Изображение и анализ нейрофиламента транспорта в акцизных мышь Tibial нерва

Резюме

Мы описываем методы флуоресценции фотоактивации для анализа аксонального переноса нейрофилаций в одиночных миелинированных аксонах периферических нервов от трансгенных мышей, которые выражают фотоактивируемый белок нейрофиламента.

Аннотация

Нейрофиламентные белковые полимеры перемещаются по аксонам в медленном компоненте аксонального транспорта со средней скоростью 0,35-3,5 мм в день. До недавнего времени изучение этого движения на месте было возможно только с помощью радиоизотопного пульсового маркировки, что позволяет анализировать аксональный транспорт в целых нервах с временным разрешением дней и пространственным разрешением миллиметров. Для изучения нейрофиламента транспорта на месте с более высоким висовым и пространственным разрешением, мы разработали hThy1-paGFP-NFM трансгенной мыши, которая выражает нейрофиламент белка M помечены фотоактивируемым GFP в нейронах. Здесь мы описываем флуоресценции фотоактивности пульс-побег и импульс-распространения методов для анализа нейрофиламента транспорта в одной миелинированной аксонов тибиальных нервов от этих мышей ex vivo. Изолированные сегменты нерва поддерживаются на стадии микроскопа перфузией с кислородом солевым раствором и изображения спиннинг диска конлокальной флуоресценции микроскопии. Фиолетовый свет используется для активации флуоресценции в коротком аксональном окне. Флуоресценция в активированных и фланговых областях анализируется с течением времени, что позволяет изучить транспортировку нейрофиламента с висовым и пространственным разрешением на порядок минут и микрон, соответственно. Математическое моделирование может быть использовано для извлечения кинетических параметров нейрофильтра транспорта, включая скорость, направленность и приостановощающее поведение из полученных данных. Методы пульса-побега и пульс-распространения также могут быть адаптированы для визуализации нейрофильтрамента транспорта в других нервах. С развитием дополнительных трансгенных мышей, эти методы могут также быть использованы для изображения и анализа аксональная транспорт других цитоскелетных и цитозолических белков в аксонах.

Введение

Аксональный транспорт нейрофиламентов был впервые продемонстрирован в 1970-х годах радиоизотопной пульсовой маркировкой¹. Этот подход дал огромное количество информации о нейрофильтра транспорта in vivo, но он имеет относительно низкий пространственный и временное разрешение, как правило, на порядок миллиметров и дней в лучшем случае². Кроме того, радиоизотопная маркировка пульса является косвенным подходом, который требует инъекций и жертвоприношения нескольких животных для создания единого временного курса. С открытием флуоресцентных белков и достижений в флуоресценции микроскопии в 1990-х годов, впоследствии стало возможным изображение нейрофильтра транспорта непосредственно в культивируемых нейронов на шкале времени секунд или минут и с суб-микрометрового пространственного разрешения, предоставляя гораздо больше понимания механизма движения³. Эти исследования показали, что нейрофиламентные полимеры в аксонах быстро и периодически перемещаются как в антероградных, так и в ретроградных направлениях вдоль микротрубочек, движимых микротрубочками моторных белков. Тем не менее, нейрофиламенты дифракционно-ограниченные структуры всего 10 нм в диаметре, которые, как правило, расположены отдельно от своих соседей только на десятки нанометров; Таким образом, полимеры могут быть отслежены только в культивируемых нейронов, которые содержат редко распределенных нейрофиламентов, так что движущиеся полимеры могут быть решены от своих соседей⁴. Таким образом, в настоящее время невозможно отследить одиночные нейрофиламенты в аксонах, которые содержат обильные полимеры нейрофиламента, такие как миелинизированные аксоны.

Для анализа аксональной транспортировки нейрофилаций в нейрофиламент богатых аксонов с использованием флуоресценции микроскопии, мы используем флуоресценции фотоактивности импульс-побег метод, который мы разработали для изучения долгосрочного паузы поведение нейрофилаций в культивируемых нервных клеток^4,5. Нейрофиламенты, помеченные фотоактивируемым флуоресцентным нейрофильтрным синтезом белка, активируются в коротком сегменте аксона, а затем скорость отхода этих нитей из активированной области количественно измеряется путем измерения флуоресценции распада с течением времени. Преимуществом такого подхода является то, что это анализ нейрофильтрации на уровне населения, который может применяться в времени минут или часов без необходимости отслеживать движение отдельных полимеров нейрофиламента. Например, мы использовали этот метод для анализа кинетики нейрофильтрации транспорта в миелинирующих культур⁶.

