切除小鼠神经神经纤维神经丝的成像与分析

摘要

我们描述了荧光活化方法，用于分析来自转基因小鼠的周围神经单髓轴的轴感传输，这些轴感来自转基因小鼠，这些轴线来自表达可光激活神经丝蛋白的外周神经。

摘要

神经丝蛋白聚合物以±0.35-3.5 mm/天的平均速度沿轴线传输的慢速成分的轴子移动。直到最近，这种原位运动的研究只能通过放射性同位素脉冲标记，它允许分析整个神经的电学传输与时间分辨率为天和毫米的空间分辨率。为了研究具有更高时空分辨率的神经丝体原位传输，我们开发了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠，它表示神经元中用光激活的GFP标记的神经丝质蛋白M。在这里，我们描述荧光活化脉冲逃逸和脉冲传播方法，以分析神经丝传输在单骨髓轴的三角神经从这些小鼠 前活体。通过用含氧盐水灌注和旋转圆盘共和荧光显微镜在显微镜阶段保持分离的神经段。紫光用于在短的斧头窗口中激活荧光。随着时间的推移，对激活区域和侧翼区域的荧光进行分析，从而分别研究神经丝传输与时间空间分辨率的分分钟和微米顺序。数学建模可用于从生成的数据中提取神经丝传输的动力学参数，包括速度、方向偏置和暂停行为。脉冲逃逸和脉冲传播方法也可以适应以可视化其他神经的神经丝传输。随着其他转基因小鼠的发展，这些方法还可用于成像和分析轴管和囊肿蛋白在轴子中的轴骼传输。

引言

神经丝的电弓传输在20世纪70年代首次通过放射性同位素脉冲标记^{1进行证明}。这种方法已经产生了大量有关神经丝在体内传输 的信息，但它具有相对较低的空间和时间分辨率，通常以毫米和天的顺序，充其量^2。此外，放射性同位素脉冲标记是一种间接方法，需要注射和牺牲多个动物来生成一个时间过程。随着荧光蛋白的发现和荧光显微镜在20世纪90年代的进步，它随后成为可能在培养神经元中直接成像神经丝传输的时间尺度为秒或分钟，并具有亚微米的空间分辨率，提供了对^{运动3机制的更深入的了解}。这些研究表明，轴子中的神经细合聚合物在微管运动蛋白的推动下，在反风和逆行方向上快速、间歇性地移动。然而，神经丝是衍射受限的结构，直径只有10纳米，通常与邻居相距只有几十纳米;因此，聚合物只能在含有稀疏分布神经丝的培养神经元中进行跟踪，以便移动的聚合物可以从其邻居^4中解析。因此，目前无法跟踪轴子中含有大量神经丝聚合物的单一神经丝，如骨髓轴。

为了利用荧光显微镜分析神经细细轴的轴向，我们采用荧光活化脉冲-逃逸法，研究培养神经细胞^4、5,中神经丝的长期暂停^行为。标有光激活荧光神经丝融合蛋白的神经丝在轴孔的一小段中激活，然后通过测量荧光衰变来量化这些丝从激活区域的离开速度。这种方法的优点是，它是神经丝传输的人口级分析，可以在几分钟或数小时的时间尺度上应用，而无需跟踪单个神经丝聚合物的运动。例如，我们用这种方法来分析骨髓培养物⁶中神经丝体传输的动力学。

最近，我们描述了一个hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠的发展，它表示在人类神经元特异性Thy1启动子7的控制的神经元中，paGFP标记神经丝蛋白M（paGFP-NFM）的^低水平。此小鼠允许使用荧光显微镜分析神经丝在原位传输。在这篇文章中，我们描述了用两种方法分析这些小鼠骨髓神经轴子神经纤维素的神经丝传输的实验方法。其中第一种方法是上述脉冲转义方法。此方法可以生成有关神经丝的暂停行为的信息，但对细丝离开激活区域的方向视而不见，因此不允许测量净方向性和传输速度⁸。第二种方法是一种新的脉冲传播方法，我们不仅分析来自激活区域的荧光损失，而且分析两个侧翼窗口中荧光的瞬态增加，荧光丝在离开激活区域时在逆行和逆行方向上移动。在这两种方法中，通过数学分析和测量窗口荧光变化的建模，可以获得神经丝传输参数，如平均速度、净方向性和暂停行为。 图 3说明了这两种方法。

该协议演示了神经的解剖和准备，paGFP荧光的激活和成像，以及使用 ImageJ⁹的FIFI分布包从获得的图像中对神经丝传输的定量。我们使用三元神经，因为它是长（几厘米），不分支;然而，原则上，任何神经表达paGFP-NFM是适合与这种技术，如果它可以解剖和脱套而不损害轴子。

研究方案

此处描述的所有方法都已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 神经盐水溶液的准备

1. 使100 mL的布劳尔的盐水^10:98mM NaCl，1 mM KCl，2 mM KH₂PO_4，1mM MgSO 4，1.5 mM CaCl_2，5.6%的D-葡萄糖，23.8 mM NaHCO₃在双蒸馏水中。₄
2. 使用前至少30分钟通过盐水溶液泡95%氧气/5%二氧化碳（碳原）。剩余的盐水可以在一周内重复使用;但是，在每次使用之前必须重新氧化。
3. 将含氧盐水倒入 60 mL 注射器中，并确保注射器中剩余的空气最少。

2. 神经灌注室的初始组装

1. 如图所示，将注射器和管子 连接，将流出管放入废瓶中。
2. 将外垫片放入灌注室壳体中，确保进气口和出口柱与垫片中的孔对齐。
3. 将内垫片（硅胶，100 μm 厚）放在 #1.5 圆形盖玻片（直径 40 mm）上，小心地平滑垫片中的任何皱纹，以确保密封紧密。为了便于以后组装，请将盖玻片和垫片放在纸巾上，或将垫片朝上擦拭任务。

3. 小鼠三维神经的解剖和准备

1. 通过吸入二氧化碳或其他机构认可的方法牺牲动物。当动物停止运动/呼吸时启动计时器，因为实验只能在牺牲的3小时内^进行。
2. 用70%乙醇喷洒毛皮，并尽可能多地从动物的腿上和背部使用电动剃须刀。
3. 使用一双大型解剖剪刀，在靠近脊柱中间的皮肤上做一个背部切口，并继续在动物的腹边周围切割。从这个切口开始，慢慢地反射皮肤从腿轻轻地把它从肌肉和切割筋膜。
4. 将动物放在解剖托盘上的超活位置，并固定所有四只爪子。可选固定尾部以进一步减少运动。
5. 使用微切除剪刀，在大腿肌肉的尾巴和膝盖之间做一个切口，以暴露坐骨神经。确保通过肌肉可见的神经不会被切割。
6. 将切口的骨和通风延长，以去除肌肉。同样，去除小腿的肌肉，保持切口浅和短，以避免损害神经。
7. 去除肌肉，直到双骨神经完全暴露在从坐骨神经（膝盖）分支到脚跟的点（图2A）。
   注意:在所有步骤中，包括和以下解剖的三口神经，避免不必要的暴露在环境光，以尽量减少可能附带激活paGFP在神经。
8. 用一对钳子抓住脊柱近端的三头神经，用一把微切除剪刀切割神经。注意不要把紧张放在神经上，把它从肌肉上抬起来，切掉任何附件。
9. 切开脊柱-端的三头神经，并转移到一个小的培养皿室温氧盐。从这一点在程序中，始终要保持神经的近端和远端的跟踪。
   注:这样做的一个方法就是用倾斜的切口标记神经的端端，使锥度可见。
10. 从神经的近端开始，轻轻抓住暴露的轴孔末端，用一对非常细尖的钳子。
11. 用第二对钳子，抓住神经护套，慢慢拉向神经的端端。神经护套会以最小的阻力沿着轴角滑动。确保在这个过程中不会对神经施加过度的紧张。

4. 最终神经灌注室组件

1. 抓住神经的近端，将其从盐水中去除，然后慢慢放下内垫片矩形开口内灌注室的盖玻片，在放下神经时保持柔和的张力，使神经直躺。
2. 将微槽滑过神经，凹槽侧朝向神经，且流向与神经平行。翻转盖玻片和微灌管组件，并将其放在灌注室外壳中，将微灌管滑轨与外垫片上安装。神经和周围的内垫片现在将夹在盖玻片和微桥滑之间，由垫片隔开，盖玻片朝上（图1B）。
3. 将灌注室放在金属壳体中并旋转锁环，从而固定灌注室。确保塑料外壳完全位于所有金属夹下，并拧紧，以防止盐水泄漏。过紧可能会破裂微槽滑轨或盖玻片。翻转室，使盖玻片朝下。
4. 缓慢按下盐水注射器柱塞以填充灌注室。在设置和成像过程中，请随时将进气管、出口瓶和注射器放在腔室上方。这样可以避免虹吸，因为室内有负压，可能会引入气泡或导致焦点不稳定。
5. 将灌注组件转移到倒置显微镜阶段，将盐水注射器安装到注射器泵中。以适当的速度启动电机，流量为 0.25 mL/min。然后连接并打开设置为 37°C 的在线解决方案加热器。
6. 连接目标加热器并设置为 37°C，将机油涂抹到目标上，并将灌注室插入舞台安装。
7. 将机油涂抹到腔室加热器垫上，并连接到灌注室。连接并打开腔室加热器;设置为 37 °C。
   注:温度变化可能导致灌注室中由于溶液的脱气而形成气泡。如果气泡形成，将溶液流速短暂地提高 5-10 倍，直到气泡清除腔室。
8. 将灌注室锁定到舞台适配器中，并将目标机油与腔室底面的盖玻片接触。
   注:此处使用的带 ASI 级适配器的 Bioptech 室专为倒置显微镜配置而设计。

5. 荧光激活和图像采集

1. 使用亮场照明，聚焦在最接近盖玻片表面的神经底部表面的轴子层（图 2B）。骨髓轴（在成年小鼠中直径为1-6μm）可以通过骨髓护套的存在来识别，在明亮的场透光照明下，这种护套是可见的，没有对比度增强。施密特-兰特曼的裂痕和兰维尔的节点也很容易明显。未髓轴孔更细长（通常为 <1 μm 直径），通常以捆绑方式存在（Remak 捆绑包），通常它们过于紧密，无法相互解析。
2. 如果在显微镜上可用，请激活自动对焦系统，在延时成像过程中保持对焦。
3. 获取亮场参考图像。记录神经（脊柱近端和端端）与图像的方向。
4. 使用 488 nm 激光和适用于 paGFP（例如 525/50 nm）的发射滤波器获取共和图像，以记录漂白前自动荧光。保持激光功率低，以尽量减少光漂白，并相应地调整曝光时间以检测微弱信号。例如，以 5% 的激光功率和 4 s 的曝光获得代表性数据。记录采集设置，供将来所有实验使用。
   注:光激活后，理想的成像设置将产生信号噪声比> 8，在 20 张图像中光漂白小于原始信号的 25%。轴子也可以像我们最初⁷时那样用宽场荧光显微镜成像，但是由于缺乏共和性，图像质量会低劣。
5. 将激光功率设置为大约 5 倍的正常成像功率，并获取曝光时间为 3-4 分钟的图像。虽然不重要，但建议此步骤漂白自荧光和其他不需要的荧光源，以减少背景信号，从而最大限度地提高光激活荧光的信号对噪声。
6. 使用步骤 5.4 中使用的设置获取图像，以记录此漂白步骤后激活前自动荧光。
7. 在亮场图像上，绘制一条与轴子平行的线，其长度等于所需的激活窗口大小。此窗口的长度将因实验目标和参数而异，但脉冲转义范式的典型长度为 5 μm，脉冲传播范式为 40 μm。
8. 使用此线作为参考，在垂直于轴的视场上绘制一个矩形感兴趣区域 （ROI）。该区域必须包含要照片激活的所有轴。
9. 确定使用 405 nm 照明进行照片激活的最佳设置。
   注意:仅在首次实验激活之前执行此步骤和子步骤。在实验过程中，必须使用相同的照片激活设置。
   1. 使用 405 nm 激光线、低激光功率（例如 5%）和像素停留时间（例如 40 μs）和一个脉冲反复激活感兴趣的区域，在每次激活后获取激活的 GFP 荧光图像。重复，直到荧光不再增加，然后量化每个图像感兴趣的区域中的荧光。
   2. 绘制平均荧光强度与脉冲数。选择荧光不再增加的脉冲数，作为用于激活的最佳脉冲数。
10. 通过 405 nm 光的图案激发，激活步骤 5.8 中绘制的 paGFP 荧光区域。确保在激活之前和激活后获取映像。
    注:理想的 paGFP 激活将产生一个明确定义的荧光区域，其中包含 ROI 中的清晰边界。
11. 激活完成后启动 1 分钟计时器。在 1 分钟结束时，开始获取延时系列。
    注:1分钟的延迟是必要的，以允许荧光的增加后观察到的paGFP^11光激活。对于脉冲传播方法，5-10 分钟的采集周期（30 秒延时间隔）足以测量中央和侧翼窗口中的初始坡度，以测量速度和方向性。对于脉冲转义方法，采集周期为 30-150 分钟，延时间隔为 5 或 10 分钟，可以分析细丝的长期暂停行为
12. 保存获得的所有图像，以及用于荧光激活的 ROI。
13. 移动到神经的新区域，并重复步骤 5.1-5.11。如果新区域沿同轴孔，它必须至少从先前激活的区域 500 μm，以避免检测到移出其他激活区域的荧光神经丝。最终延时的获取必须在 3 小时窗口结束之前完成。
    注:准备可能可行超过3小时，但我们尚未确认。通过熟练的解剖和准备，在这 3 小时的窗口中可以获取 5 到 8 个 10 分钟的延时图像集。
14. 获得最终延时图像系列后，停止盐水的流动，断开溶液和腔室加热器，将灌注装置从显微镜阶段取出。

6. 平地和暗场图像采集

1. 在0.5 mL的双蒸馏水中加入250毫克氟素粉，使荧光素溶液得到溶液。混合，直到没有可见的颗粒，并在桌面离心机中旋转溶液30秒，沉淀任何未溶解的材料。如果防止光线照射，此解决方案可以在 4 °C 下储存数月。
2. 在幻灯片中加入 8 μL 荧光素溶液，然后应用#1.5 盖玻片。多余液体，用指甲油密封，并允许干燥。
   注:在这个高浓度下，荧光素染料的强烈吸收会熄灭溶液中的发光束，在盖玻片表面产生一个细薄的荧光平面，由于快速扩散交换¹²，这种荧光剂既均匀又耐光漂白。
3. 将荧光素滑动盖玻片侧向下放在倒置显微镜阶段，并调整对罩滑动表面荧光薄平面的焦点。在幻灯片周围移动，查找不包含气泡（黑点）或大荧光素颗粒（亮点）的视场。
4. 以 0.2 μm 间隔获取跨越 6 μm 的 z 堆栈，使中间图像成为原始对焦平面。使用较短的曝光时间（例如 40 ms），因为荧光会非常明亮。这种 z 堆栈采集对于捕获整个视野的最大荧光是必要的，因为盖玻片很少是完全水平的，荧光的平面非常窄。对总共 25 个视场重复此步骤，在字段之间的任何方向上移动舞台至少 20 μm。
5. 关闭所有光路快门（包括相机快门），并设置激光功率和曝光时间为零。使用这些设置获取 100 个图像的堆栈。这些图像将平均生成暗场图像，该图像将用于校正暗电流和相机芯片上的偏置偏移。
   注意:流式处理采集是捕获这些图像的理想方式。

7. 成像糖基抑制神经漂白剂校正

1. 制作和氧氧盐水溶液，如步骤1;然而，用2-脱氧-D-葡萄糖代替D-葡萄糖，加入0.5 mM碘多乙酸钠抑制糖解^13。我们称之为"抑制盐水"。
2. 使用抑制性盐水重复步骤 2-5，步骤 5.11 中设置了 10-30 分钟的延时图像。在成像前，在应用抑制性盐水后40-50分钟，以确保完全抑制神经纤维运输。
   注:糖解抑制最终会杀死轴子，所以有一个狭窄的时间窗口后，抑制，其中获取数据，通常约30分钟。代谢抑制水平的指标是极线粒体的火焰自荧光，由于我们用长时间曝光来成像paGFP荧光^14，可以在延时序列中检测到这种荧光。通常，线粒体自荧光在治疗期间会增加，使用抑制性盐水。如果线粒体开始四舍五入或碎片，则停止成像。

8. 使用 ImageJ 进行图像处理和分析

1. 平场和暗场校正
   1. 打开暗场图像堆栈，通过单击"图像"来平均 图像 |堆栈 |Z 项目和 下 拉菜单 中选择"平均强度"以生成 暗场 图像。
   2. 打开荧光平地图像堆栈，通过单击"图像"创建每个（共 25 个）的最大强度投影 |堆栈 |Z 项目和 在 下拉菜单 中选择最大强度。
   3. 单击"图像" 将结果的 25 个最大投影图像合并到一个 堆栈中 |堆栈 |要堆叠的图像。单击"图像"创建此堆栈的平均强度 投影 |堆栈 |Z 项目和 从 下拉菜单 中选择平均强度以生成 平地图像。
   4. 单击"过程" 从平地图像中减去暗场 图像 |图像计算器，选择 "减 法"作为操作。确保选中 32 位（浮动） 结果选项。结果是校正的 平地图像。
   5. 通过首先单击"分析 |" 来测量校正平地图像 的平均像素强度设置" 测量"并 选中"均值 灰色"框，然后按"m"键。
   6. 通过单击"过程"将校正的平地图像除以其 平均强度 |数学 |分割 并输入步骤 7.1.5 中获得的平均灰色值。这将生成 反向增益 图像。
   7. 打开激活前和激活后映像以及延时图像堆栈。单击"图像"将图像合并到单个堆栈 中 |堆栈 |工具 |串联 ，然后按时间顺序从下拉菜单中选择图像。确保未选择 "打开为 4D 图像 "选项。生成的堆栈是 完整的图像集。
   8. 在完整图像集上重复步骤 8.1.4， 然后通过单击"处理" 将 结果除 以反向 增益图像 |图像计算器 并选择 "分割 "作为操作。这将生成 校正的完整图像集，其中每个图像都已校正为照明领域和探测器上的不均匀性。
2. 图像堆栈对齐
   1. 要更正由于阶段或样本漂移而导致的延时系列中图像平面的不对齐，请 通过单击插件 安装固定区域插件 （补充文件 1） 对齐 |安装插件，导航到包含插件文件的文件夹，并选择插件。安装插件后重新启动 ImageJ。
      注:此插件根据"最少平方凝结"原则^{15对齐图像}。
   2. 在校正的完整 图像集上绘制 ROI，该图像集跨越多个轴子，不会超出每个轴子内激活荧光的近距和距离边界。区域的几何体并不重要，但排除结构更改形状或大小的区域将改善对齐方式。
   3. 通过单击插件运行 对齐插件 |按固定区域对齐。该插件对帧之间的位移设置默认的 2 像素最大值，但如果样本有显著漂移，则可能在初始弹出窗口中调整。根据图像堆栈的大小，对齐可能需要几分钟时间。
   4. 目视检查对齐的堆栈，以评估对齐质量。然后，某些帧可能需要手动对齐，因为自动对齐对于帧之间的荧光动可能不起作用。这可以通过单击"图像" | 查看必须移动的 帧来完成。变换 |翻译。单击 下面的 弹出窗口"否"，询问是否应转换整个堆栈。在转换中仅使用整数像素值，并确保下拉插值菜单设置为 "无"，因为小数像素移位或插值将因像素强度的重新采样而更改数据。
   5. 将其保存为对齐的完整图像集。
3. 荧光强度的测量
   1. 使用对齐完整图像集的第一帧上的"角度 "工具 绘制 ROI，第一个臂沿激活区域的一条边缘垂直于轴，第二臂垂直。按"m"键测量角度，该角度描述视场中轴角的方向。
   2. 设置图像比例，以便通过单击"分析 | " 以微米为单位测量尺寸设置"缩放"并输入相应的值。
   3. 单击"分析 " 打开 ROI 管理器 |工具 |投资回报率管理器。对于脉冲转义范式，请跳到步骤 8.3.7。对于脉冲传播，继续执行步骤 8.3.4。
   4. 绘制任何维度的方形 ROI，然后单击"编辑| "选择 |指定。确保选中"缩放单位"选项，然后将 ROI 设置为 15μm 的宽度和等于或大于图像高度的高度。
   5. 单击"编辑 | "按步骤 8.3.1 中测量的角度旋转 ROI选择 |旋转 使其垂直于轴角，并沿激活区域的近边将 ROI 与一侧放置。通过按"t"键将此 ROI 添加到经理，我们将将其称为近位指南 ROI。
   6. 拖动 ROI 以与激活区域的致名边缘对齐，然后按"t"键再次添加到 ROI 管理器中。我们将将其称为"希望收益"指导投资回报率。稍后将使用近位和近距离参考线 PI 绘制齿面测量 PI。
   7. 使用上面步骤 5.11 中获取的延时图像序列选择轴子进行量化。此图像序列有助于此目的，因为它捕获轴子的弱自荧光，揭示其在激活区域外的形态。
      注:不符合以下条件的轴孔将从分析中排除:
      1. 轴孔必须沿所有测量窗口的整个长度进行聚焦。
      2. 轴孔必须位于垂直于激活区域近端和端端的 5° 范围内。
      3. 轴孔必须在激活区域的近端和近端 5μm 内没有内华。
      4. 排除在成像过程中形状明显变化的轴子。
      5. 排除在激活后图像中不存在离散激活区域（图2C，底部）中看起来不健康的轴子，因为这表明激活荧光的扩散分散，当轴孔死亡时，就会发生这种散射。
   8. 观察步骤 5.5 中的长曝光漂白图像，以观察轴子内的自发光结构。这种荧光是由于线粒体¹⁶中的飞光。如果这些线粒体呈圆形或碎片化（图2D，底部），而不是扩展的线性结构（图2D，顶部），则从分析中排除轴子，因为这是代谢下降的迹象。
   9. 使用上面创建的近角和距离指南 ROIS，绘制三个测量 ROIS 每个轴被分析:一个中央窗口，包括 40 μm 激活区域内的轴孔，和两个宽度受侧翼窗口 15 μm ROIS 约束的侧翼窗口和高度受激活区域边界处轴孔直径约束的高度。将所有三个区域添加到 ROI 管理器。对于糖基抑制轴子，在激活区域中间绘制一个不超过 5 μm 宽且不延伸到轴孔外的单个区域。对于脉冲转义范式，激活区域只有 5 μm 宽，因此必须使用整个窗口。
   10. 对于符合步骤 8.3.7 和 8.3.8 标准的所有轴子重复步骤 8.3.9。
   11. 单击"分析" 将活动测量设置为平均 像素强度 |设置"测量 "并选择 "均值灰色值" 选项。确保未检查其他测量选项。
   12. 通过选择窗口并按"Ctrl"="a"，选择 ROI 管理器窗口中的所有 ROI。在 ROI 管理器窗口中，单击" 更多" |测量 荧光强度的多度量。将数据从结果窗口复制到电子表格中，以进行进一步分析。
   13. 单击"分析 |" 将活动测量设置为 区域 |设置"测量 "并选择 "区域" 选项。确保未检查其他测量选项。
   14. 重复步骤 8.3.12。只需复制区域的一行结果，因为区域不会随时间而变化。

9. 光漂白校正

1. 在糖分抑制轴子的数据电子表格中，从给定 ROI 帧 3（第一个延时帧）开始的每个帧的均荧光中减去帧 1（预激活帧）的均荧光。结果是背景 减法的用法。
2. 将数据绘制为散点图，帧编号为 absissa。使用 Ae-bx 形式的方程，将指数趋势线与每个 ROI 中的数据（大多数电子表格程序都有 此函数）^{拟合一个指数趋势线}。此方程等效于光漂白函数 F_t = F₀ * e^-tɣ 其中 F₀ 是延时第一帧的荧光，ɣ 是指数漂白速率，t 是时间，e 是自然对数基。
3. 对于糖酸抑制神经的所有轴子的所有 ROS 重复步骤 9.1.1-9.1.2。要最准确地估计光漂白速率，请从至少 5 个独立神经中总共使用至少 15 个轴子。使用所有抑制轴的指数漂白率（ɣ）的平均值来校正光漂白的实验数据。必须对每个实验或研究进行新的漂白校准，因为光漂白取决于图像采集设置和激光功率，这些功率可能会随着时间而变化。
4. 对于用普通盐水成像的所有轴子区域重复步骤 9.1.1（即非糖基抑制）。
5. 将每个数据点除^{以tɣ-tɣ，}使用 t 的时间和步骤 9.1.3 中ɣ的平均数据点。这些是光漂白校正的指点。
6. 将每个数据点乘以该感兴趣区域的区域 ，以查找 该区域每次的总荧光。

结果

图3显示了脉冲逃逸和脉冲传播实验中的代表性图像。我们发表了几项研究，描述使用脉冲转义法获得的数据，以及分析^{这些数据的方法,}5、6、7、8、17。^6,7,8,17下面，我们将展示脉冲传播数据如何产生神经丝传输的方向性和速度信息，而我们以前没有报?...

讨论

在分析脉冲逃逸和脉冲传播实验时必须小心，因为在后处理过程中，主要是在平场校正、图像对齐和漂白校正期间，存在引入误差的巨大潜力。平场校正对于校正照明中的不均匀性是必要的，这会导致从中心到外围的视野强度下降。非均匀性的程度取决于波长，因此，应始终以用于获取实验数据的波长执行。必须确保平场图像中的不均匀性真正代表要校正的图像中的不均匀性。脉冲传播实验特别?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors