הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Summary

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

Abstract

פולימרים חלבון Neurofilament לנוע לאורך אקסונים ברכיב איטי של תחבורה אקסונלית במהירויות ממוצעות של ~ 0.35-3.5 מ"מ ליום. עד לאחרונה המחקר של תנועה זו ב situ היה אפשרי רק באמצעות תיוג דופק רדיואיזוטופי, המאפשר ניתוח של תחבורה אקסונלית בעצבים שלמים עם רזולוציה זמנית של ימים ורזולוציה מרחבית של מילימטרים. כדי ללמוד תחבורה neurofilament בסיטו עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה יותר, פיתחנו עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא חלבון neurofilament M מתויג עם GFP פוטואקטיבית בנוירונים. כאן אנו מתארים פלואורסץ פוטו-הפעלה פולס-לברוח ושיטות התפשטות דופק לנתח תחבורה neurofilament באקסונים מיאליים יחיד של עצבי השוקה מעכברים אלה ex vivo. קטעי עצב מבודדים נשמרים על שלב המיקרוסקופ על ידי עירוי עם תמיסת מלח מחומצנת ותמונה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנס דיסק ספינוד ספינוד. אור סגול משמש להפעלת הפלואורסצנס בחלון קצר. הפלואורסצינטיות באזורים הפעילים והמאגפים מנותחת לאורך זמן, מה המאפשר את המחקר של תעבורת נוירופילמנט עם רזולוציה זמנית ומרחבית בסדר של דקות ומיקרונים, בהתאמה. מידול מתמטי יכול לשמש כדי לחלץ פרמטרים קינטיים של תעבורת neurofilament כולל המהירות, הטיה כיוונית והתנהגות ההשהיה מהנתונים המתווברים. שיטות הבריחה הדופק והתפשטות הדופק ניתן גם להתאים כדי לדמיין את התחבורה neurofilament בעצבים אחרים. עם התפתחותם של עכברים טרנסגניים נוספים, שיטות אלה יכול לשמש גם כדי למצוא תמונה ולנתח את ההובלה האקסונלית של חלבונים ציטוסקאלטיים וציטוסוליים אחרים באקסונים.

Introduction

הטרנספורט האקסונלי של neurofilaments הוכח לראשונה בשנות ה-70 על ידי תיוג דופק רדיואיזוטופי¹. גישה זו הניבה שפע של מידע על תחבורה neurofilament ב vivo, אבל יש לו רזולוציה מרחבית וזמנית נמוכה יחסית, בדרך כלל על סדר של מילימטרים וימים במקרה^{הטוב 2}. יתר על כן, תיוג דופק רדיואיזוטופי היא גישה עקיפה הדורשת הזרקה והקרבה של בעלי חיים מרובים כדי ליצור קורס זמן יחיד. עם הגילוי של חלבוני פלורסנט והתקדמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשנות ה-90, לאחר מכן זה הפך להיות אפשרי לתעבורת neurofilament תמונה ישירות נוירונים תרבותיים בקנה מידה של שניות או דקות עם רזולוציה מרחבית תת מיקרומטר, מתן תובנה הרבה יותר גדולה לתוך מנגנון^{תנועה 3}. מחקרים אלה גילו כי פולימרים neurofilament באקסונים לנוע במהירות לסירוגין הן anterograde ו לאחור כיוונים לאורך מסלולים microtubule, מונע על ידי חלבונים מוטוריים microtubule. עם זאת, neurofilaments הם מבנים מוגבלים iffraction רק 10 ננומטר קוטר כי הם בדרך כלל רווחים מלבד שכניהם על ידי עשרות ננומטר בלבד; לכן, הפולימרים ניתן לעקוב רק נוירונים תרבותיים המכילים neurofilaments מופץ דלילה, כך פולימרים נעים ניתן לפתור משכניהם⁴. לכן, זה לא אפשרי כיום לעקוב אחר neurofilaments יחיד באקסונים המכילים פולימרים neurofilament בשפע, כגון אקסונים מילינציה.

כדי לנתח את התחבורה האקסונלית של neurofilaments באקסונים עשירים neurofilament באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצנטית, אנו משתמשים בשיטת פלומת פעולה פלואורסצנטית שפיתחנו כדי ללמוד את התנהגות השהיה לטווח ארוך של neurofilaments^{בתאי עצב מתואורים 4,,5}. Neurofilaments מתויג עם חלבון היתוך נוירופילמנט פלואורסצנטי פוטואקטיבי מופעלים בקטע קצר של axon, ולאחר מכן קצב היציאה של נטים אלה מהאזור הפעיל הוא מכמת על ידי מדידת ריקבון פלואורסצנטי לאורך זמן. היתרון של גישה זו הוא שזה ניתוח ברמת האוכלוסייה של תחבורה neurofilament שניתן להחיל על זמן בקנה מידה של דקות או שעות ללא צורך לעקוב אחר התנועה של פולימרים neurofilament בודדים. לדוגמה, השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח את הקינטיקה של תעבורת neurofilament בתרבויות מדליה⁶.

לאחרונה, תיארנו את הפיתוח של עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא רמות נמוכות של חלבון neurofilament מתויג paGFP M (paGFP-NFM) בנוירונים תחת שליטתו של הנוירון האנושי ספציפי Thy1^{מקדם 7}. עכבר זה מאפשר ניתוח של תחבורת neurofilament בסיטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ. במאמר זה, אנו מתארים את הגישות הניסיוניות לניתוח תעבורת neurofilament באקסונים מיאליים של עצבי טיביים מעכברים אלה באמצעות שתי גישות. הראשונה של גישות אלה היא שיטת הבריחה הדופק המתואר לעיל. שיטה זו יכולה ליצור מידע על התנהגות ההשהיה של neurofilaments, אבל הוא עיוור לכיוון שבו הנינים לעזוב את האזור מופעל, ולכן אינו מאפשר מדידה של כיווניות נטו ומהירות^{תחבורה 8}. השנייה של גישות אלה היא שיטת התפשטות פולסים חדשה שבה אנו מנתחים לא רק את אובדן הפלואורסצנטי מהאזור הפעיל, אלא גם את העלייה ארעית בפלואורסצנטיות בשני חלונות איגוף שדרכה נעים הניאורים הפלואורסצנטיים כשהם יוצאים מהאזור הפעיל הן בכיוון אנטרולוגי והן בכיוון הנסיגה. בשתי הגישות, ניתן להשיג פרמטרים של תעבורת נוירופילמנט כגון המהירות הממוצעת, כיווניות נטו והתנהגות השהיה באמצעות ניתוח מתמטי ומידול של השינויים בפלואורסצנטיות בחלונות המדידה. איור 3 ממחיש את שתי הגישות הללו.

פרוטוקול זה מדגים את הניתוח וההכנה של העצב, ההפעלה וההדמיה של הפלואורסצנטיות paGFP, וכמת של תעבורת neurofilament מהתמונות שנרכשו באמצעות חבילת ההפצה FIJI של ImageJ⁹. אנו משתמשים בעצב הטיבי כי הוא ארוך (כמה ס"מ) ואינו מסתעף; עם זאת, באופן עקרוני כל עצב המביע paGFP-NFM מתאים לשימוש עם טכניקה זו אם ניתן לנתח אותו de-נדן מבלי לפגוע האקסונים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת אוהיו.

1. הכנת תמיסת מלח עצבית

1. הפוך 100 מ"ל של תמיסת^{מלח של ברויר 10}: 98 מ"מ NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 1.5 מ"מ CaCl₂, 5.6% D-גלוקוז, 23.8 mM NaHCO₃ במים מזוקקים כפול.
2. בועה 95% חמצן / 5% פחמן דו חמצני (קרבוגן) דרך תמיסת מלח לפחות 30 דקות לפני השימוש. ניתן לעשות בהן תמיסת מלח שאריות בתוך שבוע אחד; עם זאת, יש להוקסין אותו מחדש לפני כל שימוש.
3. יוצקים תמיסת מלח מחומצן למזרק של 60 מ"ל ומוודאים שנותר אוויר מינימלי במזרק.

2. הרכבה ראשונית של תא עירוי עצבי

1. חברו את המזרק ואת הצינורות כפי שמצג באות 1A, והניחת צינור הזרימה לתוך בקבוקון פסולת.
2. מניחים את האטם התחתון לתוך הדיור של תא ההתזות, כדי להבטיח שכנס הזרימה ועמדות העודף מיושרים עם החורים באם.
3. מניחים את האטם הפנימי (סיליקון, 100 μm עבה) על כיסוי עגול #1.5 (40 מ"מ קוטר), בזהירות להחליק את כל הקמטים באטום כדי להבטיח אטם הדוק. כדי להקל על הרכבה מאוחרת יותר, מניחים את הכיסוי והטם על מגבת נייר או על מגבון משימה כשהטם פונה כלפי פנים כלפי פנים.

3. פירוק והכנה של עצב התריס

1. להקריב את החיה על ידי שאיפת פחמן דו חמצני או שיטה אחרת שאושרה על ידי מוסד. התחל טיימר כאשר החיה מפסיקה תנועה / נשימה, כמו ניסויים יש לערך רק בתוך 3 שעות של הקרבה^7.
2. מרססים את הפרווה ב-70% אתנול ומסירים כמה שיותר מהרגליים והגב של החיה בעזרת סכין גילוח חשמלי.
3. באמצעות זוג מספריים ניתוח גדול, לעשות חתך גב בעור ליד אמצע עמוד השדרה ולהמשיך את החתך סביב ההיבט החנוני של החיה. החל מחתך זה, לאט לשקף את העור מהרגליים על ידי בעדינות מושך אותו מן השריר וחיתוך fascia.
4. מניחים את החיה בתמונת עליונות על מגש פירוק ומצמידים את כל ארבע כפות הרגליים. לחלופין, הצמד את הזנב כדי להפחית את התנועה עוד יותר.
5. באמצעות מספריים microdissection, לעשות חתך בשרירי הירך באמצע הדרך בין הזנב והברך כדי לחשוף את עצב הירך. ודא כי העצב, אשר נראה דרך השריר, לא לחתוך.
6. להאריך את החתך גב גב ובפתח כדי להסיר את השריר. באופן דומה, להסיר את שרירי השוק, שמירה על חתכים רדודים וקצרים כדי למנוע פגיעה בעצב.
7. הסר את השרירים עד שעצב השוקה נחשף במלואו מהנומה שבה הוא מסתעף מעצב הירך (בברך) לעקב(איור 2א).
   הערה: בכל השלבים, כולל ובעקבות ניתוח של עצב השוקה, הימנע מחשיפה מיותרת לאור הסביבה כדי למזער הפעלה מקרית אפשרית של paGFP בעצב.
8. אחז בעצב הטיבי בקצה עמוד השדרה-פרוקסימלי עם זוג מלקות וחתוך את העצב באמצעות זוג מספריים מיקרו-דיסציה. לדאוג לא לשים מתח על העצב, להרים אותו מהשריר, חיתוך כל החזקות.
9. חותכים את הקצה הדיסטלי של עצב הטיבי והעבר לצלחת פטרי קטנה של תמיסת מלח מחומצן בטמפרטורת החדר. מנודה זו על ההליך, תמיד להיות בטוח כדי לעקוב אחר הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של העצב.
   הערה: דרך אחת לעשות זאת היא לסמן את הקצה הדיסטלי של העצב עם חתך זוויתי כך שהתחדד יהיה גלוי.
10. החל מהקצה הפרוקסימלי של העצב, לתפוס בעדינות את האקסון החשוף מסתיים עם זוג מלקות עדינות מאוד.
11. עם זוג מפסים שני, אחז בננדן העצבי במהירות, ומשוך באיטיות לעבר הקצה הדיסטלי של העצב. נדן העצב יחליק לאורך האקסונים בהתנגדות מינימלית. ודא כי אין מתח מיותר מוחל על העצב במהלך תהליך זה.

4. הרכבה סופית של תא עירוי עצבי

1. תופס את הקצה הפרוקסימלי של העצב, להסיר אותו מהתמיסת מלח ולהניח אותו באיטיות על הכיסוי של תא התסיסה בתוך הפתח המלבני של האטם הפנימי, שמירה על מתח עדין על העצב כפי שאתה מניