Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

Résumé

Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.

Résumé

Les polymères protéiques neurofilaments se déplacent le long des axones dans la composante lente du transport axonal à des vitesses moyennes de ~0,35-3,5 mm/jour. Jusqu’à récemment, l’étude de ce mouvement in situ n’était possible qu’à l’aide de l’étiquetage radioisotopique des impulsions, ce qui permet l’analyse du transport axonal dans des nerfs entiers avec une résolution temporelle des jours et une résolution spatiale de millimètres. Pour étudier le transport de neurofilament in situ avec une résolution temporelle et spatiale plus élevée, nous avons développé une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime la protéine de neurofilament M marquée avec le GFP photoactivatable dans les neurones. Ici, nous décrivons la photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion et les méthodes de propagation des impulsions pour analyser le transport neurofilament dans les axones myélins uniques des nerfs tibiaux de ces souris ex vivo. Les segments nerveux isolés sont maintenus au stade du microscope par perfusion avec saline oxygénée et photographiés par la microscopie confocale de fluorescence de disque tournant. La lumière violette est utilisée pour activer la fluorescence dans une courte fenêtre axonale. La fluorescence dans les régions activées et flanquantes est analysée au fil du temps, permettant l’étude du transport de neurofilament avec résolution temporelle et spatiale de l’ordre des minutes et des microns, respectivement. La modélisation mathématique peut être utilisée pour extraire les paramètres cinétiques du transport neurofilament, y compris la vitesse, le biais directionnel et le comportement de pause des données résultantes. Les méthodes d’évacuation des impulsions et de propagation du pouls peuvent également être adaptées pour visualiser le transport de neurofilament dans d’autres nerfs. Avec le développement de souris transgéniques supplémentaires, ces méthodes pourraient également être utilisées pour l’image et l’analyse du transport axonal d’autres protéines cytosquelettiques et cytosoliques dans les axones.

Introduction

Le transport axonal des neurofilaments a été démontré pour la première fois dans les années 1970 par l’étiquetage radioisotopique¹. Cette approche a donné une mine d’informations sur le transport neurofilament in vivo, mais il a relativement faible résolution spatiale et temporelle, généralement de l’ordre des millimètres et des jours au mieux². De plus, l’étiquetage radioisotopique des impulsions est une approche indirecte qui nécessite l’injection et le sacrifice de plusieurs animaux pour générer un cours unique. Avec la découverte de protéines fluorescentes et les progrès de la microscopie de fluorescence dans les années 1990, il est devenu par la suite possible d’imager le transport de neurofilament directement dans les neurones cultivés sur une échelle de temps de secondes ou de minutes et avec une résolution spatiale sous-micrométrique, offrant une compréhension beaucoup plus grande du mécanisme du mouvement³. Ces études ont révélé que les polymères neurofilament dans les axones se déplacent rapidement et par intermittence dans les deux directions antérogrades et rétrogrades le long des voies de microtubule, propulsés par des protéines motrices microtubules. Cependant, les neurofilaments sont des structures limitées par la diffraction à seulement 10 nm de diamètre qui sont généralement espacées de leurs voisins par seulement des dizaines de nanomètres; par conséquent, les polymères ne peuvent être suivis que dans les neurones cultivés qui contiennent des neurofilaments peu distribués afin que les polymères en mouvement puissent être résolus à partir de leurs voisins⁴. Ainsi, il n’est pas actuellement possible de suivre les neurofilaments simples dans les axones qui contiennent des polymères neurofilament abondants, tels que les axones myélins.

Pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones riches en neurofilament à l’aide de la microscopie de fluorescence, nous utilisons une méthode de photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion que nous avons développée pour étudier le comportement de pause à long terme des neurofilaments dans les cellules nerveuses cultivées^4,5. Les neurofilaments marqués avec une protéine de fusion de neurofilament fluorescent photoactivatable sont activés dans un court segment d’axone, puis le taux de départ de ces filaments de la région activée est quantifié en mesurant la décomposition de fluorescence au fil du temps. L’avantage de cette approche est qu’il s’agit d’une analyse au niveau de la population du transport neurofilament qui peut être appliquée sur une échelle de temps de minutes ou d’heures sans avoir besoin de suivre le mouvement des polymères neurofilament individuels. Par exemple, nous avons utilisé cette méthode pour analyser la cinétique du transport neurofilament dans les cultures myélinantes⁶.

Récemment, nous avons décrit le développement d’une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime de faibles niveaux d’une protéine de neurofilament pagFP-marquée M (paGFP-NFM) dans les neurones sous le contrôle du neurone humain spécifique Thy1 promoteur⁷. Cette souris permet l’analyse du transport de neurofilament in situ à l’aide de la microscopie de fluorescence. Dans cet article, nous décrivons les approches expérimentales pour analyser le transport de neurofilament dans les axones myélinés des nerfs tibiaux de ces souris utilisant deux approches. La première de ces approches est la méthode d’évacuation des impulsions décrite ci-dessus. Cette méthode peut générer des informations sur le comportement de pause des neurofilaments, mais est aveugle à la direction dans laquelle les filaments quittent la région activée, et ne permet donc pas la mesure de la directionnalité nette et la vitesse de transport⁸. La deuxième de ces approches est une nouvelle méthode de propagation des impulsions dans laquelle nous analysons non seulement la perte de fluorescence de la région activée, mais aussi l’augmentation transitoire de la fluorescence dans deux fenêtres latérales par lesquelles les filaments fluorescents se déplacent à mesure qu’ils quittent la région activée dans les deux directions antérogrades et rétrogrades. Dans les deux approches, les paramètres du transport de neurofilament tels que la vitesse moyenne, la directionnalité nette et le comportement de pause peuvent être obtenus en utilisant l’analyse mathématique et la modélisation des changements dans la fluorescence dans les fenêtres de mesure. La figure 3 illustre ces deux approches.

Ce protocole démontre la dissection et la préparation du nerf, l’activation et l’imagerie de la fluorescence paGFP, et la quantification du transport de neurofilament à partir des images acquises à l’aide du paquet de distribution FIJI d’ImageJ⁹. Nous utilisons le nerf tibial parce qu’il est long (plusieurs cm) et ne se ramifie pas; cependant, en principe tout nerf exprimant paGFP-NFM est approprié pour une utilisation avec cette technique si elle peut être disséquée et désaissée sans endommager les axones.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État de l’Ohio.

1. Préparation de la solution saline nerveuse

1. Faire 100 mL de la solution saline de Breuer¹⁰: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 1,5 mM CaCl₂, 5,6% D-glucose, 23,8 mM NaHCO₃ dans de l’eau double distillée.
2. Bullez 95% d’oxygène/5% de dioxyde de carbone (carbogén) par la solution saline pendant au moins 30 minutes avant l’utilisation. Les restes de solution saline peuvent être réutilisés en une semaine; toutefois, il doit être réoxygéné avant chaque utilisation.
3. Verser la solution saline oxygénée dans une seringue de 60 mL et s’assurer qu’il reste peu d’air dans la seringue.

2. Assemblage initial de la chambre de perfusion nerveuse

1. Connectez la seringue et le tube comme le montre la figure 1A,en plaçant le tube de sortie dans une fiole de déchets.
2. Placez le joint extérieur dans le boîtier de la chambre de perfusion, en veillant à ce que l’entrée d’écoulement et les poteaux de sortie soient alignés avec les trous dans le joint.
3. Déposer le joint intérieur (silicone, 100 μm d’épaisseur) sur un couvercle circulaire #1,5 (40 mm de diamètre), en lissant soigneusement les rides du joint pour assurer un joint serré. Pour faciliter l’assemblage ultérieur, placez le couvercle et le joint sur une serviette en papier ou l’essuie-tout avec le joint orienté vers le haut.

3. Dissection et préparation du nerf tibial de souris

1. Sacrifiez l’animal par inhalation de dioxyde de carbone ou une autre méthode approuvée par l’institution. Démarrer une minuterie lorsque l’animal cesse de bouger/respirer, car les expériences ne doivent être menées que dans les 3 heures suivant le sacrifice⁷.
2. Vaporiser la fourrure avec 70 % d’éthanol et retirer autant que possible des jambes et du dos de l’animal à l’aide d’un rasoir électrique.
3. À l’aide d’une paire de gros ciseaux de dissection, faire une incision dorsale dans la peau près du milieu de la colonne vertébrale et continuer la coupe autour de l’aspect ventral de l’animal. À partir de cette coupe, reflètent lentement la peau des jambes en la tirant doucement loin du muscle et en coupant le fascia.
4. Placez l’animal en position de supination sur un plateau de dissection et épinglez les quatre pattes. Épinglez éventuellement la queue pour réduire davantage le mouvement.
5. À l’aide de ciseaux de microdésection, faire une incision dans les muscles de la cuisse à mi-chemin entre la queue et le genou pour exposer le nerf sciatique. Assurez-vous que le nerf, qui est visible à travers le muscle, n’est pas coupé.
6. Étendre l’incision dorsalement et ventralement pour enlever le muscle. De même, enlever les muscles du mollet, en gardant les coupes peu profondes et courtes pour éviter d’endommager le nerf.
7. Enlever les muscles jusqu’à ce que le nerf tibial soit entièrement exposé du point où il se ramifie du nerf sciatique (au genou) au talon (figure 2A).
   REMARQUE : Dans toutes les étapes, y compris et après la dissection du nerf tibial, évitez l’exposition inutile à la lumière ambiante pour minimiser l’activation accidentelle possible du paGFP dans le nerf.
8. Saisissez le nerf tibial à l’extrémité spine-proximal avec une paire de forceps et coupez le nerf à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection. Prendre soin de ne pas mettre de tension sur le nerf, le soulever loin du muscle, couper les attachements.
9. Couper l’extrémité d’épine-distale du nerf tibial et transférer à un petit plat de Petri de la solution saline oxygénée à température ambiante. À partir de ce point dans la procédure, toujours être certain de garder une trace des extrémités proximales et distales du nerf.
   REMARQUE : Une façon de le faire est de marquer l’extrémité distale du nerf avec une coupe inclinée de telle sorte que le cône soit visible.
10. À partir de l’extrémité proximale du nerf, saisir doucement l’axone exposé se termine par une paire de forceps très fine.
11. Avec une deuxième paire de forceps, saisir la gaine nerveuse proximalement, et tirer lentement vers l’extrémité distale du nerf. La gaine nerveuse glissera le long des axones avec une résistance minimale. Assurez-vous qu’aucune tension indue n’est appliquée au nerf au cours de ce processus.

4. Assemblage final de chambre de perfusion de nerf

1. Saisir l’extrémité proximale du nerf, l’enlever de la solution saline et le poser lentement sur le couvercle de la chambre de perfusion dans l’ouverture rectangulaire du joint intérieur, en maintenant une tension douce sur le nerf que vous le posez vers le bas de sorte qu’il se trouve droit.
2. Placez le glissement microaqueducteur sur le nerf avec le côté rainuré face au nerf, et la direction de l’écoulement parallèle au nerf. Retournez le couvercle et l’assemblage de microaqueduct au-dessus, et placez-le dans le boîtier de chambre de perfusion avec la glissière de microaqueduct apposed au joint extérieur. Le nerf et le joint intérieur environnant seront désormais pris en sandwich entre le couvercle et la glissière microaqueducte, qui sont séparés par le joint, avec le couvercle orienté vers le haut (Figure 1B).
3. Sécurisez la chambre de perfusion en la plaçant dans le boîtier métallique et en faisant pivoter l’anneau de verrouillage. Assurez-vous que le boîtier en plastique est entièrement sous tous les clips métalliques et bien serrer pour éviter les fuites salines. Le surtightening peut casser la glissière microaqueducte ou le couvercle. Retournez la chambre pour que le couvercle soit orienté vers le bas.
4. Déprimer lentement le piston à seringue saline pour remplir la chambre de perfusion. Gardez l’entrée et la sortie des tubes, de la fiole de sortie et de la seringue surélevées au-dessus de la chambre elle-même en tout temps pendant l’installation et l’imagerie. Cela évite le siphonnage, qui peut introduire des bulles ou provoquer l’instabilité de mise au point en raison de la pression négative dans la chambre.
5. Transférer l’assemblage de perfusion à un microscope inversé et monter la seringue saline dans la pompe à seringues. Démarrez le moteur à une vitesse appropriée pour un débit de 0,25 mL/min. Branchez-vous et allumez ensuite le chauffe-solution en ligne réglé à 37 °C.
6. Connectez le chauffe-eau objectif et réglez à 37 °C, appliquez de l’huile à l’objectif et insérez la chambre de perfusion dans le support de scène.
7. Appliquer de l’huile sur le coussin chauffant de chambre et fixer à la chambre de perfusion. Connectez-vous et allumez le chauffe-chambre; fixé à 37 °C.
   REMARQUE : Des changements de température peuvent provoquer la formation de bulles dans la chambre de perfusion en raison de l’outgazsing de la solution. Si des bulles se forment, augmentez brièvement le débit de la solution de 5 à 10 x jusqu’à ce que les bulles dégagent la chambre.
8. Verrouillez la chambre de perfusion dans l’adaptateur de scène et ez l’huile objective en contact avec le couvercle sur le dessous de la chambre.
   REMARQUE : La chambre Bioptechs avec adaptateur de scène ASI utilisé ici est conçue pour une configuration de microscope inversé.

5. Activation de fluorescence et acquisition d’images

1. À l’aide de l’éclairage brightfield, concentrez-vous sur la couche d’axones sur la surface inférieure du nerf le plus proche de la surface du couvercle (figure 2B). Les axones myélins (généralement de 1 à 6 μm de diamètre chez les souris adultes) peuvent être identifiés par la présence d’une gaine de myéline, qui est visible sous l’éclairage de lumière transmis par le champ lumineux sans amélioration du contraste. Schmidt-Lanterman fissures et les nœuds de Ranvier sont également facilement apparentes. Les axones non myélins sont plus minces (généralement de diamètre de 1 μm) et sont généralement présents dans les faisceaux (paquets remak), où ils sont généralement trop étroitement apposés pour être résolus les uns des autres.
2. Si disponible au microscope, activez le système de mise au point automatique pour maintenir la concentration au cours de l’imagerie timelapse.
3. Acquérir une image de référence brightfield. Enregistrez l’orientation du nerf (extrémités vertébrale-proximales et distales) par rapport aux images.
4. Acquérir une image confocale à l’aide d’un laser de 488 nm et d’un filtre d’émission approprié pour le paGFP (p. ex., 525/50 nm) pour enregistrer l’autofluorescence pré-blanchiment. Maintenez la puissance laser basse pour minimiser le photobleaching, avec le temps d’exposition ajusté en conséquence pour détecter le signal faible. À titre d’exemple, des données représentatives ont été acquises à 5 % de puissance laser et à 4 s d’exposition. Enregistrez les paramètres d’acquisition à utiliser dans toutes les expériences futures.
   REMARQUE : Après la photoactivation, les paramètres d’imagerie idéaux produiront un rapport signal/bruit > 8 et un photobleaching de moins de 25 % du signal d’origine au cours de 20 images. Les axones peuvent également être photographiés par microscopie d’épifluorescence widefield comme nous l’avons fait à l’origine⁷, mais la qualité de l’image sera inférieure en raison du manque de confoalité.
5. Réglez la puissance laser à environ 5 fois la puissance d’imagerie normale et acquérir une image avec un temps d’exposition de 3-4 minutes. Bien qu’elle ne soit pas essentielle, cette étape est recommandée pour blanchir l’autofluorescence et d’autres sources de fluorescence indésirable afin de réduire le signal de fond et ainsi maximiser le signal au bruit de la fluorescence photoactivée.
6. Acquérir une image avec les paramètres utilisés à l’étape 5.4 pour enregistrer l’autofluorescence préactivation après cette étape de blanchiment.
7. Sur l’image brightfield, tracez une ligne parallèle aux axones d’une longueur égale à la taille souhaitée de la fenêtre d’activation. La longueur de cette fenêtre varie en fonction de l’objectif et des paramètres expérimentaux, mais les longueurs typiques sont de 5 μm pour le paradigme d’évacuation des impulsions et de 40 μm pour le paradigme de propagation des impulsions.
8. En utilisant cette ligne comme guide, dessinez une région rectangulaire d’intérêt (ROI) à travers le champ de vision perpendiculaire aux axones. La région doit englober tous les axones à photoactiver.
9. Déterminez les paramètres optimaux pour la photoactivation avec un éclairage de 405 nm.
   REMARQUE : Effectuez uniquement cette étape et les sous-étapes avant la première activation expérimentale. Au cours d’une expérience, les mêmes paramètres de photoactivation doivent être utilisés.
   1. Activez une région d’intérêt à plusieurs reprises à l’aide de la ligne laser de 405 nm, de la faible puissance laser (p. ex., 5 %) et du temps de séjour des pixels (p. ex., 40 μs) et d’une impulsion, en acquérant une image de la fluorescence GFP activée après chaque activation. Répéter jusqu’à ce que la fluorescence n’augmente plus, puis quantifier la fluorescence dans une région d’intérêt pour chaque image.
   2. Tracer les intensités moyennes de fluorescence par rapport au nombre d’impulsions. Sélectionnez le nombre d’impulsions après lesquelles la fluorescence n’augmente plus en tant que nombre optimal d’impulsions pour l’activation.
10. Activez la fluorescence paGFP de la région dessinée à l’étape 5.8 par excitation à motifs avec 405 nm de lumière. Assurez-vous qu’une image est acquise juste avant et juste après l’activation.
    REMARQUE : L’activation idéale du paGFP produira une région de fluorescence clairement définie avec des limites nettes contenues dans le roi.
11. Démarrez une minuterie de 1 minute à la fin de l’activation. Au bout d’une minute, début de l’acquisition d’une série de timelapse.
    REMARQUE : Le délai de 1 minute est nécessaire pour permettre l’augmentation de la fluorescence observée après la photoactivation du paGFP¹¹. Pour la méthode de propagation des impulsions, une période d’acquisition de 5 à 10 minutes avec des intervalles de timelapse de 30 secondes est suffisante pour mesurer les pentes initiales dans les fenêtres centrales et latérales afin de mesurer la vitesse et la directionnalité. Pour la méthode d’évacuation des impulsions, une période d’acquisition de 30 à 150 minutes avec des intervalles de timelapse de 5 ou 10 minutes permet d’analyser le comportement de pause à long terme des filaments
12. Enregistrez toutes les images acquises, ainsi que le retour sur investissement utilisé pour l’activation de la fluorescence.
13. Déplacez-vous vers une nouvelle région du nerf et répétez les étapes 5.1-5.11. Si la nouvelle région se trouve le long du même axone, elle doit être à au moins 500 μm de la région précédemment activée pour éviter la détection de neurofilaments fluorescents qui ont quitté l’autre région activée. L’acquisition du timelapse final doit se terminer avant la fin de la fenêtre de 3 heures.
    REMARQUE : Il est possible que la préparation soit viable pendant plus de 3 heures, mais nous ne l’avons pas confirmé. Avec la dissection et la préparation compétentes, entre cinq et huit ensembles d’image timelapse de 10 minutes peuvent être acquis dans cette fenêtre de 3 heures.
14. Une fois la dernière série d’images en timelapse acquise, arrêtez le flux de solution saline, déconnectez la solution et les chauffe-chambres, et retirez l’appareil de perfusion du stade du microscope.

6. Acquisition d’images Flatfield et darkfield

1. Faire une solution de fluorescéine en ajoutant 250 mg de poudre de fluorescéine à 0,5 mL d’eau double distillée. Mélanger jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de particules visibles et faire tourner la solution pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table pour sédimenter tout matériau non dissolved. Cette solution peut être stockée pendant plusieurs mois à 4 °C si elle est protégée contre l’exposition à la lumière.
2. Ajouter 8 μL de solution de fluorescéine à une lame et appliquer un couvercle #1,5. Épongez l’excès de liquide, scellez avec du vernis à ongles et laissez sécher.
   REMARQUE : À cette forte concentration, la forte absorption du colorant fluoréscéin éteint le faisceau d’éclairage à l’intérieur de la solution, produisant un plan mince de fluorescence à la surface du couvercle qui est à la fois uniforme et résistant au photobleaching dû à l’échange diffusif rapide¹².
3. Placez la lame de fluorescéine sur le côté du microscope inversé et réglez l’accent sur le plan mince de fluorescence à la surface du couvercle. Déplacez-vous autour de la diapositive pour trouver un champ de vision qui ne contient pas de bulles d’air (taches sombres) ou de grandes particules de fluorescéine (taches lumineuses).
4. Acquérir une pile z couvrant 6 μm à des intervalles de 0,2 μm de telle sorte que l’image du milieu soit le plan de mise au point d’origine. Utilisez un court temps d’exposition (p. ex., 40 ms) parce que la fluorescence sera très brillante. Cette acquisition de la pile z est nécessaire pour capturer la fluorescence maximale à travers le champ de vision car le couvercle est rarement parfaitement horizontal et le plan de fluorescence de la fluorescence de la fluorescence est très étroit. Répétez cette opération pour un total de 25 champs de vue, déplaçant la scène d’au moins 20 μm dans n’importe quelle direction entre les champs.
5. Fermez tous les volets de chemin lumineux, y compris l’obturateur de la caméra, et réglez la puissance laser et le temps d’exposition à zéro. Acquérir une pile de 100 images avec ces paramètres. Ces images seront en moyenne pour générer l’image darkfield, qui sera utilisé pour corriger le courant sombre et le décalage de biais sur la puce de la caméra.
   REMARQUE : L’acquisition en continu est un moyen idéal de capturer ces images.

7. Imagerie glycolytiquement inhibé les nerfs pour la correction d’eau de Javel

1. Faire et oxygéner une solution saline comme à l’étape 1; toutefois, remplacez le glucose D-2-désoxy-D et ajoutez 0,5 mM d’iodoacétate de sodium pour inhiber la glycolyse¹³. Nous appelons cela « saline inhibitrice ».
2. Répétez les étapes 2 à 5 à l’aide de la solution saline inhibitrice, avec une image timelapse de 10 à 30 minutes définie à l’étape 5.11. Prévoyez 40-50 minutes après l’application de la solution saline inhibitrice avant l’imagerie afin d’assurer l’inhibition complète du transport de neurofilament.
   NOTE: L’inhibition glycolytique finira par tuer les axones de sorte qu’il ya une fenêtre étroite de temps après l’inhibition dans laquelle acquérir des données, généralement environ 30 minutes. Un indicateur du niveau d’inhibition métabolique est l’autofluorescence flavin des mitochondries axonales, qui peut être détectée dans la série timelapse en raison des longues expositions que nous utilisons pour l’image de la fluorescence paGFP¹⁴. Typiquement, l’autofluorescence mitochondriale augmentera pendant le traitement avec la solution saline inhibitrice. Si les mitochondries commencent à s’arrondir ou à se fragmenter, cessez d’être imagerie.

8. Traitement et analyse d’images à l’aide d’ImageJ

1. Correction de terrain plat et de champ noir
   1. Ouvrez la pile d’images darkfield et moyennez les images en cliquant sur Image | Piles | Z Project et sélectionner Intensité moyenne dans le menu déroulant pour générer l’image darkfield.
   2. Ouvrez les piles d’images de champ plat de fluorescein et créez une projection d’intensité maximale de chacun (25 au total) en cliquant sur Image | Piles | Z Project et sélection de l’intensité maximale dans le menu déroulant.
   3. Combinez les 25 images de projection maximale résultantes en une seule pile en cliquant sur Image | Piles | Images à empiler. Créer une projection d’intensité moyenne de cette pile en cliquant sur Image | Piles | Z Project et sélectionner Intensité moyenne dans le menu déroulant pour générer l’image flatfield.
   4. Soustrayez l’image darkfield de l’image flatfield en cliquant sur Processus | Calculatrice d’image, en sélectionnant Soustrait comme opération. Assurez-vous que l’option de résultat 32 bits (float) est vérifiée. Le résultat est l’image corrigée flatfield.
   5. Mesurer l’intensité moyenne des pixels de l’image corrigée en cliquant d’abord sur Analyser | Définissez les mesures et vérifiez la zone valeur grise moyenne, puis appuyez sur la touche ' m'.
   6. Divisez l’image corrigée du champ plat par son intensité moyenne en cliquant sur Processus | Mathématiques | Divisez et entrez la valeur grise moyenne obtenue à l’étape 7.1.5. Cela produira l’image inverse de gain.
   7. Ouvrez les images de pré-activation et de post-activation ainsi que la pile d’images timelapse. Combinez les images en une seule pile en cliquant sur Image | Piles | Outils | Concaténate, et sélectionnez les images dans l’ordre chronologique dans les menus déroulants. Assurez-vous que l’option Ouvrir en tant qu’image 4D n’est pas sélectionnée. La pile qui en résulte est l’ensemble d’images complet.
   8. Répétez l’étape 8.1.4 sur l’ensemble d’images complet, puis divisez le résultat par l’image inverse de gain en cliquant sur Processus | Calculatrice d’image et sélection de Diviser comme opération. Cela produira l’ensemble d’images complètes corrigés,dans lequel chaque image a été corrigée pour la non-uniformité dans le domaine de l’éclairage et sur le détecteur.
2. Alignement de la pile d’images
   1. Pour corriger le mauvais alignement des plans d’image dans la série timelapse en raison de la dérive d’étape ou d’échantillon, installez le plugin Alignement par région fixe ( Fichier supplémentaire1) en cliquant sur Plugins | Installez PlugIn, naviguez vers le dossier contenant le fichier plugin et sélectionnez le plugin. Redémarrez ImageJ après l’installation du plugin.
      REMARQUE : Ce plugin aligne les images en fonction du principe¹⁵du « moins carrés de congealing ».
   2. Dessinez un retour sur investissement sur l’ensemble d’images complètes corrigé qui s’étend sur plusieurs axones et ne s’étend pas au-delà des limites proximales et distales de la fluorescence activée dans chacun des axones. La géométrie de la région n’est pas importante, mais à l’exclusion des zones dans lesquelles les structures changent de forme ou de taille améliorera l’alignement.
   3. Exécutez le plugin d’alignement en cliquant sur Plugins | Alignement par région fixe. Le plugin place un maximum par défaut de 2 pixels sur le déplacement entre les images, mais cela peut être ajusté dans la fenêtre contextuelle initiale s’il y a une dérive significative de l’échantillon. L’alignement peut prendre plusieurs minutes, selon la taille de la pile d’images.
   4. Inspectez visuellement la pile alignée pour évaluer la qualité de l’alignement. Certains cadres peuvent alors avoir besoin d’être alignés manuellement, car l’alignement automatisé peut ne pas fonctionner bien pour de grandes fluctuations de fluorescence entre les cadres. Cela peut être accompli lors de l’affichage d’un cadre qui doit être déplacé en cliquant sur Image | Transformer | Traduire. Cliquez sur Non sur la fenêtre contextuelle suivante pour demander si la pile entière doit être traduite. Utilisez uniquement les valeurs de pixels entiers dans la traduction et assurez-vous que le menu d’interpolation déroulant est défini sur Aucun, car les décalages de pixels fractionnés ou l’interpolation modifieront les données en raison du réampling des intensités de pixels.
   5. Enregistrez-le en tant que jeu d’images complet aligné.
3. Mesure des intensités de fluorescence
   1. Dessinez un retour sur investissement à l’aide de l’outil Angle sur le premier cadre de l’ensemble d’images complètes alignés avec le premier bras le long d’un bord de la région activée, perpendiculaire aux axones, et le deuxième bras vertical. Appuyez sur la touche « » pour mesurer l’angle, qui décrit l’orientation des axones dans le champ de vision.
   2. Définissez l’échelle des images de sorte que les dimensions soient mesurées en microns en cliquant sur Analyser | Définissez l’échelle et entrez les valeurs appropriées.
   3. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de roi. Pour le paradigme d’évasion par impulsion, passez à l’étape 8.3.7. Pour la propagation du pouls, continuez à l’étape 8.3.4.
   4. Dessinez un retour sur investissement carré de toutes les dimensions, puis cliquez sur Modifier | Sélection | Spécifier. Assurez-vous que l’option Unités mises à l’échelle units est vérifiée, puis définissez le retour sur investissement sur une largeur de 15 μm et une hauteur égale ou supérieure à la hauteur de l’image.
   5. Faites pivoter le roi par l’angle mesuré à l’étape 8.3.1 en cliquant sur Modifier | Sélection | Tournez pour le rendre perpendiculaire aux axones, et placez le roi avec un côté le long du bord proximal de la région activée. Ajoutez ce retour sur investissement, que nous appellerons le guide proximal ROI, au gestionnaire en appuyant sur la touche 't'.
   6. Faites glisser le retour sur investissement pour vous aligner sur le bord distal de la région activée et ajoutez à nouveau au gestionnaire de retour en appuyant sur la touche ' t'. Nous allons nous référer à cela comme le guide distal ROI. Les ROI de guide proximal et distal seront utilisés plus tard pour dessiner les ROI de mesure de flanc.
   7. Sélectionnez les axones pour la quantification, à l’aide de la séquence d’image timelapse acquise à l’étape 5.11 ci-dessus. Cette séquence d’image est utile à cet effet car elle capture la faible autofluorescence des axones, révélant leur morphologie en dehors de la région activée.
      REMARQUE : Les axons qui ne répondent pas aux critères suivants sont exclus de l’analyse :
      1. Les axons doivent être mis au point sur toute la longueur de toutes les fenêtres de mesure.
      2. Les axones doivent être à moins de 5° des extrémités proximales et distales de la région d’activation.
      3. Les axones ne doivent pas avoir d’invaginations à moins de 5 μm des extrémités proximales et distales de la région d’activation.
      4. Exclure les axones qui changent de forme visiblement au cours de l’imagerie.
      5. Exclure les axones qui semblent malsains comme en témoigne l’absence d’une région activée discrète dans l’image post-activation (figure 2C, en bas), car cela indique la dispersion diffuse de la fluorescence activée, qui se produit lorsque l’axone meurt.
   8. Observez l’image de blanchiment à longue exposition de l’étape 5.5 pour les structures autofluorères à l’intérieur des axones. Cette fluorescence est due aux flavins dans les mitochondries¹⁶. Exclure les axones de l’analyse si ces mitochondries semblent arrondies ou fragmentées(figure 2D, en bas), par opposition aux structures linéaires étendues(figure 2D, en haut), car il s’agit d’une indication de déclin métabolique.
   9. À l’aide du guide proximal et distal ROI créé ci-dessus, dessinez trois ROV de mesure par axon en cours d’analyse : une fenêtre centrale englobant l’axone dans la région activée de 40 μm, et deux fenêtres flanquantes avec une largeur limitée par une fenêtre de flanc de 15 μm ROIs et une hauteur limitée par le diamètre de l’axone à la frontière de la région d’activation. Ajoutez les trois régions au gestionnaire de retour sur investissement. Pour les axones inhibés glycolytiquement, dessiner une seule région qui ne mesure pas plus de 5 μm de large au milieu de la région activée et qui ne s’étend pas à l’extérieur de l’axone. Pour le paradigme d’évacuation des impulsions, la région activée n’est que de 5 μm de large, de sorte que toute la fenêtre doit être utilisée.
   10. Répétez l’étape 8.3.9 pour tous les axones qui répondent aux critères des étapes 8.3.7 et 8.3.8.
   11. Définissez les mesures actives sur l’intensité moyenne des pixels en cliquant sur Analyser | Définissez des mesures et sélectionnez l’option Valeur grise moyenne. Assurez-vous qu’aucune autre option de mesure n’est vérifiée.
   12. Sélectionnez tous les ROV de la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement en sélectionnant la fenêtre et en appuyant sur 'Ctrl' + 'a'. Dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Plus | Multi Mesure pour mesurer les intensités de fluorescence. Copiez les données de la fenêtre de résultats dans une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
   13. Définissez les mesures actives sur la zone de la région en cliquant sur Analyser | Définissez des mesures et sélectionnez l’option Zone. Assurez-vous qu’aucune autre option de mesure n’est vérifiée.
   14. Répétez l’étape 8.3.12. Il suffit de copier une ligne des résultats pour la zone, car la zone ne varie pas avec le temps.

9. Correction de photobleach

1. Dans la feuille de calcul de données pour les axones glycolytically inhibés, soustrayez la fluorescence moyenne du cadre 1 (le cadre de pré-activation) de la fluorescence moyenne de chaque image à partir du cadre 3 (le premier cadre de timelapse) pour un retour sur investissement donné. Les résultats sont les moyens soustraites en arrière-plan.
2. Tracez les données comme un scatterplot avec les numéros de cadre comme l’abscissa. Adapter une ligne de tendance exponentielle aux données de chaque roi (la plupart des programmes de feuille de calcul ont cette fonction) avec une équation sous la forme d’Ae-bx^-bx. Cette équation est équivalente à la fonction de photobleaching F_t = F₀ * e^-t0 où F₀ est la fluorescence au premier cadre du timelapse, est le taux de blanchiment exponentiel, t est le temps, et e est la base logarithme naturelle.
3. Répétez les étapes 9.1.1-9.1.2 pour tous les ROI de tous les axones des nerfs glycolytés inhibés. Pour l’estimation la plus précise du taux de photobleaching, utilisez au moins 15 axones au total à partir d’au moins 5 nerfs distincts. Utilisez la moyenne des taux de blanchiment exponentiels (0) de tous les axones inhibés pour corriger les données expérimentales pour le photobleaching. Un nouvel étalonnage de blanchiment doit être effectué pour chaque expérience ou étude, car le photobleaching dépend des paramètres d’acquisition d’image et de la puissance laser, qui peut changer au fil du temps.
4. Répétez l’étape 9.1.1 pour toutes les régions d’axones photographiés avec une solution saline normale (c’est-à-dire non inhibées glycolytique).
5. Divisez chaque point de données par^{e-t ,}en utilisant le temps pour t et la moyenne de l’étape 9.1.3. Ce sont les moyens corrigés par photobleach.
6. Multipliez chaque point de données par zone pour cette région d’intérêt afin de trouver la fluorescence totale dans cette région à chaque fois.

Résultats

La figure 3 montre des images représentatives d’expériences d’évacuation par impulsion et de propagation d’impulsions. Nous avons publié plusieurs études qui décrivent les données obtenues à l’aide de la méthode d’évacuation des impulsions et de nos méthodes d’analyse de ces données^5,6,7,8,17. Ci-dessous, n...

Discussion

Il faut faire attention à l’analyse des expériences d’évacuation des impulsions et de propagation des impulsions, car il existe un risque important d’introduction d’erreurs pendant le post-traitement, principalement pendant la correction du champ plat, l’alignement de l’image et la correction de l’eau de Javel. La correction de champ plat est nécessaire pour corriger la non-uniformité dans l’éclairage, ce qui entraîne une chute de l’intensité à travers le champ de vision du centre à la périph...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors