이 작품은 CIHR의 MOP-142209 TJS에 의해 지원되었다.

모든 실험 및 실험 동물을 사용하여 프로토콜 대학 매니토바의 동물 윤리위원회의 승인 및 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침을 준수 있었다. 악기, 완충제 및 솔루션 1. 제조 <ol><li> 모든 절제 장비, 유리 파스퇴르 피펫, 피펫 팁, 필터 장치, 및 탈 이온수를 오토 클레이브에 의해 멸균한다. </li><li> 탈 이온수 및 필터 소독에 스톡 포도당 용액,을 20 % (1.1 M / V w) 준비한다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수 및 필터 소독에서 100 mM의 피루브산 나트륨 용액을 준비한다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 준비 10 % HBSS (10 배), 10 mM의 HEPES 및 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신 탈 이온수의 용액을 만들어 칼슘 및 마그네슘이없는 행크의 균형 잡힌 염 용액 (CMF-HBSS). 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 10 ㎎ / ㎖의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I을 준비 CMF-HBSS에서 (DNase의)다음 필터링 소독하고 -20 ℃에서 보관. </li><li> (멸균 용액)에서 30 mM의 포도당 용액함으로써 신경교 최소 필수 배지 매체 (MEM)에, 95 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신, 10-15 % 소 혈청 성장 (BGS)을 준비한다. 주 : 프로토콜에 나타낸 세포 증식을 늦추기 위해 필요한 경우 5 % BGS의 용액을 사용할 수있다. 말 혈청 대신 BGS의 사용하지만, 각 배치로 인해 간 배치 변화에 사용하기 전에 테스트해야합니다 할 수있다. 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 준비된 솔루션을 저장합니다. 많은 실험실 FBS를 사용하지만, 우리는 지속적으로 BGS의 폐해 성장 FBS에서와 같은 강력한 것을 관찰했다. BGS는 화학적 성분이 보충되는 소 태아 혈청으로부터 유도된다. 또한, BGS는 FBS보다 훨씬 더 경제적이다. </li><li> 용액함으로써 신경 세포의 성장 및 유지 매체 (로 Neurobasal-B27, NBG)를 준비 1X B27 보충제 및 500 ㎖로 Neurobasal 메디 0.5mm의 L- 글루타민음. 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오. L- 글루타민은 성장 배지에서 더 안정한 것으로 제안되었다 루타로 치환 될 수있다. </li><li> MEM의 (살균 용액)에서 30 mM의 포도당 용액함으로써 매체 도금 뉴런 (멸균 용액으로부터), 1 mM 피루브산 나트륨, 10 % BGS를 준비한다. 이하 1 ~ 2 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 1㎜의 시타 라빈 (아라-C)의 용액을 필터 및 소독을 준비한다. -20 ℃에서 1 mL의 부분으로 나누어 저장. </li><li> 100 mN의 필터 - 멸균 NaOH를 100mm의 APV의 용액을 준비한다. -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 1 mg의 보레이트 완충액 / ml의 폴리 -L- 라이신, pH가 8.5 (50 mM의 붕산 및 붕사 12 밀리미터) 및 필터 소독 녹인다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 대신, 폴리 -L- 라이신, 하나는 세포 독성이 덜 수있다 폴리 -L- 오르니 틴을 사용할 수도있다. </li></ol> 2. 글 리아 문화 준비 <ol><li> 대뇌 피질의 아스트로 글 리아 세포 배양을 준비 <ol><li&gt; 출생 24 시간 이내에 쥐 새끼를 얻습니다. 를 마취시키다 얼음에 새끼를 놓습니다. </li><li> 70 % 에탄올로 새끼를 스프레이하고 목을 벨. </li><li> 15ml의 CMF-HBSS를 함유하는 얼음에 100mm의 접시 머리를 놓는다. </li><li> 두피 절단 두개골을 열고, 뇌간을 절단 한 후 3 ㎖ CMF-HBSS를 함유하는 얼음에 60mm 페트리 접시에 뇌를 전송함으로써 각각의 뇌를 해부. </li><li> 해마에서 대뇌를 분리하고 이들을 둘러싼 수막을 벗겨. 수막 섬유 아 세포에서 최소한의 오염을 확인하기 위해 적절한 예방 조치를 운동. 문화의 수막 섬유 아세포 성장을위한 아교와 경쟁하고 신경 세포의 건강에 유해 할 수 있습니다. 5 ㎖ CMF-HBSS를 함유하는 얼음에 60mm 페트리 접시에서 모두 대뇌 수집. </li><li> CMF-HBSS를 제거하고 해부 스프링 마이크로 가위를 사용하여 미분 가능한 한 수집 피질 조직을 말하다. </li><li> 들어온다 충분한 CMF-HBSS 추가PED 조직. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 15 ㎖의 튜브에 조직 조각을 전송. CMF-HBSS를 첨가하여 12 mL의에 전량을 가지고. </li><li> 1.5 mL의 2.5 % 트립신 및 10 ㎎ / ㎖ DNase의 용액을 각각 추가한다. 12 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 생성 된 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 티슈를 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 ~ 15 회 연화 처리하고, 추가로 3 분 동안 37 ° C의 수조에서 부화. </li><li> 렌즈 용지 나 BGS 5 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 메쉬 필터를 통해 상청액을 필터. 이것은 해리되지 않은 조직의 덩어리를 제거하기위한 것입니다. 또한, 상업적으로 이용 가능한 세포 여과기를 사용합니다. </li><li> 나머지 조직 조각을 함유하는 튜브에 CMF-HBSS 2.5 % 트립신, 1.5 mL를 135 mL를 추가하고 상기 추가의 10 분 동안 수욕에서 37 ℃로 배양한다. </li><li> 한번 더 잔여 조직을 연화 처리하고, 초기 여과 액을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 다시 현탁 필터. 다음, 린스 르BGS의 3 ㎖와 NS 종이. 최종 부피는 약 38 mL로해야한다. </li><li> 원심 분리기 (130)의 X g에서 6 분 동안 해리 아교 세포를 포함하는 현탁액. 조심스럽게 유리 파스퇴르 피펫을 이용하여 상층 액을 버린다. 하단의 펠렛 세포가 방해되지 않도록해야합니다. 펠렛의 바닥은 혈액 성분을 포함하는 약간 붉은 빛을 띤 나타납니다. </li><li> 펠렛의 적색 부분을 방해하지 않도록주의하면서, 새로운 튜브에 폐해 배지 1 ㎖에 아교 세포 이동. </li><li> 신경교 세포 해리 조합 재 부유 강아지 당 신경교 배지 2ml를까지 추가한다. 예를 들어, 10 새끼 사용한 후 부유 총 부피 20 ㎖ 것이다. </li><li> 새끼 당 75cm 2 세포 배양 플라스크를 준비한다. 각각의 플라스크에 18 mL의 예열 폐해 매체를 추가한다. </li><li> 전송 2 각 플라스크에 세포 현탁액 mL의 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 하루가 지난 후에도, 20 ㎖의 폐해를 m으로 대체edium. 이 단계에서, 문화는 아교 및 기타 원치 않는 세포 유형의 혼합이다. </li><li> 나흘 세포를 파종 한 후, 적극적으로 비 성상 세포의 세포를 꺼 내려 플라스크를 흔들. 이 작업을 수행하려면, CMF-HBSS 한 번 플라스크를 헹군 다음 각 플라스크에 10 mL의 신선한 CMF-HBSS를 추가합니다. 적극적으로 5-10 번 플라스크를 흔들어 다음 CMF-HBSS를 대기음. CMF-HBSS 회 헹군 다음 20 ㎖를 추가 폐해 매체. 참고 :이 단계는 비 표적 세포 유형의 제거를 확인하는 것이 중요하며, 원하는 성상 세포의 손실이 발생하지 않아야합니다. </li><li> 세포가 합류 (그림 1) 때까지 일주일에 두 번 신선한 아교 매체로 교체하십시오. </li></ol></li><li> 냉동 아교 세포 <ol><li> 배양 물이 컨 플루 언트되면, 배지를 흡인하고 10 ㎖ CMF-HBSS로 세포 단층을 세척한다. </li><li> 각 플라스크에 0.25 % 트립신 / EDTA 10 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 탭 플라스크는 부드럽게 셀을 제거합니다. 1 mL의 BGS의 t 추가O 각 플라스크에 15 개 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 6 분 동안 130 XG에서 튜브를 원심 분리기. 얻어진 상층 액을 제거한다. </li><li> 2ml의 폐해 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 아교 동결 배지 (1 부, 디메틸 설폭 사이드, 4 BGS 부품)을 준비한다. 플라스크 당 4 개 극저온 튜브 각각이 용액 0.5 mL를 넣고. </li><li> 각 바이알에 세포 현탁액 0.5 mL를 전송하고 밤새 -80 ° C에 냉동 절연 용기에 튜브를 삽입하여 서서히 세포를 동결. 하루가 지난 후에도 장기간 저장을 위해 액체 질소로 냉동 바이알 옮긴다. </li></ol></li><li> 도금 아교 세포를 부활 <ol><li> 플레이트 아교 세포 뉴런 문화 전날 1~2주. </li><li> 가하여 가온 신경교 매체 (10)와 한 50㎖ 튜브를 준비한다. </li><li> 2-3 분 동안 37 ℃의 수욕 신경교 1 냉동 바이알을 해동. </li><li> 10 ㎖ 폐해 배지를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 바이알의 내용물을 이동. </li><li> 원심 분리기상청액 오프 5 분에서 130 XG 및 기음에 대한 E 튜브. </li><li> 20 ㎖ 폐해 매체 펠렛을 재현 탁. </li><li> 배양 접시 (60mm)의 각각에 3 mL의 신선한 배지 폐해를 추가 한 후 각 접시에 세포 현탁액 1 ㎖를 옮긴다. 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양 물을 인큐베이션. </li><li> 일주일에 두 번 세포를 공급. 세포 밀도가 50 % 합류도 전 신경 배양 일 도달하면, 아교 성장 속도를 늦추기 위해 5 % BGS 함유 폐해 매체로 전환. 70 % - 신경 세포 배양 용 아교 단층의 목적은 50 % 합류점이다. </li><li> 1-2 일 신경 세포 배양 전에 NBG 배지 아교 매체 (6 ㎖ / 접시) 대체. </li></ol></li></ol> 3. 커버 슬립 제조 <ol><li> 청소 및 파라핀 비즈의 준비 <ol><li> 실온에서 30 분 동안 초음파 처리들을 : (부식성주의 70 % 중량 / 중량), 농축 질산 커버 슬립을 담근다. 다른 실험실 f를했습니다운드, 그것은 유익 대신 상온에서 12-24 시간 동안 세라믹 랙에 70 % 질산의 커버 슬립을 배양. </li><li> 조심 기관 가이드 라인에 따라 지정 화학 퓸 후드에서 질산을 버린다. 커버 슬립을 탈 이온수로 3-5 회 헹군다. </li><li> (대안 적 방법에 따라 이동하는 경우), 탈 이온수의 커버 슬립을 담그고, 30 분 동안 다시 초음파 처리. </li><li> 탈 이온수를 제거하고 커버 슬립 또 다른 세 번 씻어. </li><li> 50 ㎖의 탈 이온수에 담그고 커버 슬립을 오토 클레이브에 의해 멸균들을. 대안으로, 6 시간 동안 오븐에서 225 ° C에서 커버 슬립 살균. 이 대체 방법을 사용하는 경우, 3.1.9 단계로 건너 뜁니다. </li><li> 멸균 후, 다음 단계를 위해 멸균 층류 후드로 커버 슬립을 전송. </li><li> 탈 이온수를 제거하고 100 % 에탄올을 20-30 mL로 헹군다. </li><li> 100 % 에탄올 20 ~ 30 mL의를 추가하고 커버 슬립을 전송하고100mm의 배양 접시에 에탄올. </li><li> 60mm 페트리 접시, 접시 당 4-5 커버 슬립에 커버 슬립을 전송 한 다음 접시의 가장자리에 커버 슬립을 기대어에 의해 공기 건조에 할 수 있도록 무딘 핀셋을 사용합니다. 에탄올이 증발되면, 표면에 커버 슬립 평면 누워. </li><li> 적합한 내열성 유리 병에 10g 파라핀 전송. 파라핀을 녹이고, 적어도 1 시간 동안 핫 플레이트상에서 약 150-200 ℃에서 그것을 유지한다. 파라핀은 가열되어야하는 최적 온도는 약간의 조정을 취할 수있다. 비 이상적인 온도는 파라핀 구슬의 정확한 크기를 생산 어려움을 초래할 수 있습니다. 용해 후 대기 기간은 액체에 걸쳐 일관된 온도를 확인하는 데 도움이됩니다. </li><li> (각 지점은 약 120 ° 떨어져있는) 각 커버 슬립의 가장자리 근처에 세 개의 지점을 만지지 빠르게 후 파라핀에 파스퇴르 피펫을 찍어합니다. 방울은 약 0.3 mm 높은 구슬과 DIAM에서 1.0 ~ 2.0 mm로 확고히 할 것이다eter는 커버 슬립의 뉴런 및 신경교 아래 단층 (도 2) 사이의 공간을 제공하는 기능을하며. </li><li> 30 분 동안 UV 광 아래에서의 요리를 소독 한 다음, 실온에서 알루미늄 박 및 저장소로 커버. 준비 커버 슬립 저장 1 개월까지 사용할 수 있습니다. 파라핀 비즈를 사용하기 전에 적어도 한 주 동안 커버 슬립을 준수 할 수 있어야합니다. 이 프로토콜의 나머지 단계에서 분리에서 파라핀을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 폴리 - L - 라이신과 코팅 Coverslips는 <ol><li> 파라핀 구슬 이전에 준비 커버 슬립을 포함하는 페트리 접시를 가져옵니다. </li><li> 각 커버 슬립의 표면을 붕산염 완충액 폴리 L 리신 200 μL를 첨가하고 용액을 실온에서 덮여 밤새 커버 슬립에 앉게. 코트 파라핀 비즈가 위치되는 것과 같은 표면. 제대로 청소되면, 폴리 -L- 라이신 쉽게 전파해야합니다커버 슬립의 표면을 커버한다. </li><li> 후 하루 2 시간 동안 각각 멸균 증류수에 담가들을 커버 슬립 번 씻는다. 최종 세척 후, 접시 당 신경 도금 배지 4 ㎖의 물을 대체. 없는 커버 슬립의 표면을 폴리 -L- 리신으로 코팅 된 후 건조되도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 커버 슬립 함유 음식을 놓는다. 코팅 된 커버 슬립은 신경 세포 배양하기 전에 적어도 24 시간 동안 배양한다. 이는 신경 세포 배양을위한 주요 매체로 이루어집니다. </li></ol></li></ol> 해마와 도금 뉴런 4. 해부 <ol><li> (질 플러그 발견 한 날로부터 측정 된 배아 일 18-19) 임신 한 쥐를 얻 및 이소 플루 란 - 마취 잘린 또는 기타 승인 된 방법으로 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 쥐의 하부 스프레이하고 음부 죽로부터 절개복강 끝에 우. 오염을 방지하기 위해, 단지이 단계에서 피부를 통해 잘라주의해야합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 다시 해부 악기를 씻어하고 자궁을 노출 복부 벽을 통해 잘라. 두 자궁 뿔을 제거하고 살균 100mm 배양 접시에 배치합니다. </li><li> 층류 후드의 나머지 단계를 수행합니다. 태아를 둘러싸고있는 자궁 막을 제거합니다. 이를 20 mL의 참살 CMF-HBSS를 함유하는 100mm 배양 접시에서 머리를 놓는다. </li><li> 뇌를 절개 즉시 얼음에 2ml의 CMF-HBSS를 함유하는 60mm 페트리 접시에 배치. 다음 단계에 대한 충분한 공간을 확보하기 위해 접시 당 2 ~ 3 뇌를 수집합니다. </li><li> 해부 현미경 대뇌 반구의 중심선에서 수막을 벗겨하고 해마를 해부하고 4.5 mL의 CMF-HBSS를 함유하는 60mm 페트리 접시에 배치. 해마는 초승달 모양의 struc로 구분 될 수 있습니다대뇌 반구의 내측 표면에, 한시간하고는 심실로 횡 접경로 제거하기 쉽다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 수집 된 해마 조직 및 CMF-HBSS를 옮긴다. 2.5 % 트립신 0.5ml를 추가 한 후 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 이 완만하고 수율을 증가시킬 수 있기 때문에 파파인 대신 트립신을 사용할 수있다. </li><li> 조심스럽게 튜브의 하단에 방해받지 해마 조직을 떠나는 파스퇴르 피펫으로 트립신 용액을 제거한다. </li><li> 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하면서 천천히 5 ㎖ CMF-HBSS 회 조직을 세척 하였다. 두번째 세척 한 후, 조직을 CMF-HBSS의 충분한 부피를 첨가하여 적어도 5 ㎖를 전량을 가져온다. 최대 8 이상 10 새끼에서 해마가있을 경우 용액 CMF-HBSS를 첨가 할 수있다. </li><li> 조직 분리를위한 화재 광택 피펫의 두 가지 변종을 준비합니다. 하나의 변형의 끝은 피펫하지만 화재 - 연마 부드러워 가장자리 정상적인 직경이다. 다른 VARI개미 반감 선단 직경이다. 간단히 화염 소스 대각선 유리 파스퇴르 피펫의 선단을 노출 한 후 피펫 팁을 조사한다. <ol><li> 선단 에지가 평활화되었다거나 직경이 감소 될 때까지이 과정을 반복한다. 조직이 이러한 세포를 손상시키지 않고 단일 세포를 산출하기 위해 해리 될 수 있도록 최적의 직경을 찾아 실천하는 것이 중요하다. </li></ol></li><li> 매끄러운 가장자리 통상 유리 파스퇴르 피펫을 통해 제 10 패스하여 해마 조직을 연화 처리하고, 직경 감소와 피펫이어서 추가 5 내지 10 통과한다. 목표는 아니오 세포 또는 거의 조직 덩어리의 균일 한 용액을 제조하는 것입니다. </li><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정한다. 두 반구에서 해마가 결합 될 때 통상, 강아지 당 80 만 내지 1.0 세포가 얻어진다. </li><li> 접시에 세포 현탁액의 충분한 양을 전송60mm 접시 당 300,000 세포의 도금 밀도를 얻을 수 평판 배지 4 mL의 폴리 -L- 리신 - 코팅 된 커버 슬립을 함유. 세포의 밀도는 의도 된 실험에 따라 10 만에서 50 만까지 다양 할 수 있습니다. </li><li> 3-4 시간 후, NBG 매체에 아교 세포를 포함하는 접시에 부착 된 커버 슬립 뉴런으로 옮긴다. 이는 신경 세포 도말 된면이 아래 아교 세포 층쪽으로 향하도록 할 것이다. 아교 접시 당 4-5 커버 슬립의 총을 추가합니다. </li><li> 2 ~ 3 일 도금 후, 아교 세포 성장을 체포 접시 당 5 μM의 최종 농도 아라-C 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 각 먹이에 새로운 배지 2.5 mL로 된 매체의 2 mL로 교체하여 일주일에 한 번 세포를 공급. 추가 여분 매체는 ​​시간이 지남에 증발을 보상하기 위해, 그리고 중간 부분 만이 아교 세포 배지의 일관된 조절을 위해 변경된다. 이러한 문화는 (적어도 한 달 동안 일반적으로 건강그림 3). 신경 생존은 100 μM의 최종 농도로 배양 배지에 APV를 첨가함으로써 개선 될 수있다. APV는 NMDA 수용체 길항제이며, 글루탐산 흥분 독성을 줄여 생존을 촉진합니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

배양 신경 세포의 &quot;샌드위치&quot;방법은 다른 곳에서 잘 설명 하였지만 2, 11, 그것을 채택하고자하는 연구자에 대한 불만으로 이어질 수 있습니다 만 텍스트를 설명하는 것은 매우 어려운 프로토콜에 걸쳐 여러 단계가있다. 아교 문화, 커버 슬립 준비 및 신경 세포의 문화 및 유지 보수 :이 방법은 세 가지 흐름으로 나눌 수 있습...

뇌는 신경 세포의 복잡한 네트워크로 구성되어있다. 네트워크 동작 및 뇌 기능 개별 뉴런의 기여는 자신의 분자 조성 및 생리 학적 특성의 동요를 선택적으로 변경하여 조사 할 수있다. 개별 뉴런의 유전 및 화학 조작은 후자의 세포 이질성과 복잡성에 의해 방해 그대로 뇌 조직에 비해 배양 신경 세포에서 틀림없이 더 쉽다. 배양 뉴런은 잘 정의 축삭 및 수상 아버 개발 서로 광범위한 시냅스 연결을 형성한다. 성인 동물 또는 신경계의 기타 영역에서 신경 세포 배양이 가능하지만, 배아 해마 배양 자주 정의 피라미드 세포 집단 및 상대적으로 낮은 밀도 신경교 (1, 2)로 인해 바람직하다. 배양에 저밀도로 성장 해마 뉴런이다 특히 AME세포 내 현지화, 단백질 인신 매매, 신경 극성 시냅스 개발 연구에 네이블. 배양 신경 세포는 광범위 시냅스 3, 4, 5, 6 분 방법을 연구에 사용되었다. 출생 후 생존하지 않는 글로벌 유전자 삭제와 마우스의 신경 세포 배양 준비는 특정 유전자 (7)의 세포와 시냅스 역할을 공부에 특히 유용되고있다. 뇌에서와 같이 배양 된 해마 신경 아교 세포의 영양 지원에 따라 달라집니다. 이것은 그들의 문화를 복잡하게하고,이 지원이 공급하는 여러 가지 방법의 개발을 주도하고있다. 하나의 일반적으로 사용되는 방법은 교세포 8, 취득한 HIPP로부터 오염물 교세포를 허용하는 단일 층에 직접 신경 도금 포함ocampal 조직 증식 및 신경 세포 (9) 아래에 단일 층을 형성한다. 이 방법은 약간의 성공을 발견 하였지만, 결과 신경 세포 배양의 불순물 촬상 실험 불리하다. 신경 세포 배양의 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 전체 층 폐해 급지 아웃두고 대신 정의 된 성장 배지 (10)의 형태의 영양 지원을 제공하는 것이다. 여기, 우리는 &quot;샌드위치&quot;또는 신경 문화 2, 11의 &quot;은행&quot;방법을 설명합니다. 이 방법은 파라핀 왁스 비드로 분리 아교 세포 단층 위에 부유 커버 글라스에 해마 뉴런 도금 포함한다. 이 기본 아교 단일 층에서 영양 지원을 허용하면서 아교 세포를 오염없이 뉴런의 동질적인 인구의 장기 문화를 용이하게합니다. 신경 세포가 충분한 연령, 성숙도의 경우,신경 세포의 커버 슬립은-뒤집어 밖으로 아교 요리 및 이미징 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#PP)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25&#160;mm</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflorane</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 105 Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>2105-841</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes with cotton filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butane bunsen burner</td>
			<td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td>
			<td>Model 65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>Corning, Inc</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks (75 cm^2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum (BGS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3054103</td>
			<td>Heat-inactivation is recommended before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9876-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity Convection Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89511-404</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath (Sonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>62786-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Staining Racks</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&#160;GmbH</td>
			<td>1001/18</td>
			<td>Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Used with BD syringe for filter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-16Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

low-density primary hippocampal neuron culture

배양 개별 신경 세포의 구조와 생리을 프로빙하는 능력은 신경 생물학 연구에 매우 중요하고 개별적인 세포 또는 정의 된 네트워크의 유전 화학적 조작 유연성을 허용한다. 그대로 뇌 조직에 비해 조작의 이러한 편의성은 감소 된 문화 시스템에 간단하다. 이 차 신경 세포의 분리 및 성장을위한 많은 방법이 존재하지만, 각각 자신의 한계가있다. 이 프로토콜은 아교 세포의 단층 위에 부유 커버 글라스에 저밀도 및 고순도 쥐 배아 해마 신경 세포를 배양하는 방법을 설명한다. 이 &#39;샌드위치 문화는&#39;기본 아교 단일 층에서 영양 지원을 허용하면서 뉴런의 인구의 독점적 인 장기 성장을 할 수 있습니다. 신경 세포가 충분한 연령, 성숙도의 경우, 신경 세포의 커버 슬립은 아교 요리의 아웃을 뒤집어 및 이미징 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 뉴런 g이 방법으로 rown은 일반적으로 몇 주 동안 생존하고 광범위한 아버, 시냅스 연결 및 네트워크 속성을 개발한다.

주 신경 세포 배양액의 &quot;샌드위치&quot;방법에있어서, 해마 신경 세포 (도 3) 파라핀 비드 (도 2)에 의해 분리 된 아교 세포 (도 1)의 침대에 성장한다. 이 신경 세포가 선택적으로 최소한의 아교 세포 오염 커버 글라스에 성장하지만, 조직 배양 접시에 성장 교세포에서 적절한 영양 지원을받을 것을 보장한다. 일반적으로, 뉴런&gt; 3주?...

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Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다.

낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.4K 조회수.  University of Manitoba.  이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다. 

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

연구

신경과학

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

마우스 후뇌<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...