Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Resumo

Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.

Resumo

Os polímeros de proteína neurofilamental movem-se ao longo dos axônios no componente lento do transporte axonal a velocidades médias de ~0,35-3,5 mm/dia. Até recentemente, o estudo desse movimento in situ só era possível utilizando rotulagem de pulso radioisotópica, que permite a análise do transporte axonal em nervos inteiros com resolução temporal de dias e resolução espacial de milímetros. Para estudar o transporte de neurofilamento in situ com maior resolução temporal e espacial, desenvolvemos um camundongo transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa proteína de neurofilamento M marcada com GFP fotoativatável em neurônios. Aqui descrevemos os métodos de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso e difusão de pulso para analisar o transporte de neurofilamento em axônios mieliados únicos de nervos tibiais desses camundongos ex vivo. Segmentos nervosos isolados são mantidos no estágio do microscópio por perfusão com soro fisiológico oxigenado e imageados por microscopia de fluorescência confocal de disco giratório. A luz violeta é usada para ativar a fluorescência em uma janela axonal curta. A fluorescência nas regiões ativadas e flanqueadas é analisada ao longo do tempo, permitindo o estudo do transporte de neurofilamento com resolução temporal e espacial na ordem de minutos e mícrons, respectivamente. A modelagem matemática pode ser usada para extrair parâmetros cinéticos do transporte de neurofilamento, incluindo a velocidade, viés direcional e comportamento de pausa dos dados resultantes. Os métodos de fuga de pulso e difusão de pulso também podem ser adaptados para visualizar o transporte de neurofilamento em outros nervos. Com o desenvolvimento de camundongos transgênicos adicionais, esses métodos também poderiam ser usados para imagem e análise do transporte axonal de outras proteínas citoesqueletal e citosóica em axônios.

Introdução

O transporte axonal de neurofilamentos foi demonstrado pela primeira vez na década de 1970 pela rotulagem de pulso radioisotópica¹. Essa abordagem tem gerado uma riqueza de informações sobre o transporte de neurofilamento in vivo,mas tem resolução espacial e temporal relativamente baixa, tipicamente na ordem dos milímetros e dias, no máximo². Além disso, a rotulagem de pulso radioisotópica é uma abordagem indireta que requer a injeção e o sacrifício de vários animais para gerar um curso único. Com a descoberta de proteínas fluorescentes e os avanços na microscopia de fluorescência na década de 1990, tornou-se posteriormente possível a imagem do transporte de neurofilamento diretamente em neurônios cultos em uma escala de tempo de segundos ou minutos e com resolução espacial sub-micrômetro, proporcionando uma visão muito maior do mecanismo do movimento³. Esses estudos revelaram que os polímeros de neurofilamento em axônios se movem de forma rápida e intermitente em direções anterogradas e retrógradas ao longo de trilhas de microtúbulos, impulsionados por proteínas motoras microtúbulas. No entanto, neurofilamentos são estruturas limitadas à difração com apenas 10 nm de diâmetro que são tipicamente espaçadas além de seus vizinhos por apenas dezenas de nanômetros; portanto, os polímeros só podem ser rastreados em neurônios cultivados que contenham neurofilamentos pouco distribuídos para que os polímeros em movimento possam ser resolvidos a partir de seus vizinhos⁴. Assim, não é possível rastrear neurofilamentos únicos em axônios que contenham polímeros neurofilados abundantes, como axônios mieliados.

Para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios ricos em neurofilamentos usando microscopia de fluorescência, utilizamos um método de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso que desenvolvemos para estudar o comportamento de pausa a longo prazo de neurofilamentos em células nervosas cultivadas^4,,5. Neurofilamentos marcados com uma proteína de fusão de neurofilamento fluorescente fotoativat são ativados em um pequeno segmento de axônio, e então a taxa de saída desses filamentos da região ativada é quantificada pela medição da decadência da fluorescência ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que é uma análise em nível populacional do transporte de neurofilamento que pode ser aplicada em uma escala de tempo de minutos ou horas sem a necessidade de rastrear o movimento de polímeros de neurofilamento individual. Por exemplo, usamos este método para analisar a cinética do transporte de neurofilamento nas culturas mielique⁶.

Recentemente, descrevemos o desenvolvimento de um rato transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa baixos níveis de uma proteína de neurofilamento com marca paGFP M (paGFP-NFM) em neurônios sob o controle do promotor Thy1 específico do neurônio humano⁷. Este camundongo permite a análise do transporte de neurofilamento in situ usando microscopia de fluorescência. Neste artigo, descrevemos as abordagens experimentais para a análise do transporte de neurofilamento em axônios mieliados de nervos tibiais desses camundongos usando duas abordagens. A primeira dessas abordagens é o método de fuga de pulso descrito acima. Este método pode gerar informações sobre o comportamento de pausa dos neurofilamentos, mas é cego para a direção em que os filamentos partem da região ativada e, portanto, não permite a medição da direcionalidade líquida e da velocidade de transporte⁸. A segunda dessas abordagens é um novo método de propagação de pulso no qual analisamos não apenas a perda de fluorescência da região ativada, mas também o aumento transitório da fluorescência em duas janelas de flanqueamento através das quais os filamentos fluorescentes se movem à medida que saem da região ativada em direções anterogradas e retrógradas. Em ambas as abordagens, parâmetros de transporte de neurofilamento, como a velocidade média, direcionalidade líquida e comportamento de pausa podem ser obtidos utilizando-se análise matemática e modelagem das mudanças na fluorescência nas janelas de medição. A Figura 3 ilustra essas duas abordagens.

Este protocolo demonstra dissecação e preparação do nervo, ativação e imagem da fluorescência paGFP e quantificação do transporte de neurofilamento a partir das imagens adquiridas utilizando o pacote de distribuição FIJI da ImageJ⁹. Usamos o nervo tibial porque é longo (vários cm) e não ramifica; no entanto, em princípio, qualquer nervo que expresse paGFP-NFM é apropriado para uso com esta técnica se ela pode ser dissecada e desapeto sem danificar os axônios.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio.

1. Preparação da solução salina nervosa

1. Faça 100 mL de soro fisiológico de Breuer¹⁰: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 1,5 mM CaCl₂, 5,6% D-glicose, 23,8 mM NaHCO₃ em água duplamente destilada.
2. Bolha 95% de oxigênio/5% dióxido de carbono (carbogen) através da solução salina por pelo menos 30 minutos antes do uso. As sobras de soro fisiológico podem ser reutilizadas dentro de uma semana; no entanto, deve ser reoxiscinado antes de cada uso.
3. Despeje soro fisiológico oxigenado em uma seringa de 60 mL e certifique-se de que há ar mínimo restante na seringa.

2. Montagem inicial da câmara de perfusão nervosa

1. Conecte a seringa e a tubulação, conforme mostrado na Figura 1A,colocando o tubo de saída em um frasco de resíduos.
2. Coloque a junta externa na carcaça da câmara de perfusão, garantindo que a entrada de fluxo e os postes de saída estejam alinhados com os orifícios da junta.
3. Coloque a junta interna (silicone, 100 μm de espessura) em uma mancha circular de #1,5 (diâmetro de 40 mm), alisando cuidadosamente todas as rugas na junta para garantir uma vedação apertada. Para facilitar a montagem posterior, coloque o talo de cobertura e a junta em uma toalha de papel ou limpe a tarefa com a junta voltada para cima.

3. Dissecção e preparação do nervo tibial do rato

1. Sacrifique o animal por inalação de dióxido de carbono ou outro método institucionalmente aprovado. Inicie um temporizador quando o animal cessar o movimento/respiração, pois os experimentos só devem ser realizados dentro de 3 horas após o sacrifício⁷.
2. Pulverize a pele com 70% de etanol e retire o máximo possível das pernas e costas do animal usando uma navalha elétrica.
3. Usando um par de tesouras de dissecção grande, faça uma incisão dorsal na pele perto do meio da coluna vertebral e continue o corte ao redor do aspecto ventral do animal. A partir deste corte, reflita lentamente a pele das pernas puxando-a suavemente para longe do músculo e cortando a fáscia.
4. Coloque o animal em uma posição supina em uma bandeja de dissecação e fixe todas as quatro patas. Opcionalmente fixe a cauda para reduzir ainda mais o movimento.
5. Usando uma tesoura de microdisseção, faça uma incisão nos músculos da coxa no meio do caminho entre a cauda e o joelho para expor o nervo ciático. Certifique-se de que o nervo, que é visível através do músculo, não seja cortado.
6. Estenda a incisão dorsal e ventrally para remover o músculo. Da mesma forma, remova os músculos da panturrilha, mantendo os cortes rasos e curtos para evitar danificar o nervo.
7. Remova os músculos até que o nervo tibial esteja totalmente exposto do ponto em que se ramifica do nervo ciático (no joelho) até o calcanhar(Figura 2A).
   NOTA: Em todas as etapas, incluindo e após a dissecação do nervo tibial, evite exposição desnecessária à luz ambiente para minimizar a possível ativação incidental do paGFP no nervo.
8. Segure o nervo tibial na extremidade vertebral-proximal com um par de fórceps e corte o nervo usando um par de tesouras de microdisseção. Tomando cuidado para não colocar tensão no nervo, levantá-lo para longe do músculo, cortando quaisquer acessórios.
9. Corte a extremidade distal da coluna vertebral do nervo tibial e transfira para uma pequena placa de Petri de soro fisiológico de temperatura ambiente. A partir deste ponto no procedimento, certifique-se sempre de acompanhar as extremidades proximal e distal do nervo.
   NOTA: Uma maneira de fazer isso é marcar a extremidade distal do nervo com um corte angular de tal forma que o afunilador seja visível.
10. A partir da extremidade proximal do nervo, segure suavemente as extremidades do axônio exposto com um par de fórceps muito finos.
11. Com um segundo par de fórceps, segure a bainha nervosa proximally, e puxe lentamente para a extremidade distal do nervo. A baásma nervosa deslizará ao longo dos axônios com resistência mínima. Certifique-se de que nenhuma tensão indevida seja aplicada ao nervo durante este processo.

4. Montagem final da câmara de perfusão do nervo

1. Agarrando a extremidade proximal do nervo, remova-a do soro fisiológico e lentamente deite-a sobre a tampa da câmara de perfusão dentro da abertura retangular da junta interna, mantendo uma tensão suave no nervo enquanto você a coloca para baixo para que ela fique reta.
2. Coloque o deslizamento do microacoduto sobre o nervo com o lado ranhurado voltado para o nervo, e a direção do fluxo paralelo ao nervo. Vire o deslizamento de tampas e o conjunto de micropacdutos, e coloque-o dentro da carcaça da câmara de perfusão com o slide de microacoduto emposto à junta externa. O nervo e a junta interna circundante serão agora sanduíches entre o deslizamento de tampa e o slide microaqueduto, que são separados pela junta, com o deslizamento de tampa voltado para cima(Figura 1B).
3. Fixar a câmara de perfusão colocando-a na caixa metálica e girando o anel de bloqueio. Certifique-se de que a carcaça de plástico está totalmente sob todos os clipes metálicos e aperte bem para evitar vazamento salino. O apertar demais pode quebrar o slide ou o deslizamento de cobertura do microacoduto. Vire a câmara para que a tampa esteja virada para baixo.
4. Deprimir lentamente o êmbolo da seringa salina para encher a câmara de perfusão. Mantenha a entrada e a tubulação de saída, o frasco de saída e a seringa elevados acima da própria câmara o tempo todo durante a configuração e a imagem. Isso evita o sifonamento, que pode introduzir bolhas ou causar instabilidade de foco devido à pressão negativa na câmara.
5. Transfira o conjunto de perfusão para um estágio de microscópio invertido e monte a seringa salina para a bomba de seringa. Ligue o motor a uma velocidade adequada para uma vazão de 0,25 mL/min. Em seguida, conecte-se e ligue o aquecedor de solução em linha definido para 37 °C.
6. Conecte o aquecedor objetivo e defina para 37 °C, aplique óleo ao objetivo e insira a câmara de perfusão na montagem do palco.
7. Aplique óleo na almofada de aquecedor de câmara e conecte-se à câmara de perfusão. Conecte e ligue o aquecedor da câmara; definido para 37 °C.
   NOTA: Mudanças na temperatura podem fazer com que bolhas se formem na câmara de perfusão devido à desgaseamento da solução. Se as bolhas se formarem, aumente brevemente a taxa de fluxo da solução em 5-10x até que as bolhas limpem a câmara.
8. Tranque a câmara de perfusão no adaptador de palco e leve o óleo objetivo para contato com a tampa na parte inferior da câmara.
   NOTA: A câmara Bioptechs com adaptador de estágio ASI usado aqui foi projetada para uma configuração de microscópio invertido.

5. Ativação da fluorescência e aquisição de imagens

1. Usando iluminação de campo brilhante, concentre-se na camada de axônios na superfície inferior do nervo mais próximo da superfície de deslizamento de tampas(Figura 2B). Axônios mielinados (tipicamente de 1 a 6 μm de diâmetro em camundongos adultos) podem ser identificados pela presença de uma baia de mielina, que é visível sob iluminação de luz transmitida de campo brilhante sem aprimoramento de contraste. Fissuras e nódulos de Ranvier schmidt-lanterman também são facilmente aparentes. Os axônios nãoomiados são mais finos (tipicamente <1 μm de diâmetro) e geralmente estão presentes em pacotes (pacotes Remak), onde geralmente são muito próximos para serem resolvidos um do outro.
2. Se estiver disponível no microscópio, ative o sistema de foco automático para manter o foco ao longo da imagem timelapse.
3. Adquira uma imagem de referência brightfield. Regisso da orientação do nervo (extremidades proximais e distais da coluna vertebral) em relação às imagens.
4. Adquira uma imagem confocal usando um laser de 488 nm e um filtro de emissão apropriado para paGFP (por exemplo, 525/50 nm) para registrar a autofluorescência pré-alvejante. Mantenha a potência do laser baixa para minimizar o fotobleaching, com o tempo de exposição ajustado de acordo para detectar o sinal fraco. Como exemplo, os dados representativos foram adquiridos com 5% de potência laser e exposições de 4 s. Registo as configurações de aquisição para uso em todos os experimentos futuros.
   NOTA: Após a fotoativação, as configurações ideais de imagem produzirão uma relação sinal-ruído > 8 e fotobleaching de menos de 25% do sinal original ao longo de 20 imagens. Os axônios também podem ser imagens por microscopia de epifluorescência widefield como fizemos originalmente^7,mas a qualidade da imagem será inferior devido à falta de confocalidade.
5. Defina a potência laser para aproximadamente 5x potência normal de imagem e adquira uma imagem com um tempo de exposição de 3-4 minutos. Embora não seja essencial, este passo é recomendado para branquear a autofluorescência e outras fontes de fluorescência indesejada, a fim de reduzir o sinal de fundo e, assim, maximizar o sinal-ruído da fluorescência fotoativada.
6. Adquira uma imagem com as configurações usadas na etapa 5.4 para registrar a autofluorescência de pré-ativação após esta etapa de branqueamento.
7. Na imagem brightfield, desenhe uma linha paralela aos axônios com um comprimento igual ao tamanho da janela de ativação desejada. O comprimento desta janela variará dependendo do objetivo experimental e parâmetros, mas os comprimentos típicos são de 5 μm para o paradigma de fuga de pulso e 40 μm para o paradigma de difusão de pulso.
8. Usando esta linha como guia, desenhe uma região retangular de interesse (ROI) através do campo de visão perpendicular aos axônios. A região deve abranger todos os axônios a serem fotoativados.
9. Determine as configurações ideais para fotoativação com iluminação de 405 nm.
   NOTA: Somente realize esta etapa e sub-passos antes da primeira ativação experimental. Ao longo de um experimento, devem ser utilizadas as mesmas configurações de fotoativação.
   1. Ative uma região de interesse repetidamente usando a linha laser de 405 nm, baixa potência laser (por exemplo, 5%) e tempo de moradia de pixels (por exemplo, 40 μs), e um pulso, adquirindo uma imagem da fluorescência GFP ativada após cada ativação. Repita até que a fluorescência não aumente mais e, em seguida, quantifique a fluorescência em uma região de interesse para cada imagem.
   2. Plote as intensidades médias de fluorescência versus número de pulso. Selecione o número de pulsos após o qual a fluorescência não aumenta mais como o número ideal de pulsos para ativação.
10. Ative a fluorescência paGFP da região desenhada na etapa 5.8 por excitação padronizada com luz de 405 nm. Certifique-se de que uma imagem seja adquirida pouco antes e apenas após a ativação.
    NOTA: A ativação ideal do paGFP produzirá uma região claramente definida de fluorescência com limites afiados contidos no ROI.
11. Inicie um temporizador de 1 minuto à medida que a ativação terminar. No final de 1 minuto, comece a aquisição de uma série timelapse.
    NOTA: O atraso de 1 minuto é necessário para permitir o aumento da fluorescência observada após a fotoativação do paGFP¹¹. Para o método de difusão de pulso, um período de aquisição de 5-10 minutos com intervalos de timelapse de 30 segundos é suficiente para a medição das encostas iniciais nas janelas centrais e de flanqueamento para medir a velocidade e a direcionalidade. Para o método de fuga de pulso, um período de aquisição de 30-150 minutos com intervalos de timelapse de 5 ou 10 minutos permite a análise do comportamento de pausa a longo prazo dos filamentos
12. Salve todas as imagens adquiridas, bem como o ROI utilizado para ativação de fluorescência.
13. Mova-se para uma nova região do nervo e repita as etapas 5.1-5.11. Se a nova região estiver ao longo do mesmo axônio, deve ser pelo menos 500 μm da região anteriormente ativada para evitar a detecção de neurofilamentos fluorescentes que saíram da outra região ativada. A aquisição do timelapse final deve terminar antes do fim da janela de 3 horas.
    NOTA: É possível que a preparação possa ser viável por mais de 3 horas, mas não confirmamos isso. Com dissecção e preparação proficientes, entre cinco e oito conjuntos de imagens timelapse de 10 minutos podem ser adquiridos dentro desta janela de 3 horas.
14. Após a aquisição da série final de imagens timelapse, pare o fluxo de soro fisiológico, desconecte a solução e os aquecedores de câmara e remova o aparelho de perfusão do estágio do microscópio.

6. Aquisição de imagem flatfield e darkfield

1. Faça uma solução de fluoresceína adicionando 250 mg de pó de fluoresceína a 0,5 mL de água dupla destilada. Misture até que não haja partículas visíveis e gire a solução por 30 segundos em uma centrífuga de mesa para sedimentar qualquer material não resolvido. Esta solução pode ser armazenada por vários meses a 4 °C se protegida da exposição à luz.
2. Adicione 8 μL de solução de fluoresceína a um slide e aplique uma folha de cobertura de #1,5. Borrar o excesso de líquido, selar com esmalte e deixar secar.
   NOTA: Nesta alta concentração, a forte absorção do corante fluoresceína extingue o feixe iluminador dentro da solução, produzindo um fino plano de fluorescência na superfície do deslizamento de tampas que é uniforme e resistente ao fotobleaching devido à rápida troca difusiva¹².
3. Coloque a cobertura do slide fluoresceína para baixo no estágio do microscópio invertido e ajuste o foco no fino plano de fluorescência na superfície do deslizamento. Mova-se ao redor do slide para encontrar um campo de visão que não contenha bolhas de ar (manchas escuras) ou grandes partículas de fluoresceína (pontos brilhantes).
4. Adquira uma pilha z de 6 μm a intervalos de 0,2 μm, de modo que a imagem do meio seja o plano de foco original. Use um curto tempo de exposição (por exemplo, 40 ms) porque a fluorescência será muito brilhante. Esta aquisição de pilha z é necessária para capturar a fluorescência máxima através do campo de visão, pois o deslizamento de cobertura raramente é perfeitamente horizontal e o plano de fluorescência fluoresceína é muito estreito. Repita isso para um total de 25 campos de visão, movendo o palco em pelo menos 20 μm em qualquer direção entre os campos.
5. Feche todas as persianas do caminho da luz, incluindo o obturador da câmera, e ajuste a potência do laser e o tempo de exposição a zero. Adquira uma pilha de 100 imagens com essas configurações. Essas imagens serão mediadas para gerar a imagem darkfield, que será usada para corrigir a corrente escura e o viés compensado no chip da câmera.
   NOTA: A aquisição por streaming é uma maneira ideal de capturar essas imagens.

7. Imagem glicolicoticamente inibiu nervos para correção de alvejante

1. Fazer e oxigenar uma solução salina como na etapa 1; no entanto substitua 2-desoxi-D-glicose para D-glicose e adicione 0,5 mM de iodoacetato de sódio para inibir a glicolise¹³. Nós nos referimos a isso como "soro fisiológico inibidor".
2. Repita as etapas 2-5 usando o soro fisiológico inibidor, com uma imagem timelapse de 10-30 minutos definida na etapa 5.11. Permita 40-50 minutos após a aplicação de soro fisiológico inibidor antes da imagem para garantir a inibição completa do transporte neurofilamento.
   NOTA: A inibição glicolítica acabará por matar os axônios, de modo que há uma janela estreita de tempo após a inibição para adquirir dados, tipicamente cerca de 30 minutos. Um indicador do nível de inibição metabólica é a autofluorescência flavina das mitocôndrias axonanas, que podem ser detectadas na série timelapse devido às longas exposições que usamos para a imagem da fluorescência paGFP¹⁴. Normalmente, a autofluorescência mitocondrial aumentará durante o tratamento com soro fisiológico inibidor. Se as mitocôndrias começarem a arredondar ou fragmentar, então cessem a imagem.

8. Processamento e análise de imagem usando ImageJ

1. Correção flatfield e darkfield
   1. Abra a pilha de imagens de darkfield e média das imagens clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z e seleção de intensidade média no menu suspenso para gerar a imagem de darkfield.
   2. Abra as pilhas de imagens de campo plano fluorescein e crie uma projeção de intensidade máxima de cada um (25 no total) clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z e seleção de Intensidade Máxima no menu suspenso.
   3. Combine as 25 imagens máximas de projeção resultantes em uma pilha clicando em Imagem | Pilhas | Imagens para Stack. Crie uma projeção de intensidade média desta pilha clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z e seleção de intensidade média do menu suspenso para gerar a imagem flatfield.
   4. Subtraia a imagem do campo escuro da imagem flatfield clicando em Process | Calculadora de imagens,selecionando Subtrato como operação. Certifique-se de que a opção de resultado de 32 bits (flutuação) seja verificada. O resultado é a imagem de flatfield corrigida.
   5. Meça a intensidade média do pixel da imagem plana corrigida clicando primeiro em Analisar | Defina medidas e verifique a caixa de valor cinza Média e, em seguida, pressione a tecla 'm'.
   6. Divida a imagem plana corrigida por sua intensidade média clicando em Process | Matemática | Divida e digite o valor cinza médio obtido na etapa 7.1.5. Isso produzirá a imagem de ganho inverso.
   7. Abra as imagens de pré-ativação e pós-ativação, juntamente com a pilha de imagens timelapse. Combine as imagens em uma única pilha clicando em Imagem | Pilhas | Ferramentas | Concatenare selecionar as imagens em ordem cronológica nos menus suspensos. Certifique-se de que a opção abrir como imagem 4D não esteja selecionada. A pilha resultante é o conjunto de imagens completo.
   8. Repita o passo 8.1.4 no conjunto completo de imagense, em seguida, divida o resultado pela imagem de ganho inverso clicando em Processo | Calculadora de imagem e seleção de Dividir como operação. Isso produzirá o conjunto de imagens completa corrigida,no qual cada imagem foi corrigida para a não uniformidade no campo de iluminação e no detector.
2. Alinhamento da pilha de imagens
   1. Para corrigir o desalinhamento dos planos de imagem na série timelapse devido à deriva de estágio ou amostra, instale o Alinhamento por plugin de região fixa (Arquivo Suplementar 1) clicando em Plugins | Instale o PlugIn,navegando até a pasta que contém o arquivo plugin e selecionando o plugin. Reinicie o ImageJ após a instalação do plugin.
      NOTA: Este plugin alinha imagens com base no princípio "menos quadrados congestionando"^{princípio 15}.
   2. Desenhe um ROI no conjunto de imagem completo corrigido que abrange vários axônios e não se estende além dos limites proximais e distais da fluorescência ativada dentro de cada um dos axônios. A geometria da região não é importante, porém excluindo áreas em que as estruturas mudam de forma ou tamanho melhorará o alinhamento.
   3. Execute o plugin de alinhamento clicando em Plugins | Alinhamento por região fixa. O plugin coloca um máximo padrão de 2 pixels no deslocamento entre os quadros, no entanto, isso pode ser ajustado na janela pop-up inicial se houver uma deriva significativa da amostra. O alinhamento pode levar vários minutos, dependendo do tamanho da pilha de imagens.
   4. Inspecione visualmente a pilha alinhada para avaliar a qualidade do alinhamento. Alguns quadros podem então precisar ser alinhados manualmente, pois o alinhamento automatizado pode não funcionar bem para grandes flutuações na fluorescência entre os quadros. Isso pode ser feito ao visualizar um quadro que deve ser deslocado clicando em Imagem | Transformar | Traduzir. Clique em Não no pop-up a seguir perguntando se toda a pilha deve ser traduzida. Use apenas valores de pixels inteiros na tradução e certifique-se de que o menu de interpolação suspenso seja definido como Nenhum,pois mudanças fracionadas de pixels ou interpolação alterarão os dados devido à resamplagem das intensidades dos pixels.
   5. Guarde isso como o conjunto de imagens completas alinhados.
3. Medição das intensidades de fluorescência
   1. Desenhe um ROI usando a ferramenta Ângulo no primeiro quadro do conjunto de imagem completo alinhado com o primeiro braço ao longo de uma borda da região ativada, perpendicular aos axônios e o segundo braço vertical. Pressione a tecla 'm' para medir o ângulo, que descreve a orientação dos axônios no campo de visão.
   2. Defina a escala das imagens para que as dimensões sejam medidas em mícrons clicando em Analisar | Defina escala e digite os valores apropriados.
   3. Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI. Para o paradigma de fuga de pulso, pule para o passo 8.3.7. Para o pulso espalhado, continue a passo 8.3.4.
   4. Desenhe um ROI quadrado de qualquer dimensão e clique em Editar | Seleção | Especifique. Certifique-se de que a opção unidades dimensionadas seja verificada e, em seguida, ajuste o ROI para uma largura de 15μm e uma altura igual ou superior à altura da imagem.
   5. Gire o ROI pelo ângulo medido na etapa 8.3.1 clicando em Editar | Seleção | Gire para torná-lo perpendicular aos axônios, e coloque o ROI com um lado ao longo da borda proximal da região ativada. Adicione este ROI, que vamos chamar de ROI guia proximal, ao gerente pressionando a tecla 't'.
   6. Arraste o ROI para se alinhar com a borda distal da região ativada e adicione novamente ao gerenciador de ROI pressionando a tecla 't'. Vamos nos referir a isso como o guia distal ROI. Os ROIs do guia proximal e distal serão usados posteriormente para desenhar os ROIs de medição de flanqueamento.
   7. Selecione axons para quantificação, usando a sequência de imagem timelapse adquirida na etapa 5.11 acima. Esta sequência de imagem é útil para este fim porque captura a fraca autofluorescência dos axônios, revelando sua morfologia fora da região ativada.
      NOTA: Os Axônios que não atendam aos seguintes critérios são excluídos da análise:
      1. Os axônios devem estar em foco ao longo de toda a extensão de todas as janelas de medição.
      2. Os axônios devem estar dentro de 5° do perpendicular às extremidades proximais e distais da região de ativação.
      3. Os axônios não devem ter invaginações dentro de 5μm das extremidades proximais e distais da região de ativação.
      4. Exclua axônios que mudam de forma visivelmente durante o curso da imagem.
      5. Exclua axônios que pareçam insalubres como evidenciado pela ausência de uma região ativada discreta na imagem pós-ativação(Figura 2C, inferior), pois isso é indicativo de dispersão difusiva da fluorescência ativada, que acontece quando o axônio morre.
   8. Observe a imagem de branqueamento de longa exposição da etapa 5.5 para estruturas autofluorescentes dentro dos axônios. Esta fluorescência é devido a flavinas dentro das mitocôndrias¹⁶. Exclua os axônios da análise se essas mitocôndrias aparecerem arredondadas ou fragmentadas(Figura 2D, inferior), em oposição a estruturas lineares estendidas(Figura 2D, topo), pois isso é uma indicação de declínio metabólico.
   9. Utilizando os ROIs de guia proximal e distal criados acima, desenhe três ROIs de medição por axônio sendo analisados: uma janela central que abrange o axônio dentro da região ativada de 40 μm, e duas janelas de flanqueamento com largura restrita pela janela de flanqueamento 15 μm ROIs e altura restrita pelo diâmetro do axônio na borda da região de ativação. Adicione as três regiões ao gerente do ROI. Para axônios glicolíticos inibidos, desenhe uma única região que não tenha mais de 5 μm de largura no meio da região ativada e que não se estenda fora do axônio. Para o paradigma de fuga de pulso, a região ativada tem apenas 5 μm de largura, por isso toda a janela deve ser usada.
   10. Repita a etapa 8.3.9 para todos os axônios que atendam aos critérios das etapas 8.3.7 e 8.3.8.
   11. Definir medições ativas para intensidade média de pixels clicando em Analisar | Defina medidas e selecione a opção De valor cinza Médio. Certifique-se de que nenhuma outra opção de medição seja verificada.
   12. Selecione todos os ROIs na janela ROI Manager selecionando a janela e pressionando 'Ctrl' + 'a'. Na janela ROI Manager, clique em Mais | Multi Medida para medir as intensidades de fluorescência. Copie os dados da janela de resultados para uma planilha para análise posterior.
   13. Definir medições ativas para a área da região clicando em Analisar | Defina medidas e selecione a opção Área. Certifique-se de que nenhuma outra opção de medição seja verificada.
   14. Repita o passo 8.3.12. Só é necessário copiar uma linha dos resultados para a área, pois a área não varia de acordo com o tempo.

9. Correção de fotobleach

1. Na planilha de dados para axônios glicolíticos inibidos, subtraia a fluorescência média do quadro 1 (o quadro de pré-ativação) da fluorescência média de cada quadro a partir do quadro 3 (o primeiro período timelapse) para um determinado ROI. Os resultados são os meios subtraídos em segundo plano.
2. Plote os dados como uma tabela de dispersão com os números de quadros como a abscissa. Encaixe uma linha de tendência exponencial aos dados de cada ROI (a maioria dos programas de planilha tem essa função) com uma equação na forma de Ae^-bx. Esta equação é equivalente à função fotobleaching F_t = F₀ * e^-tɣ onde F₀ é a fluorescência no primeiro quadro do timelapse, ɣ é a taxa de branqueamento exponencial, t é o tempo, e e é a base natural do logaritmo.
3. Repita as etapas 9.1.1-9.1.2 para todos os ROIs de todos os axônios dos nervos glicolíticos inibidos. Para a estimativa mais precisa da taxa de fotobleaching, use pelo menos 15 axônios no total de pelo menos 5 nervos separados. Use a média das taxas de branqueamento exponencial (ɣ) de todos os axônios inibidos para corrigir os dados experimentais para fotobleaching. Uma nova calibração de branqueamento deve ser realizada para cada experimento ou estudo, pois o fotobleaching depende das configurações de aquisição de imagem e da potência do laser, que pode mudar com o tempo.
4. Repita o passo 9.1.1 para todas as regiões de axônios com soro fisiológico normal (ou seja, não glicolítico inibido).
5. Divida cada ponto de dados por e^-tɣ, utilizando o tempo para t e a média ɣ encontrada na etapa 9.1.3. Estes são os meios corrigidos por fotobleach.
6. Multiplique cada ponto de dados pela área para que essa região de interesse encontre a fluorescência total naquela região a cada momento.

Resultados

A Figura 3 mostra imagens representativas de experimentos de fuga de pulso e propagação de pulso. Publicamos diversos estudos que descrevem dados obtidos utilizando o método pulse-escape e nossos métodos para a análise desses dados^{5,,6,7,,8,,17}. Abaixo, mostramos como os dados de difusão de pulso podem produzir informações...

Discussão

Deve-se tomar cuidado na análise de experimentos de fuga de pulso e difusão de pulso, pois há um potencial significativo para a introdução de erros durante o pós-processamento, principalmente durante a correção de campo plano, alinhamento de imagem e correção de alvejante. A correção em campo plano é necessária para corrigir a não uniformidade na iluminação, o que resulta em uma queda de intensidade em todo o campo de visão do centro para a periferia. A extensão da não uniformidade é dependente do co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors