Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

Questo modello di malattia in vitro, può essere utilizzato per studiare l'interazione del sangue intero e delle cellule derivate dal paziente, in particolare l'endoteliale, per valutare la trombogenicità e l'efficacia degli agenti anticoagulanti. Si tratta di cellule di endotelio che possono essere utilizzate in varie circostanze e possono essere modificate introducendo microfluidica su misura o regolando i parametri del flusso sanguigno. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare la dinamica del trombo in condizioni infiammatorie o per valutare gli effetti della terapia anticoagulante e antipiastrinica.

In definitiva, questi approcci possono essere utilizzati in un metodo di medicina personalizzata. Dopo aver ottenuto un campione chirurgico di tessuto dell'arteria polmonare umana, rivestire un piatto di coltura cellulare ad alta affinità di 60 millilitri con due millilitri di cinque microgrammi per millilitro fiboronectina e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Alla fine dell'incubazione, utilizzare forcep sterili in un armadio a flusso laminare in condizioni sterili, per trasferire il tessuto in una piastra di Petri di PBS.

Se il tessuto è ancora in un anello, tagliare l'arteria aperta con le forbici, facendo attenzione a non toccare lo strato più interno del vaso, poiché l'endotelio è facilmente danneggiato e rimosso. Dopo aver rimosso la fibronectina, aggiungere quattro millilitri di mezzo cellulare endoteliale completo al piatto e utilizzare le forcelle per trasferire il campione di tessuto nel mezzo, utilizzare un bisturi per raschiare con cura lo strato interno del vaso nel mezzo, facendo attenzione a evitare eventuali accumuli lipidici osservati nella parete del vaso. Dopo che le cellule sono state raccolte, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare.

Se i fibroblasti contaminano la coltura, utilizzare la separazione cellulare di affinità magnetica per un CD144, secondo le istruzioni del produttore per purificare le cellule. Generalmente, la coltura è definita pura, quando la citometria a flusso rileva il 10% o meno di cellule contaminanti. Quando il numero sufficiente di cellule endoteliali è stato ottenuto per uso sperimentale, le cellule endoteliali primarie possono essere caratterizzate per la presenza di marcatori specifici delle cellule endoteliali e per l'assenza di marcatori muscolari ed epiteliali lisci.

Per la preparazione della camera di flusso, codificare un canale di uno scivolo a flusso di sei pozzi con 30 microlitri di gelatina allo 0,1% e incubare questo scivolo per almeno 15 minuti a 37 gradi Celsius. Oltre alle camere di flusso commerciali, è possibile utilizzare camere di flusso su misura con dimensioni specifiche per studiare l'influenza della geometria vascolare sulla dinamica del coagulo. Mentre lo scivolo è in incubazione, raccogliere le cellule da un'arteria polmonare confluente coltura cellulare endoteliale con EDTA e tripina e sedimentare che le cellule per centrifugazione, sospendere il pellet in 600 microlitri di mezzo cellulare endoteliale completo e con forza ma delicatamente, aggiungere 100 microlitri di cellule in ogni canale, aggiungere altri 50 microlitri di mezzo cellulare endoteliale completo al canale , per fornire un mezzo sufficiente per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, cambiare il mezzo il giorno successivo per lavare via le cellule non unite.

Dopo sei giorni di coltura, le cellule avrebbero dovuto formare un monostrato confluente stabile. Il settimo giorno di coltura cellulare endoteliale dell'arteria polmonare, acquisire campioni di sangue venoso da soggetti che non ricevono un trattamento anticoagulante in 109 tubi anticoagulanti citrato monosodici e trasferire il sangue in un tubo da 50 millilitri. Il sangue può contenere virus e altri agenti infettivi.

Pertanto è importante indossare sempre i guanti e seguire le linee guida di sicurezza per lavorare con il materiale umano. Etichettati fluorescentmente i globuli con una concentrazione da 1 a 10.000 di Calcein AM Red e 50 microgrammi per millilitro e aggiungere alexa 488 fibrinogeno, quindi incubare il sangue a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire il completo assorbimento. 30 minuti prima della perfusione, trattare le cellule endoteliali dell'arteria polmonare con 100 microlitri di un'istamina micromolare nel mezzo cellulare endoteliale e l'1% di siero bovino fetale senza altri additivi.

E utilizzare una siringa da 20 millilitri riempita con tampone di lavaggio per risciacquare i tubi del sistema di flusso, caricare una siringa da terzo a 20 millilitri con due millilitri di tampone di lavaggio e caricare la siringa su una pompa per siringhe. Utilizzare una seconda siringa da 20 millilitri per riempire i tubi di flusso con hippy più tampone contenente l'1% di albumina di siero bovino e utilizzare un connettore Laura a forma di gomito per collegare accuratamente i tubi al micro scivolo, collegare l'uscita della diapositiva alla siringa, riparare dalla microscopia posizionando la cella contenente lo scivolo sul palco e assemblando la configurazione per l'esperimento , regolare il microscopio e impostare i parametri per l'imaging. Ricalcificazione del sangue enfatico.

E questo è un felice co-sponsor della coagulazione, inoltre cerca di evitare la formazione di bolle d'aria perché questo danneggerà lo strato cellulare endoteliale e influenzerà i tuoi risultati. Immediatamente prima della perfusione, diluire il sangue due volte con tampone di ricalcolo e posizionare il tubo di ingresso del micro scivolo nel tubo del sangue, premere start sulla pompa della siringa. Non appena il sangue inizia a scorrere sull'endotelio, premere start al microscopio per acquisire immagini utilizzando i canali attivi preselezionati e le posizioni della regione di interesse, ogni 15 secondi per cinque minuti.

Al termine dell'analisi, interrompere la registrazione e la pompa della siringa e pulire correttamente. L'etichettatura delle piastrine con Calcein AM Red e l'aggiunta di fibrinogeno coniugato Alexa 488, consente lo studio della formazione di trombo per adesione piastrinica e fibra e deposizione. In condizioni non stimolate, non vi è alcun legame di piastrine o fibrina all'endotelio.

La stimolazione con istamina si traduce in un immediato aumento dell'adesione piastrinica, che raggiunge un plateau dopo 2,5 minuti, in questo momento, le piastrine iniziano a secernere fattori autocrini che inducono un'aggregazione piastrinica e una scissione fibrinogena alla fibrina, con conseguente fibra e deposizione a tre minuti e la formazione di un aggregato stabile con le piastrine dopo quattro minuti. Il trattamento con anticoagulante diretto, inibisce sia la formazione di coaguli che l'adesione piastrinica rispetto al sangue non trattato. L'analisi immunofluorescente delle interazioni piastrine cellulari endoteliali dell'arteria polmonare dopo cinque minuti di perfusione, rivela il mantenimento della cellula endoteliale, dei contatti cellulari, come confermato dalla colorazione della cadherina endoteliale vascolare, indicando che i coaguli di sangue si formano sugli strati del modello endoteliale piuttosto che sulla matrice sottostante tra spazi endoteliali.

le cellule endoteliali della vena ombelicale umana dimostrano meno adesione piastrinica e deposizione di fibrina rispetto all'endotelio dell'arteria polmonare. In particolare, le cellule endoteliali dell'arteria polmonare primaria maestra da pazienti cronici di ipertensione polmonare tromboembollica, mostrano un aumento dell'adesione piastrinica e una maggiore deposizione di fibrina rispetto alle cellule sane. La trombogenicità dell'endotelio dipende da molteplici fattori come l'origine del letto vascolare o le parti dello sfondo biologico.

Utilizzando questo protocollo, le disfunzioni intrinseche nei componenti vascolari ed ematici, così come l'efficacia della terapia anti coagulata possono essere testate durante diverse fasi dell'emostasi della trombosi. Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere le interazioni tra sangue e Teo, in varie malattie tromboemboliche con il potenziale finale di prevedere risposte specifiche del paziente alla terapia anticoagulante.