التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن

Summary

نحن نصف أساليب التفكيك الضوئي الفلورية لتحليل النقل المحوري للاعصاب في محاور عصبية واحدة من الأعصاب النخاعية من الفئران المحورة وراثيا التي تعبر عن بروتين الليفية العصبية تنشيطية ضوئية.

Abstract

البوليمرات البروتين العصبية تتحرك على طول محاور في عنصر بطيء من النقل المحوري في متوسط سرعة ~ 0.35-3.5 مم / يوم. حتى وقت قريب كانت دراسة هذه الحركة في الموقع ممكنة فقط باستخدام وضع العلامات النبضية الإشعاعية ، والتي تسمح بتحليل النقل المحوري في الأعصاب الكاملة مع دقة زمنية للأيام ودقة مكانية من ملليمترات. لدراسة نقل الاعصاب في الموقع مع ارتفاع دقة الزمان والمكانية، وضعنا ماوس hThy1-paGFP-NFM المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين العصبي M الموسومة مع GFP تنشيطها في الخلايا العصبية. هنا نصف التضاء الضوئي تنشيط نبض الهروب والنبض انتشار أساليب لتحليل نقل neurofilament في محاور النخاعية واحدة من الأعصاب التيبية من هذه الفئران السابقين vivo. يتم الحفاظ على أجزاء العصب المعزولة على مرحلة المجهر عن طريق التسريب مع المالحة المؤكسجة وصورة عن طريق المجهر الفلوري الدوار القرص. يستخدم الضوء البنفسجي لتنشيط الفلوريس في نافذة قصيرة محور عصبي. يتم تحليل الفلوريس في المناطق المنشطة والحاصرة بمرور الوقت ، مما يسمح بدراسة نقل الليفية العصبية مع دقة زمنية ومكانية على ترتيب الدقائق والميكرنات ، على التوالي. يمكن استخدام النمذجة الرياضية لاستخراج المعلمات الحركية لنقل الاعصاب بما في ذلك السرعة والتحيز الاتجاهي والسلوك التوقف من البيانات الناتجة. ويمكن أيضاً تكييف طرق الهروب النبضي وانتشار النبض لتصور نقل الليفية العصبية في الأعصاب الأخرى. مع تطور فئران إضافية محورة وراثيا، يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب لتصوير وتحليل النقل المحوري للبروتينات الأخرى من الهيتوليات العظمية والبوليتوسولية في المحاور.

Introduction

وقد تجلى النقل المحوري للأعصاب لأول مرة في 1970s بواسطة الملصقات النبضية الإشعاعية¹. وقد أسفرت هذه المقاربة عن ثروة من المعلومات حول نقل الاعصاب في الجسم الحي، ولكن لديها دقة مكانية وزمنية منخفضة نسبيا ، وعادة ما تكون على ترتيب ملليمترات وأيام في أحسن الأحوال². وعلاوة على ذلك، فإن وضع العلامات بالنبض الإشعاعي هو نهج غير مباشر يتطلب حقن وتضحية متعددة لتوليد دورة زمنية واحدة. مع اكتشاف البروتينات الفلورسنت والتقدم في المجهر الفلوريس في 1990s، أصبح في وقت لاحق من الممكن لتصوير نقل neurofilament مباشرة في الخلايا العصبية المستزرعة على مقياس زمني من ثوان أو دقائق ومع شبه ميكرومتر التحليل المكاني، مما يوفر رؤية أكبر بكثير في آلية الحركة³. وقد كشفت هذه الدراسات أن البوليمرات العصبية في المحاور تتحرك بسرعة وبشكل متقطع في كل من الاتجاهات التيروغرادية والرجعية على طول المسارات ميكروتوب، مدفوعا البروتينات الحركية ميكروتوبول. ومع ذلك، الليفية العصبية هي هياكل محدودة الانعراج فقط 10 نانومتر في القطر التي عادة ما تكون متباعدة بعيدا عن جيرانها من قبل عشرات فقط من نانومتر; لذلك، لا يمكن تتبع البوليمرات إلا في الخلايا العصبية المستزرعة التي تحتوي على الليفية العصبية الموزعة بشكل غير قليل بحيث يمكن حل البوليمرات المتحركة من جيرانها⁴. وهكذا، فإنه ليس من الممكن في الوقت الحاضر لتتبع النخاع العصبي واحد في محاور عصبية تحتوي على البوليمرات العصبية وفيرة، مثل المحاور النخاعية.

لتحليل النقل المحوري للأعصاب في المحاور العصبية الغنية باستخدام المجهر الفلوريسنس ، نستخدم أسلوب الفلوريسينيشن الضوئي نبض الهروب التي وضعناها لدراسة السلوك التوقف على المدى الطويل من neurofilaments في الخلايا العصبية المستزرعة^4،5. يتم تنشيط الليفية العصبية الموسومة ببروتين انصهار الفلورية الفلورية القابلة للفكّاق الضوئي في جزء قصير من محور عصبي ، ومن ثم يتم تحديد معدل مغادرة تلك الشعيرات من المنطقة المنشطة من خلال قياس اضمحلال الفلوريسانس بمرور الوقت. وميزة هذا النهج هو أن تحليل مستوى السكان لنقل الليفية العصبية التي يمكن تطبيقها على مقياس زمني للدقائق أو ساعات دون الحاجة إلى تتبع حركة البوليمرات الليفية العصبية الفردية. على سبيل المثال، استخدمنا هذه الطريقة لتحليل حركية نقل الاعصاب في الثقافات myelinating⁶.

في الآونة الأخيرة، وصفنا تطوير فأر hThy1-paGFP-NFM المعدلة وراثياً الذي يعبر عن مستويات منخفضة من بروتين الليفيلامين العصبي paGFP الموسومة M (paGFP-NFM) في الخلايا العصبية تحت سيطرة الإنسان العصبية الخاصة Thy1 المروج⁷. يسمح هذا الفأر بتحليل نقل الاعصاب في الموقع باستخدام المجهر المفلور. في هذه المقالة، نحن وصف النهج التجريبية لتحليل نقل النخاع العصبي في المحاور النخاعية من الأعصاب التيبية من هذه الفئران باستخدام نهجين. وأول هذه الأساليب هو طريقة الهروب النبضي الموصوفة أعلاه. هذه الطريقة يمكن أن تولد معلومات حول السلوك التوقف من neurofilaments، ولكن أعمى عن الاتجاه الذي خيوط مغادرة المنطقة المنشط، وبالتالي لا يسمح قياس اتجاه صافي وسرعة النقل⁸. والثاني من هذه الأساليب هو طريقة جديدة لانتشار النبض الذي نحلل فيه ليس فقط فقدان الفلوريسنس من المنطقة المنشطة، ولكن أيضا الزيادة العابرة في الفلوريسنس في نافذتين يحيطان بهما تتحرك خيوط الفلورسنت من خلالها وهي تغادر المنطقة المنشطة في الاتجاهين المتنثين والرجعي. في كلا النهجين، يمكن الحصول على معلمات نقل الليفية العصبية مثل متوسط السرعة والاتجاه الصافي وسلوك التوقف باستخدام التحليل الرياضي والنمذجة للتغيرات في الفلورس في نوافذ القياس. ويوضح الشكل 3 هذين النهجين.

هذا البروتوكول يدل على تشريح وإعداد العصب، وتفعيل وتصوير الفلوري paGFP، وتحديد كمي من نقل الليفية العصبية من الصور المكتسبة باستخدام حزمة توزيع فيجي من ImageJ⁹. نستخدم العصب التيبالي لأنه طويل (عدة سم) ولا يتفرع؛ ومع ذلك، من حيث المبدأ أي العصب التعبير عن paGFP-NFM مناسب للاستخدام مع هذه التقنية إذا كان يمكن تشريحها و de-غماد دون إتلاف محاور.

Protocol

وقد وافقت على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) من جامعة ولاية أوهايو.

1. إعداد محلول ملحي العصب

1. جعل 100 مل من محلول بريوير^10:98 mM NaCl، 1 mM KCl، 2 mM KH₂PO₄، 1 mM MgSO₄، 1.5 mM CaCl₂، 5.6٪ D-glucose، 23.8 mM Nahco₃ في الماء المقطر المزدوج.
2. فقاعة 95٪ الأكسجين/ 5٪ ثاني أكسيد الكربون (كاربوجين) من خلال محلول ملحي لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. يمكن إعادة استخدام بقايا المالحة في غضون أسبوع واحد; ومع ذلك، يجب أن يكون reoxygenated قبل كل استخدام.
3. صب ملحي أكسجين في حقنة 60 مل وضمان أن هناك الحد الأدنى من الهواء المتبقي في الحقنة.

2. الجمعية الأولية لغرفة الضخ العصبي

1. توصيل الحقنة والأنابيب كما هو مبين في الشكل 1A، ووضع أنبوب تدفق في قارورة النفايات.
2. وضع طوقا الخارجي في السكن غرفة الضخ، وضمان أن يتم محاذاة مدخل تدفق ومخارج الوظائف مع الثقوب في طوقا.
3. وضع طوقا الداخلية (سيليكون، 100 ميكرومتر سميكة) على غطاء دائري #1.5 (قطرها 40 مم)، وصقل بعناية أي التجاعيد في طوقا لضمان ختم ضيق. لتسهيل التجميع في وقت لاحق، ضع غطاء الأغطية والحشاء على منشفة ورقية أو مسح المهمة مع طوقا تواجه ما يصل.

3. تشريح وإعداد العصب الوبيبي الماوس

1. التضحية بالحيوان عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون أو طريقة أخرى معتمدة من الناحية المؤسسية. بدء جهاز توقيت عندما يتوقف الحيوان الحركة / التنفس، كما يجب أن يتم إجراء التجارب فقط في غضون 3 ساعات من التضحية⁷.
2. رش الفراء مع 70٪ الإيثانول وإزالة أكبر قدر ممكن من الساقين الحيوان والظهر باستخدام شفرة حلاقة كهربائية.
3. باستخدام زوج من مقص التشريح كبيرة، وجعل شق الظهرية في الجلد بالقرب من منتصف العمود الفقري ومواصلة قطع حول الجانب البطني للحيوان. بدءا من هذا القطع، تعكس ببطء الجلد من الساقين عن طريق سحب بلطف بعيدا عن العضلات وقطع اللفافة.
4. وضع الحيوان في موقف supine على صينية تشريح ودبوس جميع الكفوف الأربعة. اختياريا دبوس الذيل للحد من الحركة أكثر.
5. باستخدام مقص microdissection، وجعل شق في عضلات الفخذ في منتصف الطريق بين الذيل والركبة لفضح العصب الوركي. تأكد من أن العصب، الذي هو مرئي من خلال العضلات، لا قطع.
6. تمديد شق الظهري وبطينلي لإزالة العضلات. وبالمثل، إزالة عضلات العجل، والحفاظ على تخفيضات الضحلة وقصيرة لتجنب إتلاف العصب.
7. إزالة العضلات حتى يتعرض العصب التيبالية تماما من النقطة حيث فروع من العصب الوركي (في الركبة) إلى كعب (الشكل 2A).
   ملاحظة: في جميع الخطوات بما في ذلك وبعد تشريح العصب التيبالي، تجنب التعرض غير الضروري للضوء المحيط لتقليل التنشيط العرضي المحتمل لpaGFP في العصب.
8. فهم العصب التيبالي في نهاية العمود الفقري القريب مع زوج من ملقط وقطع العصب باستخدام زوج من مقص microdissection. الحرص على عدم وضع التوتر على العصب، ورفعه بعيدا عن العضلات، وقطع أي مرفقات.
9. قطع نهاية العمود الفقري- مجرد من العصب التيبالي ونقلها إلى طبق بيتري صغير من درجة حرارة الغرفة المالحة المؤكسجة. من هذه النقطة في الإجراء، تكون دائما على يقين من تتبع نهايات قريبة وبعد من العصب.
   ملاحظة: إحدى الطرق للقيام بذلك هي وضع علامة على نهاية العصب بزاوية قطع بحيث يكون التفتق مرئياً.
10. بدءا من نهاية قريبة من العصب، فهم بلطف محور عصبي المكشوفة ينتهي مع زوج من ملقط غرامة جدا.
11. مع زوج الثاني من ملقط، فهم العصب اغتماً وكيلاً، وسحب ببطء نحو نهاية العصب البعيدة. سوف تنزلق مُدْدِع العصب على طول المحاور مع الحد الأدنى من المقاومة. ضمان عدم تطبيق أي توتر لا مبرر له على العصب خلال هذه العملية.

4. العصب النهائي ينفوسيون مجلس غرفة

1. استيعاب الطرف القريب من العصب، وإزالته من المالحة ووضع ببطء على غطاء غرفة القذف داخل فتحة مستطيلة من طوقا الداخلية، والحفاظ على التوتر لطيف على العصب كما كنت وضعها إلى أسفل بحيث تقع على التوالي.
2. ضع الشريحة الدقيقة فوق العصب مع الجانب المُقَدَّر الذي يواجه العصب، واتجاه التدفق بالتوازي مع العصب. الوجه الغطاء وتجميع microaqueduct أكثر، ووضعها داخل السكن غرفة الضخ مع الشريحة microaqueduct apposed إلى طوقا الخارجي. الآن سوف تقع العصب والطوقة الداخلية المحيطة بين غطاء وشريحة microaqueduct، والتي يتم فصلها من قبل طوقا، مع غطاء مواجهة حتى (الشكل 1B).
3. تأمين غرفة الضخ عن طريق وضعها في السكن المعدني وتناوب حلقة القفل. تأكد من أن السكن البلاستيكي هو بالكامل تحت كل مقاطع معدنية وتشديد جيدا لمنع تسرب المالحة. قد الإفراط في كسر الشريحة microaqueduct أو coverslip. اقلب الغرفة حتى يكون الغطاء متقابلاً لأسفل.
4. الاكتئاب ببطء المكبس حقنة المالحة لملء غرفة الضخ. الحفاظ على مدخل ومأخذ أنابيب، وقارورة منفذ وحقنة مرتفعة فوق الغرفة نفسها في جميع الأوقات أثناء الإعداد والتصوير. هذا يتجنب السلب، والتي يمكن أن أعرض فقاعات أو يسبب عدم الاستقرار التركيز بسبب الضغط السلبي في الغرفة.
5. نقل الجمعية perfusion إلى مرحلة المجهر المقلوب وجبل حقنة المالحة في مضخة الحقنة. بدء تشغيل المحرك بسرعة مناسبة لمعدل تدفق 0.25 مل / دقيقة. ثم قم بتوصيل وتشغيل سخان الحل في خط تعيين إلى 37 درجة مئوية.
6. توصيل سخان الهدف وتعيين إلى 37 درجة مئوية، وتطبيق النفط على الهدف، وإدراج غرفة الضخ في جبل المرحلة.
7. تطبيق النفط على وسادة سخان الغرفة وإرفاقها إلى غرفة الضخ. الاتصال وتشغيل سخان الغرفة؛ تعيين إلى 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: قد تتسبب التغيرات في درجة الحرارة في تكوين فقاعات في غرفة الضخ بسبب التفريغ من الحل. إذا شكل فقاعات، زيادة لفترة وجيزة معدل تدفق الحل من قبل 5-10x حتى فقاعات مسح الغرفة.
8. قفل غرفة الضخ في محول المرحلة وجلب النفط الهدف في اتصال مع الأغطية على الجانب السفلي من الغرفة.
   ملاحظة: غرفة Bioptechs مع محول المرحلة ASI المستخدمة هنا مصممة لتكوين المجهر مقلوب.

5. تقنية تقنية الفلورس و الاستحواذ على الصور

1. باستخدام الإضاءة في الملعب المشرق، والتركيز على طبقة من محاور على السطح السفلي من العصب الأقرب إلى سطح الغطاء (الشكل 2B). يمكن تحديد المحاور النخاعية (عادة 1 - 6 ميكرومتر في القطر في الفئران البالغة) من خلال وجود غمد المايلين ، الذي يمكن رؤيته تحت الإضاءة الخفيفة المنتقلة إلى brightfield دون تعزيز التباين. كما أن شقوق شميت- لانترمان والعقد من رانفييه واضحة بسهولة. المحاور غير المُحَلَمة هي أكثر سليحاً (عادةً < 1 ميكرومتر قطر) وهي موجودة بشكل عام في حزم (حزم Remak)، حيث تكون عموماً قريبة جداً من أن تحل من بعضها البعض.
2. إذا كان متوفرًا على المجهر، قم بتنشيط نظام التركيز التلقائي للحفاظ على التركيز خلال فترة تصوير فترة اليلة.
3. الحصول على صورة مرجع حقل مشرق. تسجيل اتجاه العصب (العمود الفقري وينتهي القريبة وينتهي) فيما يتعلق بالصور.
4. الحصول على صورة confocal باستخدام ليزر 488 نانومتر ومرشح الانبعاثات المناسبة لpaGFP (على سبيل المثال، 525/50 نانومتر) لتسجيل الفلورورس قبل التبييض. حافظ على انخفاض طاقة الليزر لتقليل حجم الإضاءة الضوئية، مع ضبط وقت التعرض وفقًا لذلك للكشف عن الإشارة الخافتة. على سبيل المثال، تم الحصول على بيانات تمثيلية بنسبة 5٪ قوة ليزر و 4 التعرض s. سجل إعدادات الامتلاك للاستخدام في جميع التجارب المستقبلية.
   ملاحظة: بعد التنشيط الضوئي، سوف تنتج إعدادات التصوير المثالية نسبة الإشارة إلى الضوضاء > 8 وphotobleaching أقل من 25٪ من الإشارة الأصلية على مدار 20 صورة. يمكن أيضا أن تكون صور محاور بواسطة المجهر واسعة epifluorescence كما فعلنا أصلا⁷، ولكن جودة الصورة ستكون أدنى بسبب عدم وجود confocality.
5. تعيين قوة الليزر إلى ما يقرب من 5x القدرة التصوير الطبيعي والحصول على صورة مع وقت التعرض من 3-4 دقائق. على الرغم من أنه ليس ضروريًا ، إلا أنه يوصى بهذه الخطوة لتبييض الفلوروستور وغيرها من مصادر الفلورا غير المرغوب فيها من أجل تقليل إشارة الخلفية وبالتالي تحقيق أقصى قدر من الإشارة إلى الضوضاء للفلوروست المعطل.
6. الحصول على صورة مع الإعدادات المستخدمة في الخطوة 5.4 لتسجيل الفلورس التلقائي قبل التنشيط بعد هذه الخطوة التبييض.
7. على الصورة brightfield، رسم خط موازي لمحور عصبي مع طول يساوي حجم نافذة التنشيط المطلوب. ويختلف طول هذه النافذة تبعا للهدف التجريبي والمعلمات، ولكن الأطوال النموذجية هي 5 ميكرومتر لنموذج الهروب النبضي و 40 ميكرومترا لنموذج انتشار النبض.
8. باستخدام هذا الخط كدليل، رسم منطقة مستطيلة من الفائدة (ROI) عبر مجال عرض عمودي على المحاور. ويجب أن تشمل المنطقة جميع المحاور التي يتعين تنشيطها ضوئيا.
9. تحديد الإعدادات المثلى لتنشيط الصور مع إضاءة 405 نانومتر.
   ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة والخطوات الفرعية فقط قبل التنشيط التجريبي الأول. يجب استخدام نفس إعدادات تنشيط الصور أثناء التجربة.
   1. تنشيط منطقة ذات أهمية مرارا وتكرارا باستخدام خط الليزر 405 نانومتر، وانخفاض قوة الليزر (على سبيل المثال، 5٪)، وبكسل يسكن الوقت (على سبيل المثال، 40 ميكروغرام)، ونبض واحد، والحصول على صورة من الفلوريس GFP تنشيط بعد كل تنشيط. كرر حتى الفلوريسين لم يعد يزيد، ومن ثم كمي الفلوريس في منطقة ذات فائدة لكل صورة.
   2. رسم كثافة الفلوريسين متوسط مقابل عدد نبض. حدد عدد النبضات التي لم تعد بعدها الفلورسنس تزيد كالعدد الأمثل للبقولات للتنشيط.
10. تنشيط paGFP fluorescence المنطقة رسمها في الخطوة 5.8 بواسطة الإثارة منقوشة مع ضوء 405 نانومتر. تأكد من أن يتم الحصول على صورة فقط قبل وبعد التنشيط.
    ملاحظة: سوف ينتج التنشيط المثالي paGFP منطقة محددة بوضوح من الفلوريسنس مع حدود حادة واردة في عائد الاستثمار.
11. بدء مؤقت 1 دقيقة كما ينتهي التنشيط. في نهاية دقيقة واحدة، ابدأ في الحصول على سلسلة فترة زمنية.
    ملاحظة: تأخير دقيقة واحدة ضروري للسماح لزيادة في الفلوريسانس التي لوحظت بعد تنشيط photoation paGFP^11. بالنسبة لطريقة انتشار النبض، تكون فترة الاقتناء التي تستغرق 5-10 دقائق مع فترات زمنية زمنية ثانية 30 كافية لقياس المنحدرات الأولية في النوافذ المركزية والضوافية لقياس السرعة والاتجاه. بالنسبة لطريقة الهروب النبضي، فإن فترة الاستحواذ من 30-150 دقيقة مع فواصل زمنية زمنية مدتها 5 أو 10 دقائق تسمح بتحليل سلوك الإيقاف المؤقت طويل الأجل للخيوط
12. حفظ جميع الصور المكتسبة، فضلا عن العائد على الاستثمار المستخدمة لتفعيل fluorescence.
13. الانتقال إلى منطقة جديدة من العصب وكرر الخطوات 5.1-5.11. إذا كانت المنطقة الجديدة على طول نفس المحور المحوري، يجب أن يكون 500 ميكرومتر على الأقل من المنطقة التي تم تنشيطها سابقاً لتجنب اكتشاف الفلورسنت العصبية التي انتقلت من المنطقة الأخرى المنشطة. يجب أن ينتهي الحصول على فترة زمنية نهائية قبل نهاية نافذة 3 ساعات.
    ملاحظة: من الممكن أن يكون الإعداد قابلاً للتطبيق لأكثر من 3 ساعات، ولكننا لم نؤكد ذلك. مع تشريح بارعة والتحضير، يمكن الحصول على ما بين خمس وثمانية 10 دقائق 10-timelapse مجموعات الصور ضمن هذه النافذة 3 ساعات.
14. بعد الحصول على سلسلة الصور الوقتية النهائية ، ووقف تدفق المالحة ، وقطع الحل وسخانات الغرفة ، وإزالة جهاز التسريب من مرحلة المجهر.

6. فلاتفيلد والغامد فيلد الحصول على صورة

1. جعل حل من الفلوريسين بإضافة 250 ملغ من مسحوق الفلوريسين إلى 0.5 مل من الماء المقطر مزدوجة. اخلطي حتى لا تكون هناك جسيمات مرئية وتدور الحل لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي من المنضدة إلى رواسب أي مادة غير محلولة. ويمكن تخزين هذا الحل لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية إذا كان محمياً من التعرض للضوء.
2. إضافة 8 μL من محلول الفلوريسين إلى شريحة وتطبيق #1.5 coverlip. لطخة السائل الزائد، وختم مع طلاء الأظافر، والسماح لتجف.
   ملاحظة: في هذا التركيز العالي، وامتصاص قوي من صبغة الفلورسين يطفئ شعاع مضيئة داخل الحل، وإنتاج مستوى رقيقة من الفلوريسنس على سطح الغطاء الذي هو على حد سواء موحدة ومقاومة لphotobleaching بسبب التبادل السريع^{نشري 12.}
3. ضع شريحة الفلوريسين على جانب الزل على مرحلة المجهر المقلوب وضبط التركيز على المستوى الرفيع من الفلوريسين على سطح الغطاء. التحرك في جميع أنحاء الشريحة للعثور على مجال الرؤية التي لا تحتوي على فقاعات الهواء (البقع الداكنة) أو جزيئات الفلورسين كبيرة (النقاط المضيئة).
4. الحصول على z-المكدس تمتد 6 μm في فواصل 0.2 μm بحيث الصورة الوسطى هي المستوى التركيز الأصلي. استخدام وقت التعرض قصيرة (على سبيل المثال، 40 مللي ثانية) لأن الفلوريسين سوف تكون مشرقة جدا. هذا الاكتساب z-المكدس ضروري لالتقاط الفلورية القصوى عبر مجال الرؤية حيث أن الغطاء نادراً ما يكون أفقيًا تمامًا و الطائرة من الفلورسين fluorescein ضيقة للغاية. كرر هذا لما مجموعه 25 حقلاً من الرؤية، تحريك المرحلة على الأقل 20 ميكرومتر في أي اتجاه بين الحقول.
5. أغلق جميع مصاريع مسار الضوء، بما في ذلك مصراع الكاميرا، واضبط طاقة الليزر ووقت التعرض إلى الصفر. احصل على 100 صورة مع هذه الإعدادات. وسيتم متوسط هذه الصور لتوليد صورة darkfield ، والتي سيتم استخدامها لتصحيح التيار المظلم والتحيز إزاحة على رقاقة الكاميرا.
   ملاحظة: إن عملية الحصول على البث هي طريقة مثالية لالتقاط هذه الصور.

7. التصوير الأعصاب التي تمنع glycolytically لتصحيح التبييض

1. جعل وأوكسيجين محلول ملحي كما في الخطوة 1؛ ومع ذلك استبدال 2-deoxy-D-الجلوكوز لD-الجلوكوز وإضافة 0.5 mM يودواسيتات الصوديوم لمنع تحلل¹³. ونحن نشير إلى هذا بأنه "ملح مثبط".
2. كرر الخطوات 2-5 باستخدام ملح ملحي المثبطة، مع صورة الفاصل الزمني 10-30 دقيقة في الخطوة 5.11. السماح 40-50 دقيقة بعد تطبيق المالحة المثبطة قبل التصوير لضمان تثبيط كامل من نقل الاعصاب.
   ملاحظة: سوف يؤدي تثبيط الجليكوليك في نهاية المطاف إلى قتل محاور عصبية بحيث يكون هناك نافذة ضيقة من الوقت بعد تثبيط التي للحصول على البيانات، وعادة حوالي 30 دقيقة. مؤشر على مستوى تثبيط الأيض هو autofluorescence فلافين من الميتوكوندريا محور عصبي، والتي يمكن الكشف عنها في سلسلة timelapse بسبب التعرض الطويل الذي نستخدمه لتصوير الفلوراس¹⁴paGFP . عادة، سوف تزداد الفلورية الذاتية الميتوكوندريا أثناء العلاج مع المالحة المثبطة. إذا بدأت الميتوكوندريا في تقريب أو تفتيت، ثم وقف التصوير.

8. معالجة الصور وتحليلها باستخدام ImageJ

1. تصحيح فيلد و Darkfield
   1. فتح المكدس صورة الحقول المظلمة ومتوسط الصور عن طريق النقر على صورة | مداخن | Z Project وتحديد متوسط الكثافة في القائمة المنسدلة لإنشاء صورة الحقول الداكنة.
   2. فتح مكدسات الصور flatfield الفلوريسين وإنشاء إسقاط أقصى كثافة من كل (25 في المجموع) عن طريق النقر على صورة | مداخن | Z المشروع وتحديد الحد الأقصى كثافة في القائمة المنسدلة.
   3. الجمع بين الناتجة 25 الصور الإسقاط الأقصى في كومة واحدة عن طريق النقر على صورة | مداخن | الصور إلى المكدس. إنشاء إسقاط متوسط كثافة هذه المجموعة من خلال النقر على صورة | مداخن | Z المشروع وتحديد متوسط كثافة من القائمة المنسدلة لتوليد صورة مسطحة.
   4. طرح صورة darkfield من صورة فيلد من خلال النقر على عملية | صورة حاسبة، تحديد طرح كـ العملية. تأكد من تحديد الخيار الناتج 32 بت (عائم). والنتيجة هي تصحيح صورة الحقول المسطحة.
   5. قياس متوسط كثافة بكسل للصورة مسطحة تصحيحها عن طريق النقر أولا تحليل | تعيين القياسات والتحقق من المربع قيمة الرمادي المتوسط، ثم الضغط على مفتاح 'm'.
   6. تقسيم صورة مسطحة تصحيحها من خلال كثافة متوسط عن طريق النقر على عملية | الرياضيات | تقسيم و إدخال متوسط قيمة الرمادية التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.1.5. وهذا سوف ينتج صورة الكسب العكسي.
   7. افتح صور ما قبل التنشيط وما بعد التنشيط مع رزمة صور فترة هاته. دمج الصور في كومة واحدة من خلال النقر على صورة | مداخن | أدوات | قم بسلسلة، وحدد الصور بترتيب زمني من القوائم المنسدلة. تأكد من عدم تحديد الخيار فتح صورة كـ 4D. المكدس الناتج هو مجموعة الصور الكاملة.
   8. كرر الخطوة 8.1.4 على مجموعة الصور الكاملة، ثم تقسيم النتيجة على الصورة كسب عكسي عن طريق النقر فوق عملية | صورة الحاسبة وتحديد تقسيم العملية. وهذا سوف تنتج مجموعة الصورة الكاملة المصححة، والتي تم تصحيح كل صورة لعدم التوحيد في مجال الإضاءة وعلى كاشف.
2. محاذاة مكدس الصور
   1. لتصحيح لاتواؤم من الطائرات صورة في سلسلة timelapse بسبب المرحلة أو عينة الانجراف، تثبيت محاذاة حسب المنطقة الثابتة البرنامج المساعد(ملف إضافي 1) عن طريق النقر على الإضافات | تثبيت PlugIn، والانتقال إلى المجلد الذي يحتوي على ملف البرنامج المساعد، واختيار البرنامج المساعد. إعادة تشغيل ImageJ بعد تثبيت البرنامج المساعد.
      ملاحظة: هذا البرنامج المساعد محاذاة الصور على أساس "المربعات الأقل congealing" مبدأ¹⁵.
   2. رسم عائد على مجموعة الصورة الكاملة المصححة التي تمتد عدة محاور عصبية ولا تتجاوز الحدود القريبة والهية للفلوروس المنشط داخل كل من المحاور. هندسة المنطقة غير مهم، ولكن باستثناء المناطق التي هياكل تغيير الشكل أو الحجم سوف يحسن المحاذاة.
   3. تشغيل البرنامج المساعد المحاذاة عن طريق النقر على الإضافات | المحاذاة حسب المنطقة الثابتة. البرنامج المساعد يضع الافتراضي 2 بكسل كحد أقصى على النزوح بين الإطارات، ولكن هذا قد يتم ضبطها في إطار منبثقة الأولية إذا كان هناك انحراف كبير من العينة. قد تستغرق المحاذاة عدة دقائق، استناداً إلى حجم مكدس الصور.
   4. فحص المكدس المحاذى بشكل مرئي لتقييم جودة المحاذاة. قد تحتاج بعض الإطارات إلى محاذاة يدوياً، حيث قد لا تعمل المحاذاة التلقائية بشكل جيد للتقلبات الكبيرة في الفلورس بين الإطارات. قد يتم إنجاز ذلك أثناء عرض إطار يجب أن يتم تحويلها بالنقر على صورة | تحويل | ترجمة. انقر فوق لا على الإطار المنبثق التالي يسأل ما إذا كان يجب ترجمة المكدس بأكمله. استخدم قيم البكسل الصحيحة فقط في الترجمة وتأكد من تعيين قائمة الاستيفاء المنسدلة إلى لا شيء، حيث أن إزاحات البكسل الكسري أو الاستيفاء ستغير البيانات بسبب إعادة تشكيل كثافة البيكسل.
   5. حفظ هذا كـ مجموعة الصور الكاملة المحاذية.
3. قياس شدة الفلور
   1. رسم عائد الاستثمار باستخدام أداة زاوية على الإطار الأول من مجموعة الصورة الكاملة الانحياز مع الذراع الأول على طول حافة واحدة من المنطقة تنشيط، عمودي على محاور، والذراع الثانية عمودي. اضغط على مفتاح 'm' لقياس الزاوية، الذي يصف اتجاه المحاور في مجال الرؤية.
   2. تعيين مقياس الصور بحيث يتم قياس الأبعاد في ميكرونين بالنقر تحليل | تعيين مقياس وإدخال القيم المناسبة.
   3. افتح مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار. للحصول على نموذج الهروب النبض، انتقل إلى الخطوة 8.3.7. لانتشار النبض، تابع الخطوة 8.3.4.
   4. رسم عائد استثمار مربع لأية أبعاد، ثم انقر فوق تحرير | اختيار | حدد. تأكد من أن يتم تحديد الخيار وحدات تحجيم ثم قم بتعيين عائد الاستثمار إلى عرض 15μm وارتفاع يساوي أو أكبر من ارتفاع الصورة.
   5. تدوير العائد على الاستثمار حسب الزاوية التي تقاس في الخطوة 8.3.1 بالنقر على تحرير | اختيار | قم بالتدوير لجعلها عمودية على المحاور، ووضع عائد الاستثمار مع جانب واحد على طول الحافة القريبة للمنطقة المنشطة. أضف عائد الاستثمار هذا، الذي سنشير إليه على أنه دليل الاستثمار القريب، إلى المدير بالضغط على مفتاح "t".
   6. اسحب عائد الاستثمار للمحاذاة مع الحافة البعيدة للمنطقة التي تم تنشيطها وإضافتها إلى مدير عائد الاستثمار مرة أخرى عن طريق الضغط على مفتاح 't'. وسوف نشير إلى هذا على أنه دليل العائد على الاستثمار. سيتم استخدام دليل تقريبي وهدّي ROIs في وقت لاحق لرسم قياس ROIs المرافق.
   7. حدد المحاور المحورية لتحديد كمي، وذلك باستخدام تسلسل صورة timelapse المكتسبة في الخطوة 5.11 أعلاه. هذا التسلسل صورة مفيدة لهذا الغرض لأنه يلتقط ضعف autofluorescence من محاور عصبية، والكشف عن مورفولوجيا خارج المنطقة المنشطة.
      ملاحظة: يتم استبعاد Axons التي لا تفي بالمعايير التالية من التحليل:
      1. يجب أن تكون أجهزة أكسون في التركيز على طول جميع نوافذ القياس.
      2. يجب أن تكون أجهزة أكسونس في حدود 5° عمودي على نهايات قريبة وهاتية من منطقة التنشيط.
      3. يجب أن لا يكون لدى أكسونات الاجتنافات داخل 5μm من نهايات قريبة وهاتية من منطقة التنشيط.
      4. استبعاد المحاور التي تغير شكل واضح أثناء التصوير.
      5. استبعاد محاور عصبية تبدو غير صحية كما يتضح من عدم وجود منطقة نشطة منفصلة في صورة ما بعد التنشيط(الشكل 2C، أسفل) ، لأن هذا يدل على التشتت الناشري للفلورسينسي المنشط ، والذي يحدث عندما يموت المحور المحوري.
   8. مراقبة التعرض الطويل تبييض الصورة من الخطوة 5.5 لهياكل ذاتية الفلورة داخل محاور. هذا الفلوريسنس ويرجع ذلك إلى فلافينز داخل الميتوكوندريا¹⁶. استبعاد محاور من التحليل إذا كانت هذه الميتوكوندريا تظهر مدورة أو مجزأة(الشكل 2D، أسفل) ، بدلا من تمديد ، والهياكل الخطية(الشكل 2D، أعلى) ، وهذا هو مؤشر على انخفاض الأيض.
   9. باستخدام دليل قريب وهد ROIs التي تم إنشاؤها أعلاه، رسم ثلاثة قياس ROIs لكل محور عصبي يجري تحليلها: نافذة مركزية تشمل محور عصبي داخل المنطقة تنشيط 40 ميكرومتر، واثنين من النوافذ الجناحة مع العرض مقيدة نافذة 15 μm ROIs يحيط والارتفاع مقيدة بقطر محور عصبي على حدود منطقة التنشيط. أضف جميع المناطق الثلاث إلى مدير عائد الاستثمار. بالنسبة لمحورات العجلة المثبطة للجليكليكيا، ارسم منطقة واحدة لا يزيد عرضها عن 5 ميكرومتر في وسط المنطقة المنشطة ولا تمتد خارج محور الدوران. بالنسبة لنموذج الهروب النبضي، فإن المنطقة المنشطة لا تتجاوز 5 ميكرومتر، لذا يجب استخدام النافذة بأكملها.
   10. كرر الخطوة 8.3.9 لكافة المحاور التي تفي بمعايير الخطوتين 8.3.7 و 8.3.8.
   11. تعيين القياسات النشطة إلى متوسط كثافة البكسل بالنقر على تحليل | تعيين القياسات وتحديد الخيار متوسط قيمة رمادية. تأكد من عدم التحقق من خيارات القياس الأخرى.
   12. حدد كل ROIs في إطار مدير العائد على الاستثمار عن طريق تحديد النافذة والضغط على 'Ctrl' + 'a'. في إطار مدير ROI، انقر على المزيد | قياس متعدد لقياس شدة الفلوريسين. نسخ البيانات من نافذة النتائج إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
   13. تعيين القياسات النشطة إلى منطقة المنطقة بالنقر فوق تحليل | تعيين القياسات وتحديد الخيار المنطقة. تأكد من عدم التحقق من خيارات القياس الأخرى.
   14. كرر الخطوة 8.3.12. من الضروري فقط نسخ صف واحد من النتائج للمنطقة ، حيث لا تختلف المنطقة معًا.

9. تصحيح فوتبلاش

1. في جدول البيانات لمحورات عصبيات مثبّتة الغليك، اطرح متوسط الفلورية للإطار 1 (إطار ما قبل التنشيط) من متوسط الفلوريكل لكل إطار بدءاً من الإطار 3 (إطار فترة زمنية أولى) لعائد الاستثمار معين. النتائج هي الخلفية طرح الوسائل.
2. رسم البيانات كـ scatterplot مع أرقام الإطار كما abscissa. احتواء خط اتجاه أسي للبيانات من كل عائد استثمار (معظم برامج جداول البيانات لها هذه الوظيفة) مع معادلة في شكل Ae^-bx. هذه المعادلة هي ما يعادل وظيفة photobleaching F_t = F₀ *^e-tɣ حيث F₀ هو الفلوريس في الإطار الأول من المهلة، ɣ هو معدل التبييض الأسي، t هو الوقت، و e هو قاعدة اللوغاريتم الطبيعية.
3. كرر الخطوات 9.1.1-9.1.2 لجميع ROIs من جميع المحاور من الأعصاب المثبطة جليكوليكلي. للحصول على تقدير أدق لمعدل الاحتراق الضوئي، استخدم ما لا يقل عن 15 محورًا عصبيًا في المجموع من 5 أعصاب منفصلة على الأقل. استخدام متوسط معدلات التبييض الأسية (ɣ) من جميع المحاور المثبطة لتصحيح البيانات التجريبية لphotobleaching. يجب إجراء معايرة تبييض جديدة لكل تجربة أو دراسة ، لأن التحسس الضوئي يعتمد على إعدادات الحصول على الصور وقوة الليزر ، والتي يمكن أن تتغير بمرور الوقت.
4. كرر الخطوة 9.1.1 لجميع مناطق محاور عصبية مصوّرة بالملحة العادية (أي لا تمنع الغليكوليكي بشكل جِلاي).
5. قم بتقسيم كل نقطة بيانات على^tɣهـ ، باستخدام الوقت لـ t ومتوسط ɣ الموجود في الخطوة 9.1.3. هذه هي وسائل تصحيح photobleach.
6. ضرب كل نقطة بيانات في المنطقة التي تهم المنطقة للعثور على الفلورس الكلي في تلك المنطقة في كل مرة.

النتائج

ويبين الشكل 3 صورا تمثيلية من تجارب الهروب النبضي وانتشار النبض. وقد نشرنا العديد من الدراسات التي تصف البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة الهروب النبضي وطرقنا لتحليل تلك البيانات^{5و66و77و88}

Discussion

ويجب توخي الحذر في تحليل تجارب الهروب النبضي وانتشار النبض لأن هناك إمكانية كبيرة لإدخال الخطأ أثناء المعالجة اللاحقة، ولا سيما أثناء التصحيح في الميدان المسطح، ومحاذاة الصور، وتصحيح التبييض. تصحيح الحقل المسطح ضروري لتصحيح عدم التوحيد في الإضاءة ، مما يؤدي إلى سقوط في كثافة عبر مجال ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors