Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Zusammenfassung

Wir beschreiben Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethoden zur Analyse des axonalen Transports von Neurofilamenten in einzelnen myelinierten Axonen peripherer Nerven von transgenen Mäusen, die ein photoaktivierbares Neurofilamentprotein exprimieren.

Zusammenfassung

Neurofilament-Proteinpolymere bewegen sich entlang von Axonen in der langsamen Komponente des axonalen Transports bei Durchschnittsgeschwindigkeiten von 0,35-3,5 mm/Tag. Bis vor kurzem war die Untersuchung dieser Bewegung vor Ort nur mit radioisotopischer Pulsbeschriftung möglich, die eine Analyse des axonalen Transports in ganzen Nerven mit einer zeitlichen Auflösung von Tagen und einer räumlichen Auflösung von Millimetern ermöglicht. Um den Neurofilamenttransport vor Ort mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen, haben wir eine hThy1-paGFP-NFM transgene Maus entwickelt, die Neurofilamentprotein M mit photoaktivierbarem GFP in Neuronen ausdrückt. Hier beschreiben wir Fluoreszenz-Photoaktivierung Puls-Escape und Puls-Spread-Methoden zur Analyse des Neurofilamenttransports in einzelnen myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen ex vivo. Isolierte Nervensegmente werden auf der Mikroskopstufe durch Perfusion mit sauerstoffhaltiger Saline erhalten und durch drehende Plattenkonfokaleszenzmikroskopie abgebildet. Violettes Licht wird verwendet, um die Fluoreszenz in einem kurzen axonalen Fenster zu aktivieren. Die Fluoreszenz in den aktivierten und flankierenden Regionen wird im Laufe der Zeit analysiert, was die Untersuchung des Neurofilamenttransports mit zeitlicher und räumlicher Auflösung in der Größenordnung von Minuten bzw. Mikrometern ermöglicht. Mathematische Modellierung kann verwendet werden, um kinetische Parameter des Neurofilamenttransports einschließlich der Geschwindigkeit, der Richtungsverzerrung und des Pausungsverhaltens aus den resultierenden Daten zu extrahieren. Die Puls-Escape- und Puls-Spread-Methoden können auch angepasst werden, um den Neurofilamenttransport in anderen Nerven zu visualisieren. Mit der Entwicklung zusätzlicher transgener Mäuse könnten diese Methoden auch verwendet werden, um den axonalen Transport anderer zytoskelettaler und zytosolischer Proteine in Axonen abzubilden und zu analysieren.

Einleitung

Der axonale Transport von Neurofilamenten wurde erstmals in den 1970er Jahren durch radioisotopische Pulsbeschriftung¹demonstriert. Dieser Ansatz hat eine Fülle von Informationen über Neurofilament-Transport in vivoergeben, aber es hat relativ geringe räumliche und zeitliche Auflösung, in der Regel in der Größenordnung von Millimetern und Tagen bestenfalls². Darüber hinaus ist die radioisotopen pulsierende Kennzeichnung ein indirekter Ansatz, der die Injektion und das Opfer mehrerer Tiere erfordert, um einen einzigen Zeitverlauf zu erzeugen. Mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine und Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie in den 1990er Jahren wurde es später möglich, neurofilamenten Transport direkt in kultivierten Neuronen auf einer Zeitskala von Sekunden oder Minuten und mit Submikrometer räumlicher Auflösung abzubilden, was einen viel größeren Einblick in den Mechanismus der Bewegung³ermöglichte. Diese Studien haben gezeigt, dass Neurofilamentpolymere in Axonen sich sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen entlang von Mikrotubulispuren, angetrieben von mikrotubule motorischen Proteinen, schnell und intermittierend bewegen. Neurofilamente sind jedoch beugungsbegrenzte Strukturen mit einem Durchmesser von nur 10 nm, die in der Regel nur um zig Nanometer von ihren Nachbarn entfernt sind; Daher können die Polymere nur in kultivierten Neuronen verfolgt werden, die dünn verteilte Neurofilamente enthalten, so dass die beweglichen Polymere von ihren Nachbarn gelöst werden können⁴. Daher ist es derzeit nicht möglich, einzelne Neurofilamente in Axonen zu verfolgen, die reichlich Neurofilamentpolymere enthalten, wie z. B. myelinierte Axone.

Um den axonalen Transport von Neurofilamenten in neurofilamentreichen Axonen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu analysieren, verwenden wir eine fluoreszenz-Photoaktivierungs-Puls-Escape-Methode, die wir entwickelt haben, um das langfristige Pausungsverhalten von Neurofilamenten in kultivierten Nervenzellen^4,5zu untersuchen. Neurofilamente, die mit einem photoaktivierbaren fluoreszierenden Neurofilament-Fusionsprotein markiert sind, werden in einem kurzen Segment von Axon aktiviert, und dann wird die Abflugrate dieser Filamente aus der aktivierten Region durch Messung des Fluoreszenzzerfalls im Laufe der Zeit quantifiziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es sich um eine Populations-Level-Analyse des Neurofilamenttransports handelt, die auf einer Zeitskala von Minuten oder Stunden angewendet werden kann, ohne die Bewegung einzelner Neurofilamentpolymere verfolgen zu müssen. Zum Beispiel haben wir diese Methode verwendet, um die Kinetik des Neurofilamenttransports in myelinierenden Kulturen zu analysieren⁶.

Kürzlich beschrieben wir die Entwicklung einer hThy1-paGFP-NFM transgenen Maus, die niedrige Konzentrationen eines paGFP-markierten Neurofilament-Proteins M (paGFP-NFM) in Neuronen unter der Kontrolle des menschlichen neuronspezifischen Thy1-Promotors⁷ausdrückt. Diese Maus ermöglicht die Analyse des Neurofilamenttransports in situ mittels Fluoreszenzmikroskopie. In diesem Artikel beschreiben wir die experimentellen Ansätze zur Analyse des Neurofilamenttransports in myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen mit zwei Ansätzen. Der erste dieser Ansätze ist die oben beschriebene Puls-Escape-Methode. Diese Methode kann Informationen über das Pausungsverhalten der Neurofilamente generieren, ist aber blind für die Richtung, in der die Filamente den aktivierten Bereich abfahren, und erlaubt daher keine Messung der Nettorichtung und Transportgeschwindigkeit⁸. Der zweite dieser Ansätze ist eine neue Puls-Spread-Methode, bei der wir nicht nur den Verlust der Fluoreszenz aus der aktivierten Region analysieren, sondern auch die vorübergehende Zunahme der Fluoreszenz in zwei flankierenden Fenstern, durch die sich die fluoreszierenden Filamente bewegen, während sie den aktivierten Bereich sowohl anterograde als auch retrograde Richtungen ablassen. In beiden Ansätzen können Parameter des Neurofilamenttransports wie Durchschnittsgeschwindigkeit, Nettorichtungund Pausierungsverhalten durch mathematische Analyse und Modellierung der Fluoreszenzveränderungen in den Messfenstern ermittelt werden. Abbildung 3 zeigt diese beiden Ansätze.

Dieses Protokoll demonstriert die Zerlegung und Vorbereitung des Nervs, Aktivierung und Bildgebung der paGFP Fluoreszenz, und Quantifizierung des Neurofilament-Transports aus den erfassten Bildern mit dem FIJI-Verteilungspaket von ImageJ⁹. Wir verwenden den Tibianerv, weil er lang ist (mehrere cm) und nicht verzweigt; Grundsätzlich ist jedoch jeder Nervenausdruck paGFP-NFM für die Verwendung mit dieser Technik geeignet, wenn es seziert und entmantelt werden kann, ohne die Axone zu beschädigen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Ohio State University genehmigt.

1. Vorbereitung der Nervensalinelösung

1. Machen Sie 100 ml Breuer-Salzlinie¹⁰: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 1,5 mM CaCl₂, 5,6% D-Glucose, 23,8 mM NaHCO₃ in doppelt destilliertem Wasser.
2. Blase 95% Sauerstoff/5% Kohlendioxid (Carbogen) durch die Saline-Lösung für mindestens 30 Minuten vor der Verwendung. Rest-Saline kann innerhalb einer Woche wiederverwendet werden; es muss jedoch vor jedem Gebrauch reoxygeniert werden.
3. Gießen Sie sauerstoffhaltige Saline in eine 60 ml Spritze und stellen Sie sicher, dass nur noch wenig Luft in der Spritze vorhanden ist.

2. Erstmontage der Nervenperfusionskammer

1. Schließen Sie die Spritze und den Schlauch wie in Abbildung 1Adargestellt an und legen Sie das Abflussrohr in einen Abfallkolben.
2. Legen Sie die äußere Dichtung in das Perfusionskammergehäuse, um sicherzustellen, dass die Ein- und Auslasspfosten mit den Löchern in der Dichtung ausgerichtet sind.
3. Legen Sie die Innendichtung (Silikon, 100 m dick) auf einen #1,5 kreisförmigen Deckelschlupf (40 mm Durchmesser) und glätten Sie sorgfältig alle Falten in der Dichtung, um eine enge Abdichtung zu gewährleisten. Um die spätere Montage zu erleichtern, legen Sie den Deckel und die Dichtung auf ein Papiertuch oder das Aufgabentuch mit nach oben gerichteter Dichtung.

3. Dissektion und Vorbereitung des Maus-Tibialnervs

1. Opfern Sie das Tier durch Kohlendioxid-Inhalation oder eine andere institutionell zugelassene Methode. Starten Sie einen Timer, wenn das Tier die Bewegung/Atmung einstellt, da Experimente nur innerhalb von 3 Stunden nach Opfer⁷durchgeführt werden dürfen.
2. Sprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol und entfernen Sie so viel wie möglich von den Beinen und Rücken des Tieres mit einem elektrischen Rasiermesser.
3. Mit einer großen Sezierschere, machen Sie einen dorsalen Schnitt in der Haut in der Nähe der Mitte der Wirbelsäule und setzen Sie den Schnitt um den ventralen Aspekt des Tieres fort. Ausgehend von diesem Schnitt, reflektieren Sie langsam die Haut von den Beinen, indem Sie sie sanft vom Muskel wegziehen und die Faszien schneiden.
4. Legen Sie das Tier in eine Supine-Position auf eine Sezierschale und heften Sie alle vier Pfoten an. Optional den Schwanz festanheften, um die Bewegung weiter zu reduzieren.
5. Mit MikrodissektionSchere, machen einen Schnitt in den Oberschenkelmuskeln auf halbem Weg zwischen Dem Schwanz und Knie, um den Ischiasnerv auszusetzen. Stellen Sie sicher, dass der Nerv, der durch den Muskel sichtbar ist, nicht geschnitten wird.
6. Erweitern Sie den Schnitt dorsal und ventral, um den Muskel zu entfernen. In ähnlicher Weise entfernen Sie die Muskeln der Wade, halten Schnitte flach und kurz, um schäden Nerven zu vermeiden.
7. Entfernen Sie Muskeln, bis der Tibianerv vollständig von dem Punkt ausgesetzt ist, an dem er vom Ischiasnerv (am Knie) bis zur Ferse zweigt (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Vermeiden Sie in allen Schritten einschließlich und nach der Zerlegung des Tibianervs eine unnötige Exposition gegenüber Umgebungslicht, um eine mögliche zufällige Aktivierung von paGFP im Nerv zu minimieren.
8. Greifen Sie den Tibianerv am rücken-proximalen Ende mit einer Zange und schneiden Sie den Nerv mit einer Mikrodissektionsschere. Achten Sie darauf, keine Spannung auf den Nerv zu setzen, heben Sie es weg von den Muskeln, schneiden Sie alle Befestigungen.
9. Schneiden Sie das rückendistale Ende des Tibianervs und übertragen Sie auf eine kleine Petrischale mit Raumtemperatur sauerstoffhaltiger Saline. Von diesem Punkt an in der Prozedur, immer sicher sein, den Überblick über die proximalen und distalen Enden des Nervs zu halten.
   HINWEIS: Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist das distale Ende des Nervs mit einem abgewinkelten Schnitt zu markieren, so dass die Verjüngung sichtbar ist.
10. Ausgehend vom proximalen Ende des Nervs, greifen Sie vorsichtig die exponierten Axonenenden mit einem Paar sehr feinspitzen Zangen.
11. Mit einem zweiten Zangenpaar die Nervenhülle proximal greifen und langsam zum distalen Ende des Nervs ziehen. Die Nervenscheide gleitet mit minimalem Widerstand entlang der Axone. Stellen Sie sicher, dass während dieses Prozesses keine übermäßige Spannung auf den Nerv angewendet wird.

4. Endnervenperfusionskammer-Montage

1. Das proximale Ende des Nervs erfassen, aus der Formlinlinie entfernen und langsam auf den Deckelrutsch der Perfusionskammer innerhalb der rechteckigen Öffnung der inneren Dichtung legen, wobei eine sanfte Spannung des Nervs beibehalten wird, während Sie ihn so hinlegen, dass er gerade liegt.
2. Platzieren Sie das Mikroaquedukt-Dia über den Nerv mit der gerillten Seite zum Nerv und der Strömungsrichtung parallel zum Nerv. Drehen Sie die Deckelrutsch- und Mikroaquädukt-Baugruppe um und legen Sie sie in das Perfusionskammergehäuse mit dem Mikroaqueduktschlitten, der auf die äußere Dichtung aufgebracht ist. Die Nerven- und umgebende Innendichtung wird nun zwischen dem Deckelrutsch und dem Mikroaqueduktschlitten eingeklemmt, die durch die Dichtung getrennt sind, wobei der Deckelnachoben(Abbildung 1B) nach oben gerichtet ist ( Abbildung 1B ).
3. Sichern Sie die Perfusionskammer, indem Sie sie in das Metallgehäuse legen und den Verriegelungsring drehen. Stellen Sie sicher, dass sich das Kunststoffgehäuse vollständig unter allen Metallklammern befindet, und ziehen Sie es gut an, um ein Wasserhautleck zu vermeiden. Eine Überspannung kann den Mikroaqueduktschlitten oder den Deckelrutsch knacken. Drehen Sie die Kammer um, so dass der Deckelschlupf nach unten gerichtet ist.
4. Drücken Sie den Salinespritzenkolben langsam, um die Perfusionskammer zu füllen. Halten Sie den Ein- und Auslassschlauch, den Auslasskolben und die Spritze während des Aufbaus und der Bildgebung jederzeit über der Kammer selbst erhöht. Dadurch wird ein Absiphoning vermieden, das Blasen auslösen oder aufgrund des Unterdrucks in der Kammer zu Fokusinstabilität führen kann.
5. Übertragen Sie die Perfusionsbaugruppe auf eine invertierte Mikroskopstufe und montieren Sie die Salinespritze in die Spritzenpumpe. Starten Sie den Motor mit einer entsprechenden Drehzahl bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/min. Dann verbinden und schalten Sie die Inline-Lösungsheizung auf 37 °C eingestellt.
6. Schließen Sie die Objektivheizung an und stellen Sie sie auf 37 °C ein, tragen Sie Öl auf das Objektiv auf und legen Sie die Perfusionskammer in die Stufenhalterung ein.
7. Öl auf das Kammerheizpad auftragen und an der Perfusionskammer befestigen. Schließen Sie die Kammerheizung an und schalten Sie sie ein; auf 37 °C eingestellt.
   HINWEIS: Temperaturänderungen können dazu führen, dass sich in der Perfusionskammer Blasen bilden, da die Lösung ausgäuert wird. Wenn sich Blasen bilden, erhöhen Sie kurz die Lösungsdurchflussrate um 5-10x, bis Blasen die Kammer räumen.
8. Verriegeln Sie die Perfusionskammer in den Bühnenadapter und bringen Sie das Objektivöl mit dem Deckelschlupf an der Unterseite der Kammer in Kontakt.
   HINWEIS: Die hier verwendete Bioptechs-Kammer mit ASI-Bühnenadapter ist für eine invertierte Mikroskopkonfiguration ausgelegt.

5. Fluoreszenzaktivierung und Bildaufnahme

1. Konzentrieren Sie sich bei der Beleuchtung mit hellen Felden auf die Achselschicht auf der unteren Oberfläche des Nervs, der der Deckbedeckungsoberfläche am nächsten liegt (Abbildung 2B). Myelinierte Axone (typischerweise 1 - 6 m Im Durchmesser bei erwachsenen Mäusen) können durch das Vorhandensein eines Myelinmantels identifiziert werden, der unter hellfelddurchlässiger Lichtbeleuchtung ohne Kontrastverbesserung sichtbar ist. Schmidt-Lanterman Spalten und Knoten von Ranvier sind auch leicht zu erkennen. Unmyelinierte Axone sind schlanker (typischerweise <1 m Durchmesser) und sind in der Regel in Bündeln (Remak-Bundles) vorhanden, wo sie in der Regel zu eng aufeinander abgewogen werden.
2. Wenn auf dem Mikroskop verfügbar ist, aktivieren Sie das Autofokus-System, um den Fokus während der Zeitraffer-Bildgebung zu erhalten.
3. Erfassen Sie ein hellfeld-Referenzbild. Zeichnen Sie die Ausrichtung des Nervs (spine-proximale und distale Enden) in Bezug auf Bilder auf.
4. Erfassen Sie ein konfokales Bild mit einem 488 nm Laser und einem emissionsfilter, der für paGFP geeignet ist (z. B. 525/50 nm), um die Vorbleichautofluoreszenz aufzuzeichnen. Halten Sie die Laserleistung niedrig, um Photobleichungen zu minimieren, wobei die Belichtungszeit entsprechend angepasst wird, um das schwache Signal zu erkennen. So wurden beispielsweise repräsentative Daten mit einer Laserleistung von 5 % und einer Belichtung von 4 s ermittelt. Zeichnen Sie die Erfassungseinstellungen für alle zukünftigen Experimente auf.
   HINWEIS: Nach der Photoaktivierung erzeugen die idealen Bildeinstellungen ein Signal-Rausch-Verhältnis > 8 und Photobleichung von weniger als 25 % des ursprünglichen Signals im Laufe von 20 Bildern. Die Axone können auch durch Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, wie wir es ursprünglich⁷taten, aber die Bildqualität wird aufgrund mangelnder Konfokalität schlechter sein.
5. Stellen Sie die Laserleistung auf etwa das 5-fache der normalen Bildleistung ein und erfassen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von 3-4 Minuten. Obwohl dieser Schritt nicht unbedingt erforderlich ist, wird empfohlen, Autofluoreszenz und andere Quellen unerwünschter Fluoreszenz zu bleichen, um das Hintergrundsignal zu reduzieren und so das Signal-zu-Rauschen der photoaktivierten Fluoreszenz zu maximieren.
6. Erfassen Sie ein Bild mit den in Schritt 5.4 verwendeten Einstellungen, um die Autofluoreszenz vor der Aktivierung nach diesem Bleichschritt aufzuzeichnen.
7. Zeichnen Sie auf dem Hellfeldbild eine Linie parallel zu den Axonen mit einer Länge, die der gewünschten Aktivierungsfenstergröße entspricht. Die Länge dieses Fensters variiert je nach dem experimentellen Ziel und den Parametern, aber die typischen Längen sind 5 'm für das Puls-Escape-Paradigma und 40 'm für das Puls-Spread-Paradigma.
8. Zeichnen Sie diese Linie als Leitfaden, indem Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI) über das Sichtfeld ziehen, das senkrecht zu den Axonen liegt. Die Region muss alle Axone umfassen, die fotoaktiviert werden sollen.
9. Bestimmen Sie optimale Einstellungen für die Photoaktivierung mit 405 nm Beleuchtung.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt und diese Unterschritte nur vor der ersten experimentellen Aktivierung aus. Im Laufe eines Experiments müssen die gleichen Fotoaktivierungseinstellungen verwendet werden.
   1. Aktivieren Sie wiederholt einen Bereich von Interesse mit der 405 nm Laserlinie, geringer Laserleistung (z. B. 5%) und Pixelverweilzeit (z. B. 40 s) und einem Impuls, um nach jeder Aktivierung ein Bild der aktivierten GFP-Fluoreszenz zu erhalten. Wiederholen Sie dies, bis die Fluoreszenz nicht mehr zunimmt, und quantifizieren Sie dann die Fluoreszenz in einer Region, die für jedes Bild von Interesse ist.
   2. Zeichnen Sie die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten im Vergleich zur Pulszahl. Wählen Sie die Anzahl der Impulse aus, nach denen die Fluoreszenz nicht mehr steigt, da die optimale Anzahl von Impulsen für die Aktivierung ist.
10. Aktivieren Sie die paGFP-Fluoreszenz der region, die in Schritt 5.8 durch gemusterte Anregung mit 405 nm Licht gezeichnet wird. Stellen Sie sicher, dass ein Bild kurz vor und kurz nach der Aktivierung aufgenommen wird.
    HINWEIS: Die ideale paGFP-Aktivierung erzeugt einen klar definierten Fluoreszenzbereich mit scharfen Grenzen, die im ROI enthalten sind.
11. Starten Sie einen 1-Minuten-Timer, wenn die Aktivierung abgeschlossen ist. Am Ende von 1 Minute beginnen Sie mit der Erfassung einer Zeitrafferserie.
    HINWEIS: Die 1 Minute Verzögerung ist notwendig, um die Erhöhung der Fluoreszenz zu ermöglichen, die nach der Photoaktivierung von paGFP¹¹beobachtet wird. Für die Puls-Spread-Methode reicht eine Erfassungsdauer von 5-10 Minuten mit 30 Sekunden Zeitrafferintervallen aus, um die Anfangsneigungen in den Mittel- und Flankenfenstern zu messen, um Geschwindigkeit und Richtungsweise zu messen. Für die Puls-Escape-Methode ermöglicht eine Erfassungsdauer von 30-150 Minuten mit 5 oder 10 Minuten Zeitrafferintervallen die Analyse des langzeitpausigen Verhaltens der Filamente
12. Speichern Sie alle aufgenommenen Bilder sowie den ROI, der für die Fluoreszenzaktivierung verwendet wird.
13. Wechseln Sie zu einer neuen Region des Nervs und wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.11. Wenn sich die neue Region entlang desselben Axons befindet, muss sie mindestens 500 m von der zuvor aktivierten Region entfernt sein, um den Nachweis von fluoreszierenden Neurofilamenten zu vermeiden, die sich aus der anderen aktivierten Region entfernt haben. Die Erfassung des letzten Zeitraffers muss vor dem Ende des 3-Stunden-Fensters abgeschlossen sein.
    HINWEIS: Es ist möglich, dass die Zubereitung länger als 3 Stunden lebensfähig ist, aber wir haben das nicht bestätigt. Mit kompetenter Sezierung und Vorbereitung können innerhalb dieses 3-Stunden-Fensters zwischen fünf und acht 10-minuten-Zeitraffer-Bildsätze erfasst werden.
14. Nach dem Erwerb der letzten Zeitraffer-Bildserie stoppen Sie den Fluss der Saline, trennen Sie die Lösung und die Kammerheizungen und entfernen Sie das Perfusionsgerät aus der Mikroskopstufe.

6. Flatfield- und Dunkelfeld-Bildaufnahme

1. Machen Sie eine Lösung von Fluorescein, indem Sie 250 mg Fluoresceinpulver zu 0,5 ml doppelt destilliertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie, bis keine sichtbaren Partikel vorhanden sind, und drehen Sie die Lösung 30 Sekunden lang in einer Tischzentrifuge, um ungelöstes Material zu sedimentieren. Diese Lösung kann bei Lichteinwirkung für mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden.
2. Fügen Sie 8 l Fluorescein-Lösung zu einem Dia hinzu und tragen Sie einen #1.5-Abdeckungsfolie auf. Überschüssige Flüssigkeit ablassen, mit Nagellack abdichten und trocknen lassen.
   HINWEIS: Bei dieser hohen Konzentration löscht die starke Absorption des Fluoresceinfarbstoffs den leuchtenden Strahl innerhalb der Lösung aus und erzeugt eine dünne Fluoreszenzebene an der Oberfläche des Abdeckschlupfes, die gleichmäßig und resistent gegen Photobleichungen durch schnellen diffusiven Austausch¹²ist.
3. Legen Sie den Fluorescein-Schiebedeckel seitlich nach unten auf die invertierte Mikroskopstufe und passen Sie den Fokus auf die dünne Fluoreszenzebene an der Oberfläche des Coverslips an. Bewegen Sie sich auf der Folie, um ein Sichtfeld zu finden, das keine Luftblasen (dunkle Flecken) oder große Fluoresceinpartikel (helle Flecken) enthält.
4. Erfassen Sie einen Z-Stack, der sich in 0,2 m Intervallen über 6 m erstreckt, sodass das mittlere Bild die ursprüngliche Fokusebene ist. Verwenden Sie eine kurze Belichtungszeit (z. B. 40 ms), da die Fluoreszenz sehr hell ist. Diese Z-Stack-Erfassung ist notwendig, um die maximale Fluoreszenz über das Sichtfeld zu erfassen, da der Deckschrutsch selten perfekt horizontal ist und die Fluoreszenzebene sehr schmal ist. Wiederholen Sie dies für insgesamt 25 Sichtfelder, indem Sie die Bühne um mindestens 20 m in eine beliebige Richtung zwischen den Feldern verschieben.
5. Schließen Sie alle Lichtwegläden, einschließlich des Kameraverschlusses, und stellen Sie die Laserleistung und die Belichtungszeit auf Null ein. Erfassen Sie einen Stapel von 100 Bildern mit diesen Einstellungen. Diese Bilder werden gemittelt, um das Dunkelfeldbild zu erzeugen, das verwendet wird, um für dunklen Strom und den Vorspannungsversatz auf dem Kamerachip zu korrigieren.
   HINWEIS: Die Streaming-Erfassung ist eine ideale Möglichkeit, diese Bilder zu erfassen.

7. Bildgärlykolytisch gehemmte Nerven zur Bleichkorrektur

1. Machen und sauerstoffhaltige eine Saline-Lösung wie in Schritt 1; jedoch 2-Deoxy-D-Glucose für D-Glucose ersetzen und 0,5 mM Natriumjodoacetat hinzufügen, um die Glykolyse zu hemmen¹³. Wir bezeichnen dies als "hemmende Saline".
2. Wiederholen Sie die Schritte 2-5 mit der hemmenden Saline, wobei ein 10-30-minütiges Zeitrafferbild in Schritt 5.11 eingestellt ist. Erlauben Sie 40-50 Minuten nach der Anwendung von hemmender Saline vor der Bildgebung, um eine vollständige Hemmung des Neurofilamenttransports zu gewährleisten.
   HINWEIS: Die glykolytische Hemmung wird schließlich die Axone töten, so dass es ein enges Zeitfenster nach der Hemmung gibt, in dem Daten erfasst werden können, in der Regel etwa 30 Minuten. Ein Indikator für den Grad der metabolischen Hemmung ist die Flavin-Autofluoreszenz der axonalen Mitochondrien, die in der Zeitrafferserie aufgrund der langen Belichtungen, die wir verwenden, um die paGFP Fluoreszenz¹⁴abzubilden, nachgewiesen werden können. Typischerweise, mitochondriale Autofluoreszenz wird während der Behandlung mit hemmender Saline erhöhen. Wenn die Mitochondrien beginnen, sich aufzurunden oder zu fragmentieren, dann beenden Sie die Bildgebung.

8. Bildverarbeitung und -analyse mit ImageJ

1. Flatfield- und Dunkelfeldkorrektur
   1. Öffnen Sie den Dunkelfeld-Bildstapel, und durchschnittlich die Bilder, indem Sie auf Bild | Stapel | Z Projekt und Auswahl der durchschnittlichen Intensität im Dropdown-Menü, um das Dunkelfeldbild zu generieren.
   2. Öffnen Sie die Fluorescein-Flachfeld-Bildstapel und erstellen Sie eine maximale Intensitätsprojektion von jedem (insgesamt 25), indem Sie auf Bild | Stapel | Z Projekt und Auswahl max Intensity im Dropdown-Menü.
   3. Kombinieren Sie die resultierenden 25 maximalen Projektionsbilder in einem Stapel, indem Sie auf Bild | Stapel | Bilder zu Stack. Erstellen Sie eine durchschnittliche Intensitätsprojektion dieses Stapels, indem Sie auf Bild | Stapel | Z Projekt und Auswahl der durchschnittlichen Intensität aus dem Dropdown-Menü, um das Flachfeldbildzu generieren.
   4. Subtrahieren Sie das Dunkelfeldbild vom Flachfeldbild, indem Sie auf Prozess | Bildrechner, und wählen Subtrahier als Vorgang aus. Stellen Sie sicher, dass die 32-Bit-Ergebnisoption (Float) aktiviert ist. Das Ergebnis ist das korrigierte Flachfeldbild.
   5. Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität des korrigierten Flachfeldbildes, indem Sie zuerst auf Analysieren | Legen Sie Die Messungen fest, und aktivieren Sie das Kästchen Mittlerer Grauwert, und drücken Sie dann die Taste "m".
   6. Dividieren Sie das korrigierte Flachfeldbild durch seine durchschnittliche Intensität, indem Sie auf Prozess | Mathe | Dividieren und Eingeben des durchschnittlichen Grauwertes in Schritt 7.1.5. Dadurch wird das inverse Gain-Bild erzeugt.
   7. Öffnen Sie die Vor- und Nachaktivierungsbilder zusammen mit dem Zeitraffer-Image-Stack. Kombinieren Sie die Bilder in einem einzigen Stapel, indem Sie auf Bild | Stapel | Werkzeuge | Verketten ,und wählen Sie die Bilder in chronologischer Reihenfolge aus den Dropdown-Menüs aus. Stellen Sie sicher, dass die Option Als 4D-Bild öffnen nicht ausgewählt ist. Der resultierende Stapel ist der vollständige Bildsatz.
   8. Wiederholen Sie Schritt 8.1.4 im vollständigen Bildsatz, und dividieren Sie das Ergebnis durch das inverse Gain-Bild, indem Sie auf Prozess | Bildrechner und wählen Sie Divide als Vorgang aus. Dadurch wird der korrigierte vollständige Bildsatzerzeugt, in dem jedes Bild für die Ungleichmäßigkeit im Bereich der Beleuchtung und auf dem Detektor korrigiert wurde.
2. Image-Stack-Ausrichtung
   1. Um die Fehlausrichtung der Bildebenen in der Zeitrafferserie aufgrund von Stufen- oder Beispieldrift zu korrigieren, installieren Sie das Alignment by fixed region plugin (Supplemental File 1) durch Klicken auf Plugins | Installieren Sie PlugIn, navigieren Sie zu dem Ordner, der die Plugin-Datei enthält, und wählen Sie das Plugin aus. Starten Sie ImageJ nach der Installation des Plugins neu.
      HINWEIS: Dieses Plugin richtet Bilder basierend auf dem "Least Squares congealing" Prinzip¹⁵aus.
   2. Zeichnen Sie einen ROI auf dem korrigierten vollständigen Bildsatz, der mehrere Axone umfasst und nicht über die proximalen und distalen Grenzen der aktivierten Fluoreszenz innerhalb jedes der Axone hinausgeht. Die Geometrie des Bereichs ist unwichtig, jedoch wird die Ausrichtung von Bereichen, in denen Strukturen Form oder Größe ändern, nicht ausgeschlossen.
   3. Führen Sie das Ausrichtungs-Plugin aus, indem Sie auf Plugins | Ausrichtung nach festem Bereich. Das Plugin platziert ein standardmäßiges 2-Pixel-Maximum auf der Verschiebung zwischen Frames, dies kann jedoch im ersten Pop-up-Fenster angepasst werden, wenn es eine signifikante Drift der Probe gibt. Die Ausrichtung kann je nach Größe des Bildstapels mehrere Minuten dauern.
   4. Überprüfen Sie den ausgerichteten Stapel visuell, um die Qualität der Ausrichtung zu bewerten. Einige Frames müssen dann möglicherweise manuell ausgerichtet werden, da die automatisierte Ausrichtung bei großen Fluoreszenzschwankungen zwischen Frames möglicherweise nicht gut funktioniert. Dies kann beim Anzeigen eines Frames erreicht werden, der durch Klicken auf Bild | verschoben werden muss. Transformieren | Übersetze. Klicken Sie im folgenden Pop-up auf Nein und fragen Sie, ob der gesamte Stapel übersetzt werden soll. Verwenden Sie nur ganzzahlige Pixelwerte in der Übersetzung, und stellen Sie sicher, dass das Menü für die Dropdown-Interpolation auf Keinefestgelegt ist, da bruchstückhafte Pixelverschiebungen oder Interpolationen die Daten aufgrund des Resamplings der Pixelintensitäten ändern.
   5. Speichern Sie dies als ausgerichteter vollständiger Bildsatz.
3. Messung der Fluoreszenzintensitäten
   1. Zeichnen Sie einen ROI mit dem Winkelwerkzeug auf dem ersten Frame des ausgerichteten vollständigen Bildsatzes mit dem ersten Arm entlang einer Kante des aktivierten Bereichs, senkrecht zu den Axonen und dem zweiten Arm vertikal. Drücken Sie die "m"-Taste, um den Winkel zu messen, der die Ausrichtung der Axone im Sichtfeld beschreibt.
   2. Legen Sie den Maßstab der Bilder so fest, dass Die Abmessungen in Mikrometern gemessen werden, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Skalierung fest, und geben Sie die entsprechenden Werte ein.
   3. Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager. Um das Puls-Escape-Paradigma zu suchen, fahren Sie mit Schritt 8.3.7 fort. Für den Puls-Spread Schritt 8.3.4 fortsetzen.
   4. Zeichnen Sie einen quadratischen ROI beliebiger Dimensionen, und klicken Sie dann auf Bearbeiten | Auswahl | Angeben . Stellen Sie sicher, dass die Option Skalierte Einheiten aktiviert ist, und legen Sie dann den ROI auf eine Breite von 15 m und eine Höhe fest, die der Höhe des Bildes entspricht oder größer ist.
   5. Drehen Sie den ROI um den in Schritt 8.3.1 gemessenen Winkel, indem Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen Sie, um es senkrecht zu den Axonen zu machen, und platzieren Sie den ROI mit einer Seite entlang der proximalen Kante des aktivierten Bereichs. Fügen Sie diesen ROI, den wir als proximalen Guide ROI bezeichnen, dem Manager hinzu, indem Sie die Taste "t" drücken.
   6. Ziehen Sie den ROI, um ihn an der distalen Kante der aktivierten Region auszurichten, und fügen Sie den ROI-Manager erneut hinzu, indem Sie die Taste "t" drücken. Wir werden dies als den distalen Führer ROI bezeichnen. Die proximalen und distalen Führungs-ROIs werden später verwendet, um die flankierenden Mess-ROIs zu zeichnen.
   7. Wählen Sie Axone für die Quantifizierung aus, indem Sie die in Schritt 5.11 oben erfasste Zeitrafferbildsequenz verwenden. Diese Bildsequenz ist für diesen Zweck hilfreich, da sie die schwache Autofluoreszenz der Axone erfasst und ihre Morphologie außerhalb der aktivierten Region enthüllt.
      HINWEIS: Axone, die die folgenden Kriterien nicht erfüllen, sind von der Analyse ausgeschlossen:
      1. Axone müssen über die gesamte Länge aller Messfenster im Fokus stehen.
      2. Axone müssen innerhalb von 5° senkrecht zu den proximalen und distalen Enden des Aktivierungsbereichs liegen.
      3. Axone dürfen keine Invaginationen innerhalb von 5 m von den proximalen und distalen Enden des Aktivierungsbereichs haben.
      4. Axone ausschließen, die sich während der Bildgebung sichtbar verändern.
      5. Axone ausschließen, die ungesund erscheinen, wie das Fehlen einer diskreten aktivierten Region im Bild nach der Aktivierung zeigt(Abbildung 2C, unten), da dies auf eine diffusive Dispersion der aktivierten Fluoreszenz hindeutet, die auftritt, wenn das Axon stirbt.
   8. Beobachten Sie das Langbelichtungsbleichbild ab Schritt 5.5 für autofluoreszierende Strukturen innerhalb von Axonen. Diese Fluoreszenz ist auf Flavinen innerhalb von Mitochondrien¹⁶zurückzuführen. Axone aus der Analyse ausschließen, wenn diese Mitochondrien gerundet oder fragmentiert erscheinen (Abbildung 2D, unten), im Gegensatz zu erweiterten, linearen Strukturen (Abbildung 2D, oben), da dies ein Hinweis auf den metabolischen Rückgang ist.
   9. Zeichnen Sie anhand der oben erstellten proximalen und distalen Führungs-ROIs drei MessROIs pro analysiertem Axon: ein zentrales Fenster, das das Axon innerhalb des aktivierten Bereichs von 40 m umfasst, und zwei flankierende Fenster mit einer Breite, die durch ein flankierendes Fenster von 15 m ROIs eingeschränkt ist, und eine Höhe, die durch den Durchmesser des Axons am Rand des Aktivierungsbereichs begrenzt ist. Fügen Sie alle drei Regionen zum ROI-Manager hinzu. Zeichnen Sie bei glykolytisch gehemmten Axonen einen einzelnen Bereich, der nicht mehr als 5 m breit ist, in der Mitte des aktivierten Bereichs und der sich nicht außerhalb des Axons erstreckt. Für das Puls-Escape-Paradigma ist der aktivierte Bereich nur 5 m breit, so dass das gesamte Fenster verwendet werden muss.
   10. Wiederholen Sie Schritt 8.3.9 für alle Axone, die die Kriterien der Schritte 8.3.7 und 8.3.8 erfüllen.
   11. Festlegen aktiver Messungen auf die durchschnittliche Pixelintensität, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest, und wählen Sie die Option Mittlerer Grauwert aus. Stellen Sie sicher, dass keine anderen Messoptionen überprüft werden.
   12. Wählen Sie alle ROIs im ROI-Manager-Fenster aus, indem Sie das Fenster auswählen und 'Strg' + 'a' drücken. Klicken Sie im Fenster ROI-Manager auf Mehr | Multi-Messung zur Messung der Fluoreszenzintensitäten. Kopieren Sie die Daten aus dem Ergebnisfenster zur weiteren Analyse in eine Kalkulationstabelle.
   13. Festlegen aktiver Messungen auf Regionsbereich, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Die Messungen fest, und wählen Sie die Option Bereich aus. Stellen Sie sicher, dass keine anderen Messoptionen überprüft werden.
   14. Wiederholen Sie Schritt 8.3.12. Es ist nur notwendig, eine Zeile der Ergebnisse für den Bereich zu kopieren, da der Bereich nicht mit der Zeit variiert.

9. Photoblebleiche-Korrektur

1. Subtrahieren Sie in der Datentabelle für glykolytisch gehemmte Axone die mittlere Fluoreszenz von Frame 1 (dem Voraktivierungsrahmen) von der mittleren Fluoreszenz jedes Frames ab Frame 3 (dem ersten Zeitrafferrahmen) für einen gegebenen ROI. Die Ergebnisse sind die hintergrundsubtrahierten Mittelwerte.
2. Zeichnen Sie die Daten als Streudiagramm mit den Framenummern als Abszisse. Passen Sie eine exponentielle Trendlinie an die Daten aus jedem ROI (die meisten Tabellenkalkulationsprogramme haben diese Funktion) mit einer Gleichung in Form von Ae^-bxan. Diese Gleichung entspricht der Photobleichfunktion F_t = F₀ * e^-tɣ wobei F₀ die Fluoreszenz beim ersten Frame des Zeitraffers ist, ɣ die exponentielle Bleichrate ist, t die Zeit und e die natürliche Logarithmusbasis ist.
3. Wiederholen Sie die Schritte 9.1.1-9.1.2 für alle ROIs aller Axone aus den glykolytisch gehemmten Nerven. Für die genaueste Schätzung der Photobleichrate verwenden Sie insgesamt mindestens 15 Axone von mindestens 5 separaten Nerven. Verwenden Sie den Durchschnitt der exponentiellen Bleichraten (ɣ) aller gehemmten Axone, um die experimentellen Daten für photobleaching zu korrigieren. Für jedes Experiment oder jede Studie muss eine neue Bleichkalibrierung durchgeführt werden, da das Photobleichen von den Bildaufnahmeeinstellungen und der Laserleistung abhängt, die sich im Laufe der Zeit ändern kann.
4. Wiederholen Sie Schritt 9.1.1 für alle Achsenbereiche, die mit normaler Kochung dargestellt sind (d. h. nicht glykolytisch gehemmt).
5. Teilen Sie jeden Datenpunkt durch^e-tɣ, wobei die Zeit für t und die durchschnittliche ɣ in Schritt 9.1.3 verwendet werden. Dies sind die photobleichkorrigierten Mittel.
6. Multiplizieren Sie jeden Datenpunkt mit dem Gebiet für diese Interessenregion, um die gesamtfluoreszenzierte Fluoreszenz in dieser Region zu jeder Zeit zu ermitteln.

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder von Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten. Wir haben mehrere Studien veröffentlicht, die Daten beschreiben, die mit der Puls-Escape-Methode und unseren Methoden zur Analyse dieser^Daten5^,6,7,8,17. Im Folgenden zeigen wir, wie die Puls-Spread-Daten Informationen über die Richtung und Ge...

Diskussion

Bei der Analyse von Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten ist Vorsicht geboten, da ein erhebliches Potenzial für die Einschleppung von Fehlern während der Nachbearbeitung, vor allem während der Flachfeldkorrektur, Bildausrichtung und Bleichkorrektur, besteht. Die Flachfeldkorrektur ist notwendig, um die Ungleichmäßigkeit in der Beleuchtung zu korrigieren, was zu einem Rückgang der Intensität über das Sichtfeld von der Mitte zur Peripherie führt. Das Ausmaß der Ungleichmäßigkeit ist wellenlängenabhängig ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors