Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Riepilogo

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Abstract

I polimeri proteici neurofilamenti si muovono lungo gli assoni nella componente lenta del trasporto assonale a velocità medie di 0,35-3,5 mm al giorno. Fino a poco tempo fa lo studio di questo movimento in situ era possibile solo utilizzando l'etichettatura a impulsi radioisotopica, che permette l'analisi del trasporto assonale in nervi interi con una risoluzione temporale di giorni e una risoluzione spaziale di millimetri. Per studiare il trasporto di neurofilamenti in situ con una risoluzione temporale e spaziale più elevata, abbiamo sviluppato un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime la proteina neurofilamento M etichettata con GFP fotoattivabile nei neuroni. Qui descriviamo i metodi di fluorescenza fotoattivazione impulso-fuga e pulsazione-spread per analizzare il trasporto neurofilamento in assoni mielinati singoli di nervi tibiali da questi topi ex vivo. I segmenti nervosi isolati vengono mantenuti sullo stadio del microscopio per perfusione con salina ossigenata e immagini di microscopia a fluorescenza confocale del disco rotante. La luce viola viene utilizzata per attivare la fluorescenza in una breve finestra assonale. La fluorescenza nelle regioni attivate e fiancheggiate viene analizzata nel tempo, permettendo lo studio del trasporto neurofilamento con risoluzione temporale e spaziale rispettivamente nell'ordine dei minuti e dei micron. La modellazione matematica può essere utilizzata per estrarre i parametri cinetici del trasporto neurofilamento, tra cui la velocità, la distorsione direzionale e il comportamento di pausa dai dati risultanti. I metodi di fuga di impulsi e di diffusione del polso possono anche essere adattati per visualizzare il trasporto di neurofilamenti in altri nervi. Con lo sviluppo di topi transgenici aggiuntivi, questi metodi potrebbero anche essere utilizzati per immagini e analisi del trasporto assonale di altre proteine citoscheschescheschesche e citosoliche negli assoni.

Introduzione

Il trasporto assonale dei neurofilamenti è stato dimostrato per la prima volta negli anni '70 mediante l'etichettatura radioisotopica a impulsi¹. Questo approccio ha prodotto una ricchezza di informazioni sul trasporto neurofilamento in vivo, ma ha una risoluzione spaziale e temporale relativamente bassa, in genere nell'ordine di millimetri e giorni al meglio². Inoltre, l'etichettatura radioisotopica degli impulsi è un approccio indiretto che richiede l'iniezione e il sacrificio di più animali per generare un singolo corso di tempo. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e i progressi nella microscopia a fluorescenza negli anni '90, è diventato successivamente possibile immagine del trasporto neurofilamento direttamente nei neuroni ri culture su una scala temporale di secondi o minuti e con risoluzione spaziale sub-micrometrica, offrendo una visione molto maggiore del meccanismo del movimento³. Questi studi hanno rivelato che i polimeri neurofilament negli assoni si muovono rapidamente e ad intermittenza sia in direzioni anterograde che retrograde lungo le tracce di microtubuli, spinte dalle proteine motorie dei microtubuli. Tuttavia, i neurofilamenti sono strutture limitate alla diffrazione di soli 10 nm di diametro che sono tipicamente distanziate dai loro vicini da solo decine di nanometri; pertanto, i polimeri possono essere tracciati solo in neuroni ri culture che contengono neurofilamenti scarsamente distribuiti in modo che i polimeri in movimento possano essere risolti dai loro vicini⁴. Pertanto, non è attualmente possibile tracciare singoli neurofilamenti in assoni che contengono abbondanti polimeri neurofilament, come gli assoni mielinati.

Per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni ricchi di neurofilamenti utilizzando la microscopia a fluorescenza, usiamo un metodo di sfuggimento a impulsi di fotoattivazione fluorescenza che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento di pausa a lungo termine dei neurofilamenti nelle cellule nervose^{pianate 4,5}. I neurofilamenti contrassegnati con una proteina di fusione del neurofilamento fluorescente fotoattivabile vengono attivati in un breve segmento di assone, e quindi il tasso di partenza di tali filamenti dalla regione attivata viene quantificato misurando il decadimento della fluorescenza nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che si tratta di un'analisi a livello di popolazione del trasporto neurofilamento che può essere applicata su una scala temporale di minuti o ore senza la necessità di monitorare il movimento dei singoli polimeri neurofilament. Ad esempio, abbiamo usato questo metodo per analizzare la cinetica del trasporto neurofilamento nelle culture mielinanti⁶.

Recentemente, abbiamo descritto lo sviluppo di un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime bassi livelli di una proteina neurofilamento con tag paGFP M (paGFP-NFM) nei neuroni sotto il controllo del promotore Thy1 specifico del neurone^{umano 7}. Questo topo permette l'analisi del trasporto di neurofilamenti in situ utilizzando la microscopia a fluorescenza. In questo articolo, descriviamo gli approcci sperimentali per l'analisi del trasporto di neurofilamenti in assoni mielinati di nervi tibiali da questi topi utilizzando due approcci. Il primo di questi approcci è il metodo di fuga a impulsi descritto in precedenza. Questo metodo può generare informazioni sul comportamento di pausa dei neurofilamenti, ma è cieco alla direzione in cui i filamenti lasciano la regione attivata e pertanto non consente la misurazione della direzionalità netta e della velocità di^{trasporto 8}. Il secondo di questi approcci è un nuovo metodo di diffusione dell'impulso in cui analizziamo non solo la perdita di fluorescenza dalla regione attivata, ma anche l'aumento transitorio della fluorescenza in due finestre di fiancheggiamento attraverso le quali i filamenti fluorescenti si muovono mentre partono dalla regione attivata sia in direzioni anterograde che retrograde. In entrambi gli approcci, i parametri del trasporto neurofilamento come la velocità media, la direzionalità netta e il comportamento di pausa possono essere ottenuti utilizzando l'analisi matematica e la modellazione dei cambiamenti nella fluorescenza nelle finestre di misurazione. Figura 3 illustra questi due approcci.

Questo protocollo dimostra la dissezione e la preparazione del nervo, l'attivazione e l'imaging della fluorescenza paGFP e la quantificazione del trasporto neurofilamento dalle immagini acquisite utilizzando il pacchetto di distribuzione FIJI di ImageJ⁹. Usiamo il nervo tibiale perché è lungo (diversi cm) e non si ramifica; tuttavia, in linea di principio qualsiasi nervo che esprime paGFP-NFM è appropriato per l'uso con questa tecnica se può essere sezionato e de-tireggiato senza danneggiare gli assoni.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University.

1. Preparazione della soluzione salina nervosa

1. Fare 100 mL di salina di Breuer¹⁰: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 1,5 mM CaCl₂, 5.6% D-glucosio, 23,8 mM NaHCO₃ in acqua a doppia distillazione.
2. Bolla 95% ossigeno/5% di anidride carbonica (carbogen) attraverso la soluzione salina per almeno 30 minuti prima dell'uso. La salina rimasta può essere riutilizzata entro una settimana; tuttavia, deve essere reoxygenated prima di ogni uso.
3. Versare salina ossigenata in una siringa da 60 mL e assicurarsi che nella siringa rimane un'aria minima.

2. Assemblaggio iniziale della camera di perfusione nervosa

1. Collegare la siringa e il tubo come mostrato nella Figura 1A, collocando il tubo di deflusso in una fiaschetta di scarto.
2. Posizionare la guarnizione esterna nell'alloggiamento della camera di perfusione, assicurando che l'ingresso del flusso e i pali di uscita siano allineati con i fori nella guarnizione.
3. Disporre la guarnizione interna (silicone, 100 m di spessore) su un coperture circolari di #1,5 (diametro 40 mm), appianare con cura eventuali rughe nella guarnizione per garantire una tenuta stretta. Per facilitare l'assemblaggio successivo, posizionare il coperture e la guarnizione su un tovagliolo di carta o pulire le attività con la guarnizione rivolta verso l'alto.

3. Dissezione e preparazione del nervo tibiale del topo

1. Sacrificare l'animale per inalazione di biossido di carbonio o un altro metodo approvato istituzionalmente. Avviare un timer quando l'animale cessa il movimento / respirazione, come esperimenti devono essere condotti solo entro 3 ore di sacrificio⁷.
2. Spruzzare la pelliccia con il 70% di etanolo e rimuovere il più possibile dalle gambe dell'animale e tornare utilizzando un rasoio elettrico.
3. Utilizzando un paio di grandi forbici di dissezione, fare un'incisione dorsale nella pelle vicino al centro della colonna vertebrale e continuare il taglio intorno all'aspetto ventrale dell'animale. Partendo da questo taglio, riflettere lentamente la pelle dalle gambe tirando delicatamente lontano dal muscolo e tagliando la fascia.
4. Posizionare l'animale in posizione supina su un vassoio di dissezione e fissare tutte e quattro le zampe. Facoltativamente, fissare la coda per ridurre ulteriormente il movimento.
5. Utilizzando le forbici della microsezione, fare un'incisione nei muscoli della coscia a metà strada tra la coda e il ginocchio per esporre il nervo sciatico. Assicurarsi che il nervo, che è visibile attraverso il muscolo, non è tagliato.
6. Estendere l'incisione dorsalmente e ventricalmente per rimuovere il muscolo. Allo stesso modo, rimuovere i muscoli del polpaccio, mantenendo tagli poco profondi e corti per evitare di danneggiare il nervo.
7. Rimuovere i muscoli fino a quando il nervo tibiale è completamente esposto dal punto in cui si dirama dal nervo sciatico (al ginocchio) al tallone (Figura 2A).
   NOTA: In tutte le fasi, inclusa e dopo la dissezione del nervo tibiale, evitare un'esposizione non necessaria alla luce ambientale per ridurre al minimo la possibile attivazione incidentale del paGFP nel nervo.
8. Afferrare il nervo tibiale all'estremità prossimale della colonna vertebrale con un paio di forbici e tagliare il nervo utilizzando un paio di forbici microdisssection. Fare attenzione a non mettere la tensione sul nervo, sollevarlo dal muscolo, tagliando eventuali allegati.
9. Tagliare l'estremità distale della colonna vertebrale del nervo tibiale e trasferire in un piccolo piatto Petri di temperatura ambiente ossigenato salino. Da questo punto in poi nella procedura, essere sempre certi di tenere traccia delle estremità prossimali e distale del nervo.
   NOTA: Un modo per farlo è quello di contrassegnare l'estremità distale del nervo con un taglio angolato in modo che il cono sia visibile.
10. Partendo dall'estremità prossimale del nervo, afferrare delicatamente l'assone esposto termina con un paio di punte molto fini.
11. Con un secondo paio di forcep, afferrare la foce del nervo proximally, e tirare lentamente verso l'estremità distale del nervo. La fale del nervo scivolerà lungo gli assoni con una resistenza minima. Assicurarsi che nessuna tensione indebita viene applicata al nervo durante questo processo.

4. Assemblaggio finale della camera per la perfusione dei nervi

1. Afferrando l'estremità prossimale del nervo, rimuoverlo dalla salina e stenderlo lentamente sul coperture della camera di perfusione all'interno dell'apertura rettangolare della guarnizione interna, mantenendo una leggera tensione sul nervo mentre lo si posa in modo che si trovi dritto.
2. Posizionare lo scivolo del microaqueduct sul nervo con il lato scanalato rivolto verso il nervo e la direzione del flusso parallela al nervo. Capovolgere l'assieme coverslip e microaqueduct e posizionarlo all'interno dell'alloggiamento della camera di perfusione con lo scivolo del microaquedotto apposito alla guarnizione esterna. Il nervo e la guarnizione interna circostante saranno ora inseriti tra il coverslip e lo scivolo del microaqueduct, che sono separati dalla guarnizione, con il coverslip rivolto verso l'alto (Figura 1B).
3. Fissare la camera di perfusione posizionandolo nell'alloggiamento metallico e ruotando l'anello di bloccaggio. Assicurarsi che l'alloggiamento in plastica sia completamente sotto tutte le clip metalliche e stringere bene per evitare perdite saline. L'overtightening può rompere il scivolo del microaqueduct o coverslip. Capovolgere la camera in modo che il coverslip è rivolto verso il basso.
4. Deprimere lentamente lo stantuffo di siringhe salina per riempire la camera di perfusione. Mantenere sempre il tubo di ingresso e di uscita, il flacone di uscita e la siringa sopra la camera stessa durante la configurazione e l'imaging. Questo evita il sifone, che può introdurre bolle o causare instabilità della messa a fuoco a causa della pressione negativa nella camera.
5. Trasferire l'assieme di perfusione in uno stadio di microscopio invertito e montare la siringa salina nella pompa della siringa. Avviare il motore ad una velocità appropriata per una velocità di flusso di 0,25 mL/min. Quindi collegare e accendere il riscaldatore di soluzione in linea impostato su 37 gradi centigradi.
6. Collegare il riscaldatore obiettivo e impostare a 37 gradi centigradi, applicare l'olio per l'obiettivo, e inserire la camera di perfusione nel supporto palco.
7. Applicare l'olio sul cuscinetto del riscaldatore a camera e attaccarlo alla camera di perfusione. Collegare e accendere il riscaldatore a camera; impostato su 37 gradi centigradi.
   NOTA: I cambiamenti di temperatura possono causare la formarsi di bolle nella camera di perfusione a causa dell'outgassing della soluzione. Se si formano bolle, aumentare brevemente la velocità di flusso della soluzione di 5-10x fino a quando le bolle non sgombiscono la camera.
8. Bloccare la camera di perfusione nell'adattatore palco e portare l'olio obiettivo a contatto con il coperture sul lato inferiore della camera.
   NOTA: La camera Bioptechs con adattatore di fase ASI utilizzato qui è progettata per una configurazione al microscopio invertita.

5. Attivazione della fluorescenza e acquisizione di immagini

1. Utilizzando l'illuminazione a campo luminoso, concentrarsi sullo strato di assoni sulla superficie inferiore del nervo più vicino alla superficie coverslip (Figura 2B). Gli assoni mielinati (tipicamente da 1 a 6 m di diametro nei topi adulti) possono essere identificati dalla presenza di una fava di mielina, visibile sotto l'illuminazione luminosa trasmessa dal campo luminoso senza miglioramento del contrasto. Anche le fessure e i nodi di Ranvier sono facilmente evidenti. Gli assoni non nemiati sono più sottili (in genere <1 diametro) e sono generalmente presenti in fasci (fasci Di Remak), dove sono generalmente troppo strettamente appostati per essere risolti l'uno dall'altro.
2. Se disponibile al microscopio, attivare il sistema di messa a fuoco automatica per mantenere la messa a fuoco nel corso dell'imaging timelapse.
3. Acquisire un'immagine di riferimento del campo luminoso. Registrare l'orientamento del nervo (estremità prossimali e distale) rispetto alle immagini.
4. Acquisire un'immagine confocale utilizzando un laser a 488 nm e un filtro di emissione appropriato per paGFP (ad esempio, 525/50 nm) per registrare l'autofluorescence pre-candeggina. Mantenere bassa la potenza del laser per ridurre al minimo il fotobleaching, con il tempo di esposizione regolato di conseguenza per rilevare il segnale debole. Ad esempio, i dati rappresentativi sono stati acquisiti con una potenza laser del 5% e 4 esposizioni. Registrare le impostazioni di acquisizione da utilizzare in tutti gli esperimenti futuri.
   NOTA: dopo la fotoattivazione, le impostazioni di imaging ideali produrranno un rapporto segnale-rumore > 8 e fotosaccaggi di meno del 25% del segnale originale nel corso di 20 immagini. Gli assoni possono anche essere immagini da microscopia epifluorescenza widefield come abbiamo fatto^{in origine 7}, ma la qualità dell'immagine sarà inferiore a causa della mancanza di confocalità.
5. Impostare la potenza del laser su circa 5 volte la normale potenza di imaging e acquisire un'immagine con un tempo di esposizione di 3-4 minuti. Anche se non essenziale, questo passaggio è raccomandato per sbiancare l'autofluorescenza e altre fonti di fluorescenza indesiderata al fine di ridurre il segnale di fondo e quindi massimizzare il segnale-rumore della fluorescenza fotoattivata.
6. Acquisire un'immagine con le impostazioni utilizzate nel passaggio 5.4 per registrare l'autofluorescenza di pre-attivazione dopo questo passaggio di sbiancamento.
7. Sull'immagine del campo luminoso, disegnare una linea parallela agli assoni con una lunghezza uguale alle dimensioni desiderate della finestra di attivazione. La lunghezza di questa finestra varia a seconda dell'obiettivo sperimentale e dei parametri, ma le lunghezze tipiche sono di 5 m per il paradigma di fuga-impulso e di 40 m per il paradigma di diffusione dell'impulso.
8. Utilizzando questa linea come guida, disegnare una regione rettangolare di interesse (ROI) attraverso il campo di vista perpendicolare agli assoni. La regione deve comprendere tutti gli assoni da fotoattivare.
9. Determinare le impostazioni ottimali per la fotoattivazione con illuminazione a 405 nm.
   NOTA: eseguire questo passaggio e sotto-passaggi solo prima della prima attivazione sperimentale. Nel corso di un esperimento, è necessario utilizzare le stesse impostazioni di fotoattivazione.
   1. Attivare ripetutamente una regione di interesse utilizzando la linea laser da 405 nm, la bassa potenza laser (ad esempio, il 5%) e il tempo di dimora dei pixel (ad esempio, 40 s) e un impulso, acquisendo un'immagine della fluorescenza GFP attivata dopo ogni attivazione. Ripetere fino a quando la fluorescenza non aumenta più, e quindi quantificare la fluorescenza in una regione di interesse per ogni immagine.
   2. Tracciare l'intensità media della fluorescenza rispetto al numero di impulsi. Selezionare il numero di impulsi dopo i quali la fluorescenza non aumenta più con il numero ottimale di impulsi per l'attivazione.
10. Attivare la fluorescenza paGFP della regione disegnata al punto 5.8 da eccitazione a motivi modellati con luce da 405 nm. Assicurarsi che un'immagine venga acquisita appena prima e subito dopo l'attivazione.
    NOTA: L'attivazione paGFP ideale produrrà una regione di fluorescenza chiaramente definita con confini taglienti contenuti all'interno del ROI.
11. Avviare un timer di 1 minuto al termine dell'attivazione. Alla fine di 1 minuto, iniziare l'acquisizione di una serie timelapse.
    NOTA: Il ritardo di 1 minuto è necessario per consentire l'aumento della fluorescenza che si osserva dopo la fotoattivazione di paGFP¹¹. Per il metodo di diffusione dell'impulso, un periodo di acquisizione di 5-10 minuti con intervalli timelapse di 30 secondi è sufficiente per misurare le pendenze iniziali nelle finestre centrali e di fianco per misurare la velocità e la direzionalità. Per il metodo di fuga a impulsi, un periodo di acquisizione di 30-150 minuti con intervalli timelapse di 5 o 10 minuti consente l'analisi del comportamento di pausa a lungo termine dei filamenti
12. Salva tutte le immagini acquisite, così come il ROI utilizzato per l'attivazione della fluorescenza.
13. Spostarsi in una nuova area del nervo e ripetere i passaggi 5.1-5.11. Se la nuova regione si trova lungo lo stesso assone, deve essere di almeno 500 m dalla regione precedentemente attivata per evitare il rilevamento di neurofilamenti fluorescenti che si sono spostati dall'altra regione attivata. L'acquisizione del timelapse finale deve terminare prima della fine della finestra di 3 ore.
    NOTA: È possibile che la preparazione possa essere praticabile per più di 3 ore, ma non l'abbiamo confermato. Con una dissezione e una preparazione abili, è possibile acquisire tra cinque e otto set di immagini timelapse da 10 minuti all'interno di questa finestra di 3 ore.
14. Dopo aver acquisito l'ultima serie di immagini timelapse, arrestare il flusso di salina, scollegare la soluzione e i riscaldatori da camera e rimuovere l'apparato di perfusione dallo stadio del microscopio.

6. Acquisizione di immagini Flatfield e darkfield

1. Fare una soluzione di fluoresceina aggiungendo 250 mg di polvere di fluoresceina a 0,5 mL di acqua doppia distillata. Mescolare fino a quando non ci sono particelle visibili e girare la soluzione per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per sedimentare qualsiasi materiale non risolto. Questa soluzione può essere conservata per diversi mesi a 4 gradi centigradi se protetta dall'esposizione alla luce.
2. Aggiungere 8 SL di soluzione di fluoresceina a una diapositiva e applicare un #1.5 coverslip. Macchiare il liquido in eccesso, sigillare con smalto e lasciare asciugare.
   NOTA: A questa alta concentrazione, il forte assorbimento del colorante a fluoresina spegne il fascio illuminante all'interno della soluzione, producendo un sottile piano di fluorescenza sulla superficie del coperture che è sia uniforme e resistente al fotobleaching a causa del rapido scambio di diffusione¹².
3. Posizionare la diapositiva a fluoresina sul lato destro sul microscopio invertito e regolare la messa a fuoco sul piano sottile di fluorescenza sulla superficie del cosore. Spostarsi nella diapositiva per trovare un campo di vista che non contenga bolle d'aria (macchie scure) o grandi particelle di fluoresceina (punti luminosi).
4. Acquisire una pila z che si estende su 6 m a intervalli di 0,2 m in modo che l'immagine centrale sia il piano di messa a fuoco originale. Utilizzare un breve tempo di esposizione (ad esempio, 40 ms) perché la fluorescenza sarà molto luminosa. Questa acquisizione z-stack è necessaria per catturare la fluorescenza massima attraverso il campo di vista come il coverslip è raramente perfettamente orizzontale e il piano di fluorescenza fluoresceina è molto stretto. Ripetere questa operazione per un totale di 25 campi di visualizzazione, spostando lo stage di almeno 20 m in qualsiasi direzione tra i campi.
5. Chiudere tutte le persiane del percorso di luce, incluso l'otturatore della fotocamera, e impostare la potenza laser e il tempo di esposizione su zero. Acquisire una pila di 100 immagini con queste impostazioni. Queste immagini verranno mediate per generare l'immagine darkfield, che verrà utilizzata per correggere la corrente scura e l'offset di distorsione sul chip della fotocamera.
   NOTA: l'acquisizione in streaming è un modo ideale per acquisire queste immagini.

7. Imaging dei nervi inibiti glicoliticamente per la correzione della candeggina

1. Rendere e ossigenare una soluzione salina come nel passaggio 1; tuttavia sostituire 2-deossi-D-glucosio per D-glucosio e aggiungere 0,5 mM di iodoacetato di sodio per inibire la glicolysis¹³. Ci riferiamo a questo come "salina inibitoria".
2. Ripetere i passaggi da 2 a 5 utilizzando la salina inibitoria, con un'immagine timelapse di 10-30 minuti impostata nel passaggio 5.11. Lasciare 40-50 minuti dopo l'applicazione della salina inibitoria prima dell'imaging per garantire la completa inibizione del trasporto neurofilamento.
   NOTA: L'inibizione glicotica alla fine ucciderà gli assoni, quindi c'è una stretta finestra di tempo dopo l'inibizione in cui acquisire i dati, in genere circa 30 minuti. Un indicatore del livello di inibizione metabolica è l'autofluorescenza flavina dei mitocondri assonali, che può essere rilevata nella serie timelapse a causa delle lunghe esposizioni che usiamo per immagine della fluorescenza paGFP¹⁴. Tipicamente, l'autofluorescenza mitocondriale aumenterà durante il trattamento con salina inibitoria. Se i mitocondri iniziano ad arrotondare o frammentare, quindi cessare l'imaging.

8. Elaborazione e analisi delle immagini mediante ImageJ

1. Correzione di Flatfield e darkfield
   1. Aprire la pila di immagini darkfield e mediare le immagini facendo clic su Immagine . Proprietà Stacks . Progetto e selezione Intensità media nel menu a discesa per generare l'immagine darkfield.
   2. Aprire le pile di immagini a campo piatto fluoresceina e creare una proiezione di intensità massima di ciascuno (25 in totale) facendo clic su Immagine . Proprietà Stacks . Progetto e selezionando Intensità massima nel menu a discesa.
   3. Combinare le 25 immagini di proiezione massime risultanti in un'unica pila facendo clic su Immagine . Proprietà Stacks . Immagini da impilare. Creare una proiezione di intensità media di questa pila facendo clic su Immagine . Proprietà Stacks . Progetto e selezionando Intensità media dal menu a discesa per generare l'immagine del campo piatto.
   4. Sottrarre l'immagine del campo scuro dall'immagine del campo piatto facendo clic su Processo . Calcolatrice immagine, selezionando Sottrai come operazione. Assicurarsi che l'opzione risultato a 32 bit (float) sia selezionata. Il risultato è l'immagine flatfield corretta.
   5. Misurare l'intensità media in pixel dell'immagine a campo piatto corretta facendo clic su Analizza Impostare Misure e selezionare la casella Valore grigio medio, quindi premere il tasto 'm'.
   6. Dividere l'immagine del campo piatto corretta per la sua intensità media facendo clic su Processo Proprietà Math . Dividere e immettere il valore grigio medio ottenuto al punto 7.1.5. Questo produrrà l'immagine di guadagno inverso.
   7. Aprire le immagini di pre-attivazione e post-attivazione insieme allo stack di immagini timelapse. Combinare le immagini in un'unica pila facendo clic su Immagine . Proprietà Stacks . Strumenti - Strumenti Concatenaree selezionare le immagini in ordine cronologico dai menu a discesa. Assicurarsi che l'opzione Apri come immagine 4D non sia selezionata. Lo stack risultante è il set di immagini completo.
   8. Ripetere il passaggio 8.1.4 sul set di immagini completo, quindidividere il risultato per l'immagine del guadagno inverso facendo clic su Elabora . Calcolatrice immagine e selezionando Dividi come operazione. Questo produrrà il set completo di immagini corretto,in cui ogni immagine è stata corretta per la non uniformità nel campo dell'illuminazione e sul rivelatore.
2. Allineamento dello stack di immagini
   1. Per correggere il disallineamento dei piani dell'immagine nella serie timelapse a causa della deriva dello stage o del campione, installare il plug-in Allineamento per regione fissa (File supplementare 1) facendo clic su Plugins . Installare PlugIn, passare alla cartella contenente il file del plug-in e selezionare il plug-in. Riavviare ImageJ dopo l'installazione del plug-in.
      NOTA: Questo plugin allinea le immagini in base al principio "meno quadrati"¹⁵.
   2. Disegnare un ROI sul set di immagini completo corretto che si estende su diversi assoni e non si estende oltre i confini prossimali e distale della fluorescenza attivata all'interno di ciascuno degli assoni. La geometria della regione non è importante, tuttavia escludendo le aree in cui le strutture cambiano forma o dimensione miglioreranno l'allineamento.
   3. Eseguire il plugin di allineamento facendo clic su Plugins Allineamento per regione fissa. Il plugin posiziona un valore massimo predefinito di 2 pixel sullo spostamento tra i fotogrammi, tuttavia questo può essere regolato nella finestra iniziale pop-up se c'è una deriva significativa del campione. L'allineamento può richiedere alcuni minuti, a seconda delle dimensioni della pila di immagini.
   4. Controllare visivamente lo stack allineato per valutare la qualità del tracciato. Alcuni fotogrammi potrebbero quindi dover essere allineati manualmente, poiché l'allineamento automatico potrebbe non funzionare bene per grandi fluttuazioni della fluorescenza tra i fotogrammi. Questa operazione può essere eseguita durante la visualizzazione di una cornice che deve essere spostata facendo clic su Immagine . Proprietà Transform . Tradurre. Fare clic su No nel seguente popup che chiede se l'intero stack deve essere tradotto. Utilizzate solo i valori dei pixel interi nella traslazione e assicurate che il menu di interpolazione a discesa sia impostato su Nessuno , poiché lo spostamento o l'interpolazione dei pixel frazionarimodificherà i dati a causa del ricampionamento delle intensità dei pixel.
   5. Salvare questo come il set di immagini completo allineato.
3. Misurazione dell'intensità della fluorescenza
   1. Disegnare un ROI utilizzando lo strumento Angolo sul primo fotogramma dell'immagine completa allineata con il primo braccio lungo un bordo della regione attivata, perpendicolare agli assoni e il secondo braccio verticale. Premere il tasto 'm' per misurare l'angolo, che descrive l'orientamento degli assoni nel campo di vista.
   2. Impostare la scala delle immagini in modo che le dimensioni siano misurate in micron facendo clic su Analizza . Impostare Scala e immettere i valori appropriati.
   3. Aprire il gestore del ROI facendo clic su Analizza. Strumenti - Strumenti Responsabile del ROI. Per il paradigma di fuga-impulso, andare al passaggio 8.3.7. Per lo spread a impulsi, proseguire al punto 8.3.4.
   4. Disegnare un ROI quadrato di tutte le quote, quindi fare clic su Modifica . Proprietà Selection . Specificare. Assicurarsi che l'opzione Unità in scala sia selezionata, quindi impostare il ROI su una larghezza di 15 m e un'altezza uguale o maggiore dell'altezza dell'immagine.
   5. Ruotare il ROI in base all'angolo misurato al punto 8.3.1 facendo clic su Modifica Proprietà Selection . Ruotare per renderlo perpendicolare agli assoni e posizionare il ROI con un lato lungo il bordo prossimale della regione attivata. Aggiungi questo ROI, che ci riferiamo come il ROI della guida prossimale, al manager premendo il tasto 't'.
   6. Trascinare il ROI per allinearlo al bordo distale dell'area attivata e aggiungerlo nuovamente al gestore del ROI premendo il tasto 't'. Ci riferiremo a questo come la guida distale ROI. I RO della guida prossimale e distale saranno utilizzati in seguito per disegnare i RO di misurazione di affiancamento.
   7. Selezionare gli assoni per la quantificazione, utilizzando la sequenza di immagini timelapse acquisita nel passaggio 5.11 precedente. Questa sequenza di immagini è utile per questo scopo perché cattura l'autofluorescenza debole degli assoni, rivelando la loro morfologia al di fuori della regione attivata.
      NOTA: gli assoni che non soddisfano i seguenti criteri sono esclusi dall'analisi:
      1. Gli assoni devono essere a fuoco per l'intera lunghezza di tutte le finestre di misurazione.
      2. Gli assoni devono essere entro 5 gradi di estremità perpendicolari e distale della regione di attivazione.
      3. Gli assoni non devono avere invaginazioni entro i 5 m delle estremità prossimali e distale della regione di attivazione.
      4. Escludere gli assoni che cambiano forma visibilmente durante il corso dell'imaging.
      5. Escludere gli assoni che appaiono non integri come evidenziato dall'assenza di un'area discreta attivata nell'immagine post-attivazione (Figura 2C, in basso), in quanto ciò è indicativo della dispersione diffusa della fluorescenza attivata, che si verifica quando l'asse muore.
   8. Osservare l'immagine sbiancante a lunga esposizione dal punto 5.5 per le strutture autofluorescenti all'interno degli assoni. Questa fluorescenza è dovuta a flavins all'interno dei mitocondri¹⁶. Escludere gli assoni dall'analisi se questi mitocondri appaiono arrotondati o frammentati (Figura 2D, inferiore), a differenza delle strutture lineari estese(Figura 2D, in alto), in quanto si tratta di un'indicazione del declino metabolico.
   9. Utilizzando i ROI guida prossimali e distale creati in precedenza, disegnare tre ROI di misurazione per assone analizzati: una finestra centrale che comprende l'assone all'interno della regione attivata di 40 m e due finestre di fianco con larghezza vincolata dalla finestra di affiore 15 M ROM e altezza vincolata dal diametro dell'assone sul bordo della regione di attivazione. Aggiungere tutte e tre le regioni al gestore del ROI. Per gli assoni inibiti glicoliticamente, disegnare una singola regione che non sia più di 5 m di larghezza nel mezzo della regione attivata e che non si estenda al di fuori dell'assone. Per il paradigma di fuga-impulso, l'area attivata è larga solo 5 m, quindi è necessario utilizzare l'intera finestra.
   10. Ripetere il punto 8.3.9 per tutti gli assoni che soddisfano i criteri dei punti 8.3.7 e 8.3.8.
   11. Impostare le misure attive sull'intensità media dei pixel facendo clic su Analizza. Impostare Misure e selezionare l'opzione Valore di grigio medio. Assicurarsi che non siano selezionate altre opzioni di misurazione.
   12. Selezionare tutti i ROI nella finestra di Gestione ROI selezionando la finestra e premendo 'Ctrl' e 'a'. Nella finestra Gestione ROI, fare clic su Altro Multi-misura per misurare l'intensità della fluorescenza. Copiare i dati dalla finestra dei risultati in un foglio di calcolo per un'ulteriore analisi.
   13. Impostare le misure attive sull'area dell'area facendo clic su Analizza . Impostare Misure e selezionare l'opzione Area. Area Assicurarsi che non siano selezionate altre opzioni di misurazione.
   14. Ripetere il passaggio 8.3.12. È necessario copiare solo una riga dei risultati per l'area, in quanto l'area non varia con il tempo.

9. Correzione fotobleach

1. Nel foglio di calcolo dei dati per gli assoni inibiti glicoliticamente, sottrarre la fluorescenza media del fotogramma 1 (il fotogramma di pre-attivazione) dalla fluorescenza media di ogni fotogramma a partire dal fotogramma 3 (il primo fotogramma timelapse) per un determinato ROI. I risultati sono i mezzi sottratti in background.
2. Tracciare i dati come un grafico a dispersione con i numeri di fotogramma come abscissa. Adattare una linea di tendenza esponenziale ai dati di ogni ROI (la maggior parte dei programmi di fogli di calcolo ha questa funzione) con un'equazione sotto forma di Ae^-bx. Questa equazione è equivalente alla funzione di fotobleaching F_t - F₀ e^-tɣ dove F₀ è la fluorescenza al primo fotogramma del timelapse, ɣ è il tasso di sbiancamento esponenziale, t è il tempo ed e è la base logaritmica naturale.
3. Ripetere i passaggi 9.1.1-9.1.2 per tutti i ROI di tutti gli assoni dai nervi inibiti glicoliticamente. Per la stima più accurata del tasso di fotobleaching, utilizzare almeno 15 assoni in totale da almeno 5 nervi separati. Utilizzare la media dei tassi di sbiancamento esponenziali (ɣ) da tutti gli assoni inibiti per correggere i dati sperimentali per la fotobleaching. Una nuova calibrazione sbiancamento deve essere eseguita per ogni esperimento o studio, perché il fotobleaching dipende dalle impostazioni di acquisizione dell'immagine e dalla potenza laser, che può cambiare nel tempo.
4. Ripetere il passaggio 9.1.1 per tutte le regioni di assoni con normale salina (cioè non inibita glicoliticamente).
5. Dividere ogni punto dati per e^-tɣ, utilizzando il tempo per t e la media ɣ trovata nel passaggio 9.1.3. Questi sono i mezzi fotobleach-corretto.
6. Moltiplicare ogni punto dati per l'area per tale area di interesse per trovare la fluorescenza totale in tale area in ogni momento.

Risultati

La Figura 3 mostra immagini rappresentative da esperimenti di fuga di impulsi e di diffusione del polso. Abbiamo pubblicato diversi studi che descrivono i dati ottenuti utilizzando il metodo pulse-escape e i nostri metodi per l'analisi di quei dati^5,6,7,8,17. Di seguito, mostriamo come i dati di diffusione dell'impulso possono pro...

Discussione

L'analisi degli esperimenti di fuga e di diffusione dell'impulso deve essere presa in considerazione perché esiste un potenziale significativo per l'introduzione dell'errore durante la post-elaborazione, principalmente durante la correzione del campo piatto, l'allineamento dell'immagine e la correzione della candeggina. La correzione a campo piatto è necessaria per correggere la non uniformità nell'illuminazione, che si traduce in una caduta di intensità attraverso il campo di vista dal centro alla periferia. L'entit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors