需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。
Method Article
我们描述了荧光活化方法,用于分析来自转基因小鼠的周围神经单髓轴的轴感传输,这些轴感来自转基因小鼠,这些轴线来自表达可光激活神经丝蛋白的外周神经。
神经丝蛋白聚合物以±0.35-3.5 mm/天的平均速度沿轴线传输的慢速成分的轴子移动。直到最近,这种原位运动的研究只能通过放射性同位素脉冲标记,它允许分析整个神经的电学传输与时间分辨率为天和毫米的空间分辨率。为了研究具有更高时空分辨率的神经丝体原位传输,我们开发了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠,它表示神经元中用光激活的GFP标记的神经丝质蛋白M。在这里,我们描述荧光活化脉冲逃逸和脉冲传播方法,以分析神经丝传输在单骨髓轴的三角神经从这些小鼠 前活体。通过用含氧盐水灌注和旋转圆盘共和荧光显微镜在显微镜阶段保持分离的神经段。紫光用于在短的斧头窗口中激活荧光。随着时间的推移,对激活区域和侧翼区域的荧光进行分析,从而分别研究神经丝传输与时间空间分辨率的分分钟和微米顺序。数学建模可用于从生成的数据中提取神经丝传输的动力学参数,包括速度、方向偏置和暂停行为。脉冲逃逸和脉冲传播方法也可以适应以可视化其他神经的神经丝传输。随着其他转基因小鼠的发展,这些方法还可用于成像和分析轴管和囊肿蛋白在轴子中的轴骼传输。
神经丝的电弓传输在20世纪70年代首次通过放射性同位素脉冲标记1进行证明。这种方法已经产生了大量有关神经丝在体内传输 的信息,但它具有相对较低的空间和时间分辨率,通常以毫米和天的顺序,充其量2。此外,放射性同位素脉冲标记是一种间接方法,需要注射和牺牲多个动物来生成一个时间过程。随着荧光蛋白的发现和荧光显微镜在20世纪90年代的进步,它随后成为可能在培养神经元中直接成像神经丝传输的时间尺度为秒或分钟,并具有亚微米的空间分辨率,提供了对运动3机制的更深入的了解。这些研究表明,轴子中的神经细合聚合物在微管运动蛋白的推动下,在反风和逆行方向上快速、间歇性地移动。然而,神经丝是衍射受限的结构,直径只有10纳米,通常与邻居相距只有几十纳米;因此,聚合物只能在含有稀疏分布神经丝的培养神经元中进行跟踪,以便移动的聚合物可以从其邻居4中解析。因此,目前无法跟踪轴子中含有大量神经丝聚合物的单一神经丝,如骨髓轴。
为了利用荧光显微镜分析神经细细轴的轴向,我们采用荧光活化脉冲-逃逸法,研究培养神经细胞4、5,中神经丝的长期暂停行为。标有光激活荧光神经丝融合蛋白的神经丝在轴孔的一小段中激活,然后通过测量荧光衰变来量化这些丝从激活区域的离开速度。这种方法的优点是,它是神经丝传输的人口级分析,可以在几分钟或数小时的时间尺度上应用,而无需跟踪单个神经丝聚合物的运动。例如,我们用这种方法来分析骨髓培养物6中神经丝体传输的动力学。
最近,我们描述了一个hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠的发展,它表示在人类神经元特异性Thy1启动子7的控制的神经元中,paGFP标记神经丝蛋白M(paGFP-NFM)的低水平。此小鼠允许使用荧光显微镜分析神经丝在原位传输。在这篇文章中,我们描述了用两种方法分析这些小鼠骨髓神经轴子神经纤维素的神经丝传输的实验方法。其中第一种方法是上述脉冲转义方法。此方法可以生成有关神经丝的暂停行为的信息,但对细丝离开激活区域的方向视而不见,因此不允许测量净方向性和传输速度8。第二种方法是一种新的脉冲传播方法,我们不仅分析来自激活区域的荧光损失,而且分析两个侧翼窗口中荧光的瞬态增加,荧光丝在离开激活区域时在逆行和逆行方向上移动。在这两种方法中,通过数学分析和测量窗口荧光变化的建模,可以获得神经丝传输参数,如平均速度、净方向性和暂停行为。 图 3说明了这两种方法。
该协议演示了神经的解剖和准备,paGFP荧光的激活和成像,以及使用 ImageJ9的FIFI分布包从获得的图像中对神经丝传输的定量。我们使用三元神经,因为它是长(几厘米),不分支;然而,原则上,任何神经表达paGFP-NFM是适合与这种技术,如果它可以解剖和脱套而不损害轴子。
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
此处描述的所有方法都已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
1. 神经盐水溶液的准备
2. 神经灌注室的初始组装
3. 小鼠三维神经的解剖和准备
4. 最终神经灌注室组件
5. 荧光激活和图像采集
6. 平地和暗场图像采集
7. 成像糖基抑制神经漂白剂校正
8. 使用 ImageJ 进行图像处理和分析
9. 光漂白校正
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
图3显示了脉冲逃逸和脉冲传播实验中的代表性图像。我们发表了几项研究,描述使用脉冲转义法获得的数据,以及分析这些数据的方法,5、6、7、8、17。6,7,8,17下面,我们将展示脉冲传播数据如何产生神经丝传输的方向性和速度信息,而我们以前没有报?...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
在分析脉冲逃逸和脉冲传播实验时必须小心,因为在后处理过程中,主要是在平场校正、图像对齐和漂白校正期间,存在引入误差的巨大潜力。平场校正对于校正照明中的不均匀性是必要的,这会导致从中心到外围的视野强度下降。非均匀性的程度取决于波长,因此,应始终以用于获取实验数据的波长执行。必须确保平场图像中的不均匀性真正代表要校正的图像中的不均匀性。脉冲传播实验特别?...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
作者没有什么可透露的。
作者要感谢保拉·蒙斯玛在共声显微镜和三口神经解剖方面的指导和协助,感谢Atsuko Uchida博士、Chloe Duger和Sana Chahande博士对小鼠饲养的帮助。这项工作得到了国家科学基金会合作资助IOS1656784至B.B. IOS1656765 向 P.J. 和国家卫生研究院提供 R01 NS038526、P30 NS104177 和 S10 OD010383 到 A.B. N.P.B. 的奖学金得到了俄亥俄州立大学校长博士后学者计划的资助。
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
Calcium chloride | Fisher | C79 | |
Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
Potassium chloride | Fisher | P217 | |
Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。