Los autores desean agradecer a Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi y Lacey Stearman de UT Southwestern por una discusión productiva sobre el desafío que plantean las ratas juveniles para la inyección intratecal. Este trabajo fue financiado en parte por Jaguar Gene Therapy (a JLFK).

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (28-30 días de edad, masa en el rango de aproximadamente 90-135 g, machos y hembras).
1. Preparación del vector
<ol><li>Descongele el vector AAV9 (consulte la Tabla de materiales) en hielo al comienzo del procedimiento.</li>
	<li>Centrifugar brevemente el tubo de microcentrífuga que contiene el vector en una centrífuga de mesa para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo del tubo.</li>
	<li>Agite suavemente el tubo de la microcentrífuga para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.</li>
</ol>2. Preparación de la jaula de recuperación
<ol><li>Coloque una jaula limpia sobre una manta eléctrica (consulte la Tabla de materiales) de modo que solo la mitad de la jaula esté en contacto con la manta.</li>
	<li>Ajuste la temperatura de la manta a ~37 °C.</li>
</ol>3. Preparación de la plataforma quirúrgica
<ol><li>Calentar una almohadilla isotérmica (ver Tabla de Materiales) a 39 °C en un microondas o en un baño de agua para que el contenido se vuelva líquido.</li>
	<li>Coloque la almohadilla isotérmica en la plataforma quirúrgica y cúbrala con una almohadilla de banco absorbente limpia.</li>
</ol>4. Preparación animal
<ol><li>Anestesiar a las ratas con isoflurano en una caja transparente (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Iniciar la inducción anestésica con isoflurano al 5% e ir disminuyendo un 1% por minuto hasta llegar al 2%. Sostenga al animal al 2% durante 3 minutos más.</li>
	<li>Mueva la caja que sujeta al animal a una campana extractora y abra la caja. NOTA: Esto limita la exposición del cirujano al anestésico.</li>
	<li>Retire el pelo del lomo del animal con una cortadora de pelo eléctrica. NOTA: Alternativamente, se puede utilizar una crema depilatoria o una maquinilla de afeitar manual y crema de afeitar.</li>
	<li>Coloque al animal en la plataforma quirúrgica con su hocico en el cono de la nariz de anestesia. NOTA: El animal puede comenzar a recuperar la conciencia mientras se retira el pelaje del sitio quirúrgico. Si esto sucede, anestesia nuevamente como se describió anteriormente.</li>
	<li>Aplique ungüento lubricante para los ojos en cada ojo para evitar que las córneas se sequen durante el procedimiento.</li>
	<li>Desinfecte el área quirúrgica con tres aplicaciones alternas de toallitas de povidona yodada e isopropanol.</li>
	<li>Inyecte los analgésicos por vía subcutánea. NOTA: La buprenorfina se utiliza generalmente en una dosis de 0,01-0,05 mg/kg, administrada cada 12 h. Alternativamente, se puede administrar una forma de liberación lenta de este fármaco una vez a 1 mg/kg para proporcionar un control adecuado del dolor durante 72 h. Consulte con la IACUC de la institución para conocer sus pautas con respecto al manejo del dolor.</li>
	<li>Inyectar 100 μL de lidocaína al 1% por vía subcutánea por encima de las apófisis espinosas L2 a L6 para proporcionar anestesia local.</li>
	<li>Coloque un rollo de papel toalla o un tubo de 1,5 cm de diámetro debajo del animal, justo rostral hasta las caderas. Esto ayuda a flexionar la columna vertebral, lo que facilita la inserción de la aguja entre las dos láminas.</li>
	<li>Coloque una cortina fenestrada (ver Tabla de Materiales) sobre el animal, centrando la fenestración sobre la columna lumbar.</li>
</ol>5. Exposición de la columna lumbar
<ol><li>Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando cada una de las patas del animal y buscando la ausencia de una respuesta de retirada.</li>
	<li>Con una hoja de bisturí #11, haga una incisión de aproximadamente 3 cm de largo en la piel a lo largo de la línea media de L2 a L6.</li>
	<li>Afloje la piel del músculo insertando un par de tijeras quirúrgicas curvas estériles entre el músculo y la piel y luego abriendo las puntas.</li>
	<li>Retire la fascia que cubre las apófisis espinosas L2-L5.</li>
</ol>6. Carga de la jeringa
<ol><li>Pipetear 25-35 μL del vector (para lograr la dosis deseada) en la tapa de un tubo de microcentrífuga estéril.</li>
	<li>Introduzca todo el volumen en la jeringa de insulina. NOTA: Tenga cuidado de no aspirar aire durante este proceso.</li>
</ol>7. Realización de la inyección
<ol><li>Identificar las apófisis espinosas L5 y L4. NOTA: L6 se encuentra directamente entre las dos crestas ilíacas, y su apófisis espinosa debe ser fácil de identificar mediante un sondeo con un instrumento romo. A continuación, el instrumento se puede deslizar suavemente por la parte posterior para encontrar los límites de los procesos L5 y L4.</li>
	<li>Coloque una mano de modo que el pulgar descanse suavemente sobre la cola y una pata del animal. Use un dedo para estabilizar la jeringa.</li>
	<li>Coloque la aguja de la jeringa de modo que quede a la izquierda de la apófisis espinosa L5 y alineada con su extremo caudal. Coloque la jeringa de manera que esté a unos 30° de la línea media y 30° hacia arriba del plano de la mesa. NOTA: Puede ser útil utilizar un microscopio quirúrgico para identificar mejor los puntos de referencia y colocar la punta de la aguja.</li>
	<li>Avance la aguja de la jeringa hacia adelante unos 8 mm, sobre la parte superior de la lámina L5 y luego debajo de la lámina L4 en la cisterna lumbar hasta que se golpee el hueso. La colocación correcta dará como resultado una contracción de la pata y/o la cola que se puede ver o sentir con el pulgar apoyado en la pata/cola. Si no hay espasmo, retire la aguja e intente el procedimiento desde el lado izquierdo. Si aún no hay contracción, repita el procedimiento entre L4/L3 y L3/L2 según sea necesario.</li>
	<li>Presione el émbolo lentamente durante unos 5 s. NOTA: Puede haber un tic en la pata o la cola durante la inyección.</li>
	<li>Mantenga la jeringa en su lugar durante unos 30 segundos después de presionar completamente el émbolo para permitir que la presión se equilibre y minimice el reflujo de la inyección cuando se retire la aguja.</li>
	<li>Retire lentamente la aguja.</li>
</ol>8. Cierre de la incisión
<ol><li>Aproxima los bordes de la incisión.</li>
	<li>Comenzando en un extremo de la herida, use una sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales) o grapas quirúrgicas para cerrar la incisión.</li>
</ol>9. Recuperación y seguimiento
<ol><li>Coloque al animal en la jaula precalentada.</li>
	<li>Revise al animal al menos cada 15 minutos hasta que esté completamente ambulatorio. NOTA: Esto debería tardar entre 15 minutos y 45 minutos.</li>
	<li>Durante los próximos tres días, realice controles de bienestar al menos una vez al día. Proporcionar analgésicos durante los primeros 2 días después de la cirugía o según lo requiera la IACUC.</li>
	<li>Una semana después de la cirugía, retire las suturas o grapas.</li>
</ol>10. Procedimiento de seguimiento
NOTA: Para determinar la precisión de la técnica de inyección, inyecte el tinte azul de tripán como se describe anteriormente y luego eutanasique inmediatamente al animal (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) y realice una laminectomía para visualizar el resultado.
<ol><li>Mientras el animal permanece bajo anestesia, eutanasiarlo administrándole una dosis letal de pentobarbital mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 150 mg/kg.</li>
	<li>Una vez que cesan la respiración y la actividad cardíaca, abra la cavidad torácica para asegurar la muerte. Extienda la incisión quirúrgica por la espalda hasta el cuello.</li>
	<li>Hacer una incisión de 4 cm de largo en el músculo paralelo a la columna vertebral a ambos lados de las apófisis espinosas, manteniéndolo lo más cerca posible de las apófisis.</li>
	<li>Con pinzas finas o tijeras, retire el músculo de entre las apófisis espinosas.</li>
	<li>Retire las apófisis espinosas desde L6 hasta la columna torácica inferior con un rongeur (ver Tabla de Materiales). Evite los movimientos de torsión, ya que esto puede dañar los rongeurs.</li>
	<li>Inserte la punta inferior del rongeur debajo de la lámina L5 y retire el hueso que recubre la médula espinal sacando varias "mordidas" de él. NOTA: Tirar hacia atrás de la apófisis espinosa L6 puede facilitar la inserción de la punta del rongeur. Se debe tener cuidado para evitar daños en la médula espinal.</li>
	<li>Continuar expandiendo la laminectomía al menos cuatro láminas rostralmente. Inspecciona la superficie interior de las láminas en busca de signos de tinte, lo que puede indicar una inyección fallida.</li>
</ol>

Punción lumbar de AAV9 en ratas juveniles para terapia génica del SNC

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+AAV+gene+transfer+to+the+nervous+system:+A+clinical+reality.">Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality.</a> Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).</li><li>Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins,+helper+dependence,+and+seroepidemiology+of+a+new+human+parvovirus.">Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus.</a> Virology. 134 (1), 64-71 (1984).</li><li>Schulz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+neutralizing+anti-aav+antibodies:+Detection+and+implications+for+rAAV-mediated+gene+therapy.">Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy.</a> Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).</li><li>Gray, S. 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El Dr. Donsante es inventor de una patente pendiente sobre la administración de vectores AAV9 en LCR.

Una amplia variedad de enfermedades afectan al SNC. Proporcionar una copia funcional del gen relevante a través de un vector viral es una estrategia de tratamiento atractiva para aquellos que son recesivos y de naturaleza monogénica, como la atrofia muscular espinal. Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye la mayoría de los vectores de terapia génica administrados por vía intravenosa11. Aquellos que pueden atravesar la barrera hematoencefálica, como el AAV9, deben administrar...

La promesa de las terapias génicas mediadas por virus finalmente se ha hecho realidad en los últimos años con la aprobación de la FDA de tratamientos para la atrofia muscular espinal, la distrofia de retina, la hemofilia del factor IX, el cáncer y más 1,2,3,4. Un sinnúmero de otras terapias están actualmente en desarrollo. La terapia génica tiene como objetivo administrar un gen terapéutico a las células de un paciente. Los productos de este nuevo gen pueden reemplazar la actividad faltante de un gen endógeno deficiente, inhibir un gen tóxico, matar células cancerosas o proporcionar alguna otra función beneficiosa.
En el caso de las enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), suele ser deseable administrar el vector de terapia génica directamente al tejido diana. Los enfoques no sistémicos proporcionan dos beneficios: minimizan los efectos secundarios fuera del objetivo que pueden ser causados por la transducción periférica y reducen en gran medida la cantidad de vector necesaria para lograr niveles adecuados de transducción en el tejido objetivo5.
Existe una variedad de enfoques para administrar vectores de terapia génica al SNC. La inyección intraparenquimatosa, la inyección de un vector directamente en la médula espinal o el tejido cerebral, se puede utilizar para la administración a una región definida. Sin embargo, para muchas enfermedades, se desea una transducción amplia del SNC. Esto se puede lograr mediante la entrega de un vector al líquido cefalorraquídeo (LCR)5, el líquido que fluye dentro y alrededor del cerebro y la médula espinal. Hay tres formas principales de entregar vectores al CSF. El enfoque más invasivo es la administración intracerebroventricular, que consiste en perforar un orificio a través del cráneo y hacer avanzar una aguja a través del cerebro hasta los ventrículos laterales. Esto produce la transducción a través del cerebro. Sin embargo, el procedimiento puede causar hemorragia intracraneal, y el abordaje generalmente produce solo una transducción limitada de la médula espinal6. La inyección en la cisterna magna en la base del cráneo es menos invasiva, pero conlleva el riesgo de daño al tronco encefálico. Si bien se usa a menudo en la investigación con animales5, la inyección en la cisterna magna ya no se usa de manera rutinaria en la clínica7. La punción lumbar es el abordaje menos invasivo para acceder al líquido cefalorraquídeo. Consiste en colocar una aguja entre dos vértebras lumbares y dentro de la cisterna lumbar.
La punción lumbar para el parto del vector se realiza de forma rutinaria en ratas y ratones adultos y en ratones neonatos 8,9. Los autores de este estudio realizaron recientemente punciones lumbares en ratas jóvenes (28-30 días de edad) para administrar vectores del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9). En ratas adultas, se colocó una aguja de punción lumbar neonatal verticalmente entre las vértebras L3 y L49. La colocación adecuada da como resultado un movimiento de la cola y el líquido cefalorraquídeo que fluye hacia el depósito de la aguja. Sin embargo, en ratas jóvenes, no se pudo lograr ninguna de estas lecturas. A continuación, los autores intentaron adaptar un procedimiento en ratones adultos utilizando una jeringa de insulina de 27 G insertada en un ángulo entre L5 y L610. En ratones adultos, que suelen ser más pequeños que las ratas P28, esto no produce un movimiento de la cola, pero la colocación incorrecta de la aguja es evidente por el reflujo de la inyección. Sin embargo, en ratas jóvenes, este enfoque condujo uniformemente a que la inyección se administrara por vía epidural, probablemente como resultado de la diferente elasticidad entre ratones adultos y ratas juveniles de las capas de tejido que rodean la médula espinal. A continuación, se evaluaron los abordajes de los catéteres. En concreto, se introdujo un catéter a través de una incisión en la duramadre de la cisterna lumbar y hasta la médula espinal torácica media; Sin embargo, este enfoque condujo a un reflujo sustancial del inyectado fuera del sitio de la incisión durante el parto. Los intentos de colocar el catéter en el espacio intratecal por vía percutánea utilizando una aguja guía tampoco tuvieron éxito. Debido a la estrechez del ancho interlaminar, es probable que el catéter golpee la lámina rostral y no avance.
Aquí, se describe un método para lograr una administración exitosa y reproducible de la solución a través de una punción lumbar en la rata juvenil. Este enfoque se puede utilizar para vectores virales y, probablemente, también para células, productos farmacéuticos y otras terapias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-200RK-FL</td>
			<td>Pipetting virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-GFP</td>
			<td>Vector Builder</td>
			<td>P200624-1005ynr</td>
			<td>AAV9 vector expressing GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>J422H</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braintree Scientific Isothermal Pads, 8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-195-4664</td>
			<td>Maintains body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1013922</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-ER (1 mg/mL)</td>
			<td>Zoopharma</td>
			<td></td>
			<td>Extended-release analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-365-409</td>
			<td>Blood removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape, Mouse, Clear Plastic, 12&#34; x 12&#34;, with Adhesive Fenestration</td>
			<td>Steris</td>
			<td>1212CPSTF</td>
			<td>Surgical drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Blanket</td>
			<td>CVS Health</td>
			<td></td>
			<td>CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20&#8211;200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>Pipetting virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>Curved surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td>Needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>328431</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>803250</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-031-350</td>
			<td>Skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine, 1%</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>239935</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Loading the syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-118-0481</td>
			<td>Skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td>Scalpel blade holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-17</td>
			<td>Anesthesia box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4-111</td>
			<td>#11 Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection

La terapia génica es una poderosa tecnología para entregar nuevos genes a un paciente para el tratamiento de una enfermedad, ya sea para introducir un gen funcional, inactivar un gen tóxico o proporcionar un gen cuyo producto pueda modular la biología de la enfermedad. El método de administración del vector terapéutico puede adoptar muchas formas, desde la infusión intravenosa para la administración sistémica hasta la inyección directa en el tejido diana. En el caso de los trastornos neurodegenerativos, a menudo es deseable sesgar la transducción hacia el cerebro y/o la médula espinal. El enfoque menos invasivo para dirigirse a todo el sistema nervioso central implica la inyección en el líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que permite que la terapia llegue a una gran fracción del sistema nervioso central. El método más seguro para inyectar un vector en el líquido cefalorraquídeo es la inyección intratecal lumbar, en la que se introduce una aguja en la cisterna lumbar de la médula espinal. Esta técnica, también conocida como punción lumbar, ha sido ampliamente utilizada en roedores neonatos y adultos y en modelos animales grandes. Si bien la técnica es similar en todas las especies y etapas de desarrollo, las diferencias sutiles en el tamaño, la estructura y la elasticidad de los tejidos que rodean el espacio intratecal requieren adaptaciones en el enfoque. En este artículo se describe un método para realizar la punción lumbar en ratas juveniles para administrar un vector adenoasociado al serotipo 9. Aquí, se inyectaron 25-35 μL de vector en la cisterna lumbar y se utilizó un reportero de proteína fluorescente verde (GFP) para evaluar el perfil de transducción resultante de cada inyección. Se discuten los beneficios y desafíos de este enfoque.

The promise of viral-mediated gene therapies has finally been realized in recent years with the FDA approval of treatments for spinal muscular atrophy, retinal dystrophy, factor IX hemophilia, cancer, and more1,2,3,4. Countless other therapeutics are currently in development. Gene therapy aims to deliver a therapeutic gene to a patient&#39;s cells. The products of this new gene can replace the missing activity from a deficient endogenous gene, inhibit a toxic gene, kill cancerous cells, or provide some other beneficial function.
For diseases affecting the central nervous system (CNS), delivering the gene therapy vector directly to the target tissue is often desirable. Non-systemic approaches provide two benefits: they minimize off-target side effects that may be caused by peripheral transduction, and they greatly reduce the amount of vector needed to achieve adequate levels of transduction in the target tissue5.
There are a variety of approaches to delivering gene therapy vectors to the CNS. Intraparenchymal injection, the injection of a vector directly into the spinal cord or brain tissue, can be used for delivery to a defined region. However, for many diseases, broad transduction of the CNS is desired. This can be accomplished by delivering a vector to the cerebrospinal fluid (CSF)5, the fluid that flows in and around the brain and spinal cord. There are three primary ways to deliver vectors to the CSF. The most invasive approach is intracerebroventricular delivery, which involves drilling a burr hole through the skull and advancing a needle through the brain into the lateral ventricles. This yields transduction throughout the brain. However, the procedure may cause intracranial hemorrhage, and the approach generally produces only limited transduction of the spinal cord6. Injection into the cisterna magna at the base of the skull is less invasive, but carries the risk of damage to the brainstem. While often used in animal research5, injection into the cisterna magna is no longer used routinely in the clinic7. Lumbar puncture is the least invasive approach to access the CSF. This involves placing a needle between two lumbar vertebrae and into the lumbar cistern.
Lumbar puncture for vector delivery is routinely performed in adult rats and mice and in neonatal mice8,9. The authors of this study recently performed lumbar punctures in juvenile rats (28-30 days of age) to deliver adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vectors. In adult rats, a neonatal lumbar puncture needle was placed vertically between the L3 and L4 vertebrae9. Proper placement results in a tail flick and CSF flowing up into the needle reservoir. In juvenile rats, though, neither of these read-outs could be achieved. The authors then attempted to adapt an adult mouse procedure using a 27 G insulin syringe inserted at an angle between L5 and L610. In adult mice, which are typically smaller than P28 rats, this does not produce a tail flick, but incorrect needle placement is evident by the backflow of the injectate. In juvenile rats, however, this approach uniformly led to the injectate being delivered epidurally, likely resulting from different elasticity between adult mice and juvenile rats of the tissue layers surrounding the spinal cord. Catheter approaches were evaluated next. Specifically, a catheter was introduced through an incision in the dura of the lumbar cistern and up to the mid-thoracic spinal cord; however, this approach led to substantial reflux of the injectate back out of the incision site during delivery. Attempts to place the catheter into the intrathecal space percutaneously using a guide needle were also unsuccessful. Due to the narrowness of the interlaminar width, the catheter would likely hit the rostral lamina and fail to advance.
Here, a method is described to achieve successful and reproducible solution delivery via a lumbar puncture in the juvenile rat. This approach can be used for viral vectors, and likely also for cells, pharmaceuticals, and other therapeutics.

Autor destacado: Evaluación de la eficacia de la terapia génica intratecal en ratas juveniles

Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

Our research focuses on the development of gene therapies for diseases that affect the central nervous system. As of December, 2023, the FDA has approved AAV-based gene therapies for a handful of genetic stores, including spinal muscular atrophy, Leber congenital amaurosis, Duchenne muscular dystrophy, and Hemophilia A and B.Many more treatments are currently being investigated in preclinical and clinical trials. Devising safe and effective interventions for genetic diseases requires leveraging a range of approaches from careful natural history studies in patients to preclinical work in tissue culture and animal models, and gene therapy is really only one of several technologies that are used for this purpose.Many gene therapy experiments use neonatal or adult animals. Few evaluate treatments in juveniles, even though this represents a significant patient population for genetic disorders. So, for older children, body size and the immune system pose significant barriers to intravenous delivery of gene therapies.Intrathecal delivery may overcome this, but we need appropriate models to test this hypothesis. This procedure that we have developed will allow us to evaluate the efficacy of this approach in juvenile rats.

Para determinar la precisión de la técnica de inyección, se utilizó un tinte, el azul de tripano, como sustituto de la terapéutica. Este tinte se une fácilmente a las proteínas, por lo que generalmente permanece dentro de la estructura en la que se inyectó. Esto significa que es posible que el tinte no prediga con precisión la distribución posterior a la inyección del tratamiento; Simplemente se utiliza para revelar la precisión de la inyección. Cuando se introduce con éxito en la cisterna lumbar, el azul d...

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Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

Nuestra investigación se centra en el desarrollo de terapias génicas para enfermedades que afectan al sistema nervioso central. A partir de diciembre de 2023, la FDA ha aprobado terapias génicas basadas en AAV para un puñado de reservas genéticas, incluida la atrofia muscular espinal, la amaurosis congénita de Leber, la distrofia muscular de Duchenne y la hemofilia A y B. Actualmente se están investigando muchos más tratamientos en ensayos preclínicos y clínicos. El diseño de intervenciones seguras y eficaces para las enfermedades genéticas requiere aprovechar una variedad de enfoques, desde estudios cuidadosos de historia natural en pacientes hasta trabajo preclínico en cultivo de tejidos y modelos animales, y la terapia génica es realmente solo una de las varias tecnologías que se utilizan para este propósito.Muchos experimentos de terapia génica utilizan animales neonatos o adultos. Pocos evalúan tratamientos en juveniles, a pesar de que esto representa una población significativa de pacientes con trastornos genéticos. Por lo tanto, para los niños mayores, el tamaño corporal y el sistema inmunitario plantean barreras significativas para la administración intravenosa de terapias génicas.La administración intratecal puede superar esto, pero necesitamos modelos apropiados para probar esta hipótesis. Este procedimiento que hemos desarrollado nos permitirá evaluar la eficacia de este enfoque en ratas jóvenes.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

567 vistas.  Emory University. Nuestra investigación se centra en el desarrollo de terapias génicas para enfermedades que afectan al sistema nervioso central. A partir de diciembre de 2023, la FDA ha aprobado terapias génicas basadas en AAV para un puñado de reservas genéticas, incluida la atrofia muscular espinal, la amaurosis congénita de Leber, la distrofia muscular de Duchenne y la hemofilia A y B. Actualmente se están investigando muchos más tratamientos en ensayos preclínicos y clínicos. El diseño de inter...

Video: Autor destacado: Evaluación de la eficacia de la terapia génica intratecal en ratas juveniles

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.