastalarda dikkatli doğal tarih çalışmalarından doku kültürü ve hayvan modelle...

Video: Yazar Spotlight: Juvenil Sıçanlarda İntratekal Gen Terapisi Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.