Недавно мы описали развитие hThy1-paGFP-NFM трансгенной мыши, которая выражает низкий уровень paGFP-тегами нейрофильтр белка M (paGFP-NFM) в нейронах под контролем человека нейрон-специфический Thy1 промоутер⁷. Эта мышь позволяет анализировать нейрофильтр транспортировки на месте с помощью флуоресценции микроскопии. В этой статье мы описываем экспериментальные подходы для анализа нейрофильтра транспорта в миелинированных аксонов тибиальных нервов от этих мышей с использованием двух подходов. Первый из этих подходов является описанным выше методом пульс-побега. Этот метод может генерировать информацию о приостановке поведения нейрофиламентов, но слеп к направлению, в котором нити отходят от активированной области, и, следовательно, не позволяет измерить чистую направленность и скорость транспортировки⁸. Второй из этих подходов представляет собой новый метод пульса распространения, в котором мы анализируем не только потерю флуоресценции из активированного региона, но и переходное увеличение флуоресценции в двух фланговых окнах, через которые перемещаются флуоресцентные нити при отходе от активированной области как в ангерозном, так и в ретроградном направлениях. В обоих подходах такие параметры нейрофильтра, как средняя скорость, чистая направленность и приостановление поведения, могут быть получены с помощью математического анализа и моделирования изменений флуоресценции в измерительных окнах. Рисунок 3 иллюстрирует эти два подхода.

Этот протокол демонстрирует вскрытие и подготовку нерва, активацию и визуализацию флуоресценции paGFP, а также количественную оценку транспортировки нейрофиламента из приобретенных изображений с использованием пакета распределения FIJI ImageJ⁹. Мы используем тибиальный нерв, потому что он длинный (несколько см) и не ветвиется; однако, в принципе любой нерв, выражаюющий paGFP-NFM подходит для использования с этой техникой, если он может быть рассечен и де-шейт без повреждения аксонов.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета штата Огайо.

1. Приготовление нервного солевого раствора

1. Сделать 100 мл солевого раствора Брейера¹⁰: 98 мМ NaCl, 1 мМ ККл, 2 мМ КХ₂PO₄, 1 мМ MgSO₄, 1,5 мМ CaCl₂, 5,6% D-глюкозы, 23,8 мМ NaHCO₃ в двойной диготированной воде.
2. Пузырь 95% кислорода / 5% углекислого газа (карбоген) через солевой раствор, по крайней мере 30 минут до использования. Оставшийся солевой раствор можно повторно разысысыть в течение одной недели; однако, он должен быть reoxygenated перед каждым использованием.
3. Налейте кислородом солевой раствор в шприц 60 мЛ и убедитесь, что в шприце остается минимальный воздух.

2. Первоначальная сборка камеры перфузии нерва

1. Подключите шприц и трубки, как показано на рисунке 1A,помещая трубку оттока в колбу с отходами.
2. Поместите внешнюю прокладку в корпус камеры перфузии, гарантируя, что входные и выходные столбы выровнены с отверстиями в прокладке.
3. Положите внутреннюю прокладку (силикон, 100 мкм толщиной) на #1,5 круговой крышкой (диаметр 40 мм), тщательно разглаживая любые морщины в прокладке, чтобы обеспечить плотное уплотнение. Чтобы облегчить более поздную сборку, поместите крышку и прокладку на бумажное полотенце или салфетку задачи с прокладкой вверх.

3. Рассечение и подготовка мыши tibial нерва

1. Пожертвование животного путем вдыхания углекислого газа или другого институционально утвержденного метода. Запустите таймер, когда животное перестает движение / дыхание, как эксперименты должны быть проведены только в течение 3 часов после жертвоприношения⁷.
2. Спрей меха с 70% этанола и удалить как можно больше из ног животного и обратно с помощью электрической бритвы.
3. Используя пару больших ножниц вскрытия, сделать спинной разрез в коже вблизи середины позвоночника и продолжить разрез вокруг брюшной аспект животного. Начиная с этого разреза, медленно отражают кожу от ног, осторожно потянув его от мышцы и резки фасции.
4. Поместите животное в положение на спине на подносе для вскрытия и прикрепите все четыре лапы. Опционально прикрепите хвост, чтобы уменьшить движение дальше.
5. Используя микродисциссу ножницы, сделать разрез в мышцах бедра на полпути между хвостом и коленом, чтобы разоблачить седалищного нерва. Убедитесь, что нерв, который виден через мышцы, не разрезается.
6. Продлите разрез спинно и в желудочно, чтобы удалить мышцу. Аналогичным образом, удалить мышцы теленка, сохраняя порезы мелкой и короткой, чтобы избежать повреждения нерва.
7. Удалите мышцы до тех пор, пока tibial нерв полностью подвергается от точки, где он ветвиется от седалищного нерва (на колене) к пятке (Рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех шагах, включая и после вскрытия тибиального нерва, избежать ненужного воздействия окружающего света, чтобы свести к минимуму возможные случайные активации paGFP в нерве.
8. Возьмитесь за тибиальный нерв на позвоночник-проксимальный конец с парой щипцов и сократить нерв с помощью пары ножниц микродиссекции. Заботясь, чтобы не ставить напряжение на нерв, поднять его от мышцы, резки любых вложений.
9. Вырезать позвоночника дистального конца тибиального нерва и передачи в небольшой петри блюдо комнатной температуры кислородом солевого раствора. С этого момента в процедуре, всегда будьте уверены, чтобы отслеживать проксимальные и дистальные концы нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один из способов сделать это, чтобы отметить дистальный конец нерва с угловым вырезать так, что конус виден.
10. Начиная с проксимального конца нерва, осторожно схватить подвергаются аксон заканчивается с парой очень тонкой наконечником щипцами.
11. Со второй парой щипцов, схватить нерва шейт проксимально, и медленно тянуть к дистальному концу нерва. Нервная шея будет скользить по аксонам с минимальным сопротивлением. Убедитесь, что во время этого процесса не применяется неоправданное напряжение к нерву.

4. Окончательная сборка камеры перфузии нерва

1. Схватив проксимальный конец нерва, удалите его из солевого раствора и медленно положите его на крышку перфузионной камеры в прямоугольном открытии внутренней прокладки, сохраняя нежное напряжение на нерве, как вы кладете его так, что он лежит прямо.
2. Поместите слайд микроакавека над нервом с рифленой стороной, обращенной к нерву, и направление потока параллельно нерву. Переверните крышки и сборку микроакевовки более, и поместите его в корпус камеры перфузии с микроакудук слайда apposed к внешней прокладке. Нерв и окружающие внутренние прокладки теперь будут зажаты между крышкой и слайдом микроакуда, которые разделены прокладкой, с крышкой лицом вверх (Рисунок 1B).
3. Защитите перфузионную камеру, поместив ее в металлическое корпус и вращая кольцо блокировки. Убедитесь, что пластиковый корпус полностью под все металлические зажимы и затяните хорошо, чтобы предотвратить утечку солевого раствора. Чрезмерное укрепление может взломать слайд микроакудадук или крышку. Переверните камеру так, чтобы крышка была обращена вниз.
4. Медленно угнетайте солевой шприц поршень, чтобы заполнить перфузионную камеру. Держите вход и розетку трубки, розетки колбы и шприц повышенной над самой камерой во все времена во время установки и изображения. Это позволяет избежать сифонирования, которое может привести к увеличению концентрации внимания или вызвать нестабильность фокуса из-за негативного давления в камере.
5. Перенесите сборку перфузии на перевернутую стадию микроскопа и установите солевой шприц в шприц-насос. Запустите двигатель с соответствующей скоростью при скорости потока 0,25 м/мин. Затем подключите и включите в строке нагреватель решения установлен до 37 градусов по Цельсию.
6. Соедините объективный обогреватель и установите до 37 градусов по Цельсию, нанесите масло на цель и вставьте камеру перфузии в сценическое крепление.
7. Нанесите масло на площадку камерного обогревателя и прикрепите к перфузионной камере. Подключите и включите камерный обогреватель; установлено до 37 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения температуры могут привести к формированию пузырьков в перфузионной камере из-за outgassing раствора. Если образуются пузырьки, ненакратить скорость потока раствора на 5-10x до тех пор, пока пузырьки не очистит камеру.
8. Заблокируйте камеру перфузии в адаптер сцены и принесите объективное масло в контакт с крышкой на нижней стороне камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Камера Bioptechs с адаптером ASI, используемым здесь, предназначена для перевернутой конфигурации микроскопа.

5. Активация флуоресценции и приобретение изображений

1. Используя яркое освещение поля, сосредоточьтесь на слое аксонов на нижней поверхности нерва, ближайшего к поверхности крышки(рисунок 2B). Миелиные аксоны (обычно 1 - 6 мкм в диаметре у взрослых мышей) могут быть идентифицированы по наличию миелиновой оболочки, которая видна под ярким световым освещением без контрастного повышения. Также очевидны расщелины Шмидта-Лантермана и узлы Ранвье. Немиелиированные аксоны более стройные (обычно диаметром 1 м) и, как правило, присутствуют в пучках (remak bundles), где они, как правило, слишком тесно используются для решения друг друга.
2. Если она доступна на микроскопе, активируйте систему автоматического фокусировки, чтобы сохранить фокус в течение таймлапса.
3. Приобретите яркое поле эталонное изображение. Запишите ориентацию нерва (позвоночника-проксимальных и дистальных концов) по отношению к изображениям.
4. Приобретите конфокальное изображение с помощью лазера 488 нм и фильтра выбросов, подходящего для paGFP (например, 525/50 нм) для записи автофлюоценции добеления. Держите лазерную мощность низкой, чтобы свести к минимуму фотобледачи, с экспозицией время с поправкой соответствующим образом для обнаружения слабого сигнала. В качестве примера, репрезентативные данные были получены на 5% лазерной мощности и 4 с воздействия. Запишите настройки приобретения для использования во всех будущих экспериментах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После фотоактивации идеальные настройки изображения будут производить соотношение сигналов к шуму , 8 и фотосъемка менее 25% от исходного сигнала в течение 20 изображений. Аксоны также могут быть изображены широкоугольной микроскопией эпифлуоресценции, как мы делали первоначально⁷, но качество изображения будет хуже из-за отсутствия конфокальности.
5. Установите мощность лазера примерно в 5x нормальной мощности изображения и получить изображение со временем экспозиции 3-4 минут. Хотя этот шаг не является существенным, этот шаг рекомендуется отбеливать аутофлюоресценции и других источников нежелательной флуоресценции для того, чтобы уменьшить фоновый сигнал и, таким образом, максимизировать сигнал к шуму фотоактивированной флуоресценции.
6. Приобретите изображение с настройками, используемыми в шаге 5.4 для записи автофлуоресценции до активации после этого шага отбеливания.
7. На изображении яркого поля нарисуйте линию, параллельную аксону с длиной, равной желаемому размеру окна активации. Длина этого окна будет варьироваться в зависимости от экспериментальной цели и параметров, но типичные длины 5 мкм для парадигмы пульс-побега и 40 мкм для парадигмы распространения пульса.
8. Используя эту линию в качестве руководства, нарисуйте прямоугольную область интереса (ROI) через поле зрения перпендикулярно аксонов. Регион должен охватывать все аксоны для фотоактивации.
9. Определите оптимальные настройки фотоактивации с 405 нм освещения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только выполните этот шаг и подшагов до первой экспериментальной активации. В ходе эксперимента необходимо использовать те же настройки фотоактивации.
   1. Активировать область интереса неоднократно с помощью 405 нм лазерной линии, низкой лазерной мощности (например, 5%), и пиксельного времени пребывания (например, 40 х) и одного импульса, приобретая изображение активированного флуоресценции GFP после каждой активации. Повторяйте до тех пор, пока флуоресценция больше не увеличивается, а затем количественно флуоресценции в области, интерес для каждого изображения.
   2. Участок средняя флуоресценция интенсивности по сравнению с пульс числа. Выберите количество импульсов, после которых флуоресценция больше не увеличивается в качестве оптимального количества импульсов для активации.
10. Активировать флуоресценцию paGFP области обращается в шаге 5.8 узорчатые возбуждения с 405 нм света. Убедитесь, что изображение приобретено непосредственно перед активацией и сразу после активации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальная активация paGFP будет производить четко определенный регион флуоресценции с острыми границами, содержащимися в рентабельности инвестиций.
11. Начните 1-минутный таймер по мере завершения активации. В конце 1 минуты, начать приобретение timelapse серии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1-минутная задержка необходима для того чтобы обеспечить увеличение в флуоресценции которая наблюдается следуя за фотоактивацией paGFP^11. Для метода пульс-распространения для измерения исходных склонов в центральном и фланговом окнах достаточно 5-10 минут с интервалами 30 секунд. Для метода пульс-побега период приобретения 30-150 минут с интервалами 5 или 10 минут таймлапса позволяет анализировать долгосрочное поведение паузы нитей
12. Сохранить все приобретенные изображения, а также рентабельность инвестиций, используемую для активации флуоресценции.
13. Перемещение в новую область нерва и повторить шаги 5.1-5.11. Если новый регион находится вдоль того же аксона, он должен быть не менее 500 мкм от ранее активированной области, чтобы избежать обнаружения флуоресцентных нейрофиламентов, которые вышли из другой активированной области. Приобретение последнего таймлапса должно завершиться до конца 3-часового окна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что препарат может быть жизнеспособным в течение более 3 часов, но мы не подтвердили это. При умелом вскрытии и подготовке в течение этого 3-часового окна можно приобрести от пяти до восьми 10-минутных наборов изображений замедленного заключения.
14. После того, как будет приобретена финальная серия изображений, остановите поток солевого раствора, отключите раствор и камерные обогреватели, удалите аппарат перфузии со сцены микроскопа.

6. Флэтфилд и темное поле изображение приобретения

1. Сделать раствор флуоресцеина, добавив 250 мг порошка флуоресцеина на 0,5 мл двойной дистиллированной воды. Смешайте до тех пор, пока нет видимых частиц и спина раствор в течение 30 секунд в столешнице центрифуги для осадки любого нераспределеного материала. Это решение может храниться в течение нескольких месяцев при 4 градусах Цельсия, если защищено от воздействия света.
2. Добавьте 8 мл раствора флуоресцеина в слайд и нанесите #1,5 крышки. Помарка лишнюю жидкость, печать с лаком для ногтей, и дать высохнуть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При такой высокой концентрации, сильное поглощение флуоресцеина красителя гасит освещающий луч в растворе, производя тонкую плоскость флуоресценции на поверхности крышки, которая является одновременно равной и устойчивой к фотобьянию из-за быстрого диффузивного обмена¹².
3. Поместите флуоресцеин слайд coverslip-стороне вниз на перевернутой стадии микроскопа и настроить акцент на тонкой плоскости флуоресценции на поверхности крышки. Перемещение вокруг слайда, чтобы найти поле зрения, которое не содержит пузырьков воздуха (темные пятна) или крупных частиц флуоресценов (яркие пятна).
4. Приобретите z-стек, охватывающий 6 мкм с интервалами 0,2 мкм, таким образом, что среднее изображение является исходной фокусировкой. Используйте короткое время экспозиции (например, 40 мс), потому что флуоресценция будет очень яркой. Это приобретение z-stack необходимо для захвата максимальной флуоресценции по всему полю зрения, так как крышки редко бывает идеально горизонтальным, а плоскость флуоресценции флуоресцентора флуоресцентории флуоресцентории флюоресцентора очень узкая. Повторите это в общей сложности 25 полей зрения, перемещая сцену по крайней мере на 20 мкм в любом направлении между полями.
5. Закройте все ставни светового пути, включая затвор камеры, и установите мощность лазера и время экспозиции к нулю. Приобретите стопку из 100 изображений с этими настройками. Эти изображения будут усреднены для создания изображения darkfield, которое будет использоваться для коррекции темного тока и смещения смещения смещения на чипе камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение потоковой передачи является идеальным способом для захвата этих изображений.

7. Изображение гликолититически ингибируемые нервы для коррекции отбеливателя

1. Сделать и оксигенировать солевой раствор, как в шаге 1; Однако заменить 2-дезоксия-D-глюкозы для D-глюкозы и добавить 0,5 мМ йодоацетат натрия для ингибирования гликолиза¹³. Мы называем это "ингибирующим физраствором".
2. Повторите шаги 2-5 с помощью ингибирующего солевого раствора, с 10-30 минутом изображения timelapse набор в шаге 5.11. Разрешить 40-50 минут после применения ингибирующего солевого раствора перед визуализацией, чтобы обеспечить полное ингибирование нейрофиламента транспорта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гликолитическое ингибирование в конечном итоге убить аксоны так что есть узкое окно времени после ингибирования, в котором для получения данных, как правило, около 30 минут. Индикатором уровня метаболического ингибирования является флавин аутофлюорессия аксональных митохондрий, которые могут быть обнаружены в серии таймлапсов из-за длительного воздействия, которое мы используем для изображения paGFP флуоресценции¹⁴. Как правило, митохондриальная аутофлюоресценция будет увеличиваться во время лечения ингибирующим физраствором. Если митохондрии начинают округляться или фрагментироваться, то прекратите визуализацию.

8. Обработка и анализ изображений с использованием ImageJ

1. Флэтфилд и темное поле коррекции
   1. Откройте стек изображения darkfield и усредните изображения путем щелкать изображение Стеки Проект и выбор средней интенсивности в выпадаемом меню для создания изображения darkfield.
   2. Откройте флуоресцеин плоские стеки изображения и создать максимальную интенсивность проекции каждого (25 в общей сложности), нажав изображение Стеки Проект и выбор Max Intensity в выпадаемом меню.
   3. Объедините результируемые 25 максимальных проекционных изображений в один стек, нажав на изображение Стеки Изображения в стек. Создайте проекцию средней интенсивности этого стека, нажав на изображение Стеки Проект и выбор средней интенсивности из меню выпадения для создания изображения flatfield.
   4. Вычесть изображение темного поля из плоского поля изображения, нажав процесс Калькулятор изображений,выбрав Вычитание в качестве операции. Убедитесь, что 32-битный (поплавок) параметр результата проверяется. Результатом является исправленное изображение плоского поля.
   5. Измерьте среднюю интенсивность пикселей исправленного изображения плоского поля, предварительно нажав на Анализ Установите измерения и проверяя поле среднего серого значения, а затем нажимая клавишу 'm'.
   6. Разделите исправленное изображение плоского поля по его средней интенсивности, нажав на процесс Математика Разделите и введя среднее серое значение, полученное в шаге 7.1.5. Это даст обратный образ усиления.
   7. Откройте изображения предварительной активации и после активации вместе с стеком изображения timelapse. Объедините изображения в один стек, нажав на изображение Стеки Инструменты Concatenate, и выбрать изображения в хронологическом порядке из меню выпадения. Убедитесь, что опция Open as 4D-изображение не выбрана. Полученный стек представляет собой полный набор изображений.
   8. Повторите шаг 8.1.4 на полном наборе изображений,а затем разделите результат на обратное изображение усиления, нажав на процесс Калькулятор изображения и выбор раздела в качестве операции. Это позволит создать исправленный полный набор изображений,в котором каждое изображение было исправлено для несовечности в области освещения и на детекторе.
2. Выравнивание стека изображений
   1. Чтобы исправить для несогласованности изображения самолетов в серии timelapse из-за стадии или образца дрейфа, установить Выравнивание фиксированной областью плагина (Дополнительный файл 1) нажав plugins Установите PlugIn, навигацию в папку, содержащую файл плагина, и выбрав плагин. Перезагрузка ImageJ после установки плагина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот плагин выравнивает изображения на основе принципа "наименее квадратов congealing"¹⁵.
   2. Нарисуйте ROI на исправленном полном наборе изображений, который охватывает несколько аксонов и не выходит за пределы проксимальных и дистальных границ активированной флуоресценции в каждом из аксонов. Геометрия региона не имеет значения, однако за исключением областей, в которых структуры меняют форму или размер, улучшит выравнивание.
   3. Запустите плагин выравнивания, нажав plugins Выравнивание по фиксированной области. Плагин помещает по умолчанию 2-пиксельный максимум на смещение между кадрами, однако это может быть скорректировано в исходное всплывающее окно, если есть значительный дрейф образца. Выравнивание может занять несколько минут, в зависимости от размера стека изображений.
   4. Визуально осмотрите выровненный стек для оценки качества выравнивания. Некоторые кадры могут затем быть выровнены вручную, так как автоматизированное выравнивание может не функционировать хорошо для больших колебаний флуоресценции между кадрами. Это может быть достигнуто при просмотре кадра, который должен быть перенесен, нажав изображение Преобразование Перевод. Нажмите Нет на следующем всплывающем окно с просьбой о том, весь стек должен быть переведен. Используйте только целые значения пикселей в переводе и убедитесь, что меню интерполяции выпадения устанавливается на None,так как фракционные пиксельные сдвиги или интерполяция изменят данные из-за повторной загрузки интенсивности пикселей.
   5. Сохраните это как выровненный полный набор изображений.
3. Измерение интенсивности флуоресценции
   1. Нарисуйте ROI с помощью инструмента Угол на первом кадре выровнен полный набор изображений с первой рукой вдоль одного края активированной области, перпендикулярно аксонов, а вторая рука вертикальной. Нажмите клавишу 'm' для измерения угла, который описывает ориентацию аксонов в поле зрения.
   2. Установите масштаб изображений так, чтобы размеры измерялись в микронах, нажав На кнопку «Анализ» Установите шкалу и введя соответствующие значения.
   3. Откройте менеджер ROI, нажав На анализ (ru) Инструменты Менеджер по рентабельности инвестиций. Для парадигмы пульс-побега, пропустите шаг 8.3.7. Для пульс-распространения, продолжать шаг 8.3.4.
   4. Нарисуйте квадратную рентабельность инвестиций любых измерений, а затем нажмите Редактировать Отбор Укажите. Убедитесь, что параметр Масштабированных единиц проверяется, а затем установите рентабельность инвестиций на ширину 15 мкм и высоту, равную или превышающую высоту изображения.
   5. Поверните рентабельность инвестиций под углом, измеренным в шаге 8.3.1, нажав на Edit Отбор Поверните, чтобы сделать его перпендикулярно аконам, и поместите roi с одной стороны вдоль проксимального края активированной области. Добавьте эту рентабельность инвестиций, которую мы будем называть проксимальной реготовить, к менеджеру, нажав на 't' ключ.
   6. Перетащите рентабельность инвестиций, чтобы выровнять с дистальной кромкой активированного региона и снова добавьте к менеджеру ROI, нажав клавишу 't'. Мы будем ссылаться на это как дистальный руководство рентабельности инвестиций. Проксимальные и дистальные НАправляющие БУДУТ использованы позже для рисования ОИ измерения фланговых измерений.
   7. Выберите аксоны для количественной оценки, используя последовательность изображений timelapse, полученную в шаге 5.11 выше. Эта последовательность изображений полезна для этой цели, поскольку она фиксирует слабую аутофлюоресценцию аксонов, раскрывая их морфологию за пределами активированной области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аксоны, не отвечающие следующим критериям, исключены из анализа:
      1. Аксоны должны быть в фокусе по всей длине всех измерительных окон.
      2. Аксоны должны находиться в пределах 5 градусов перпендикулярно проксимальным и дистальным концам области активации.
      3. Аксоны не должны иметь инвагинации в пределах 5 мкм проксимальных и дистальных концов области активации.
      4. Исключить аксоны, которые заметно меняют форму в ходе визуализации.
      5. Исключите аксоны, которые кажутся нездоровыми, о чем свидетельствует отсутствие дискретной активированной области в изображении после активации(рисунок 2C, дно), так как это свидетельствует о диффузивной дисперсии активированной флуоресценции, которая происходит, когда аксон умирает.
   8. Наблюдайте длинно подверженное отбеливание изображения от шага 5.5 для автофлуоресцентных структур внутри аксонов. Эта флуоресценция из-за флавинов в митохондрии¹⁶. Исключите аксоны из анализа, если эти митохондрии кажутся округлыми или фрагментарными(рисунок 2D,дно), в отличие от расширенных, линейных структур(рисунок 2D, сверху), так как это является признаком метаболического снижения.
   9. Используя проксимальные и дистальные направляющие, созданные выше, нарисуйте три измерения ROIs на анализируемый аксон: центральное окно, охватывающее аксон в области активации 40 мкм, и два фланговых окна с шириной, ограниченной фланговым окном 15 мкм ROIs и высотой, ограниченной диаметром аксона на границе области активации. Добавьте все три региона к менеджеру ROI. Для гликолитически ингибируемых аксонов нарисуйте одну область шириной не более 5 мкм в середине активированной области и которая не простирается за пределы аксона. Для парадигмы пульс-побега активированная область шириной всего 5 мкм, поэтому необходимо использовать все окно.
   10. Повторите шаг 8.3.9 для всех аксонов, которые отвечают критериям шагов 8.3.7 и 8.3.8.
   11. Установите активные измерения для средней интенсивности пикселей, нажав На кнопку Анализ Установите измерения и выбирай параметр среднего серого значения. Убедитесь, что другие параметры измерения не проверяются.
   12. Выберите все ROI в окне менеджера рентабельности инвестиций, выбрав окно и нажав кнопку 'Ctrl' и 'a'. В окне менеджера рентабельности инвестиций щелкните Подробнее Мультимерия для измерения интенсивности флуоресценции. Копировать данные из окна результатов в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
   13. Установите активные измерения в область региона, нажав На кнопку Анализ Установите измерения и выбирай вариант области. Убедитесь, что другие параметры измерения не проверяются.
   14. Повторите шаг 8.3.12. Необходимо скопировать только один ряд результатов для области, так как область не меняется со временем.

9. Фотоблеч коррекции

1. В таблице данных для гликолитически ингибируемых аксонов вычитайте среднее флуоресценцию кадра 1 (преактивный кадр) от средней флуоресценции каждого кадра, начиная с кадра 3 (первый временной каркас) для данной рентабельности инвестиций. Результаты являются фоном вычитается средств.
2. Участок данных, как рассеяние с кадром номера, как абсцисса. Приготовить экспоненциальную линию тренда к данным из каждой рентабельности инвестиций (большинство программ электронной таблицы имеют эту функцию) с уравнением в виде Ae^-bx. Это уравнение эквивалентно функции фотосъемки F_t q F₀ й^-tɣ где F₀ является флуоресценцией в первом кадре таймлапса, ɣ экспоненциальная скорость отбеливания, т это время, и e является естественной базой логарифма.
3. Повторите шаги 9.1.1-9.1.2 для всех ROIs всех аксонов от гликолитно ингибируемых нервов. Для наиболее точной оценки скорости фотосъемки используйте не менее 15 аксонов в общей сложности, не менее 5 отдельных нервов. Используйте среднее значение экспоненциальных темпов отбеливания (ɣ) от всех ингибируемых аксонов для коррекции экспериментальных данных для фотоблечи. Новая калибровочная калибровка должна быть выполнена для каждого эксперимента или исследования, потому что фотоотделение зависит от параметров приобретения изображения и мощности лазера, который может меняться с течением времени.
4. Повторите шаг 9.1.1 для всех областей аксонов, изображенных с нормальным солевым раствором (т.е. не гликолитически ингибируется).
5. Разделите каждую точку данных на^e-tɣ,используя время для t и среднее ɣ найдено в шаге 9.1.3. Это фотоблагосы исправлены средства.
6. Умножьте каждую точку данных на область для этого интересующего региона, чтобы найти общую флуоресценцию в этом регионе в каждый раз.

Результаты

На рисунке 3 показаны репрезентативные изображения экспериментов по пульсу и импульсу распространению. Мы опубликовали несколько исследований, которые описывают данные, полученные с помощью метода пульс-побега и наши методы для анализа этих данных^5,,

Обсуждение

Необходимо проявлять осторожность при анализе экспериментов по пульсу и пульс-распространению, поскольку существует значительный потенциал для введения ошибки во время постобработки, главным образом во время коррекции плоского поля, выравнивания изображения и коррекции отбеливате?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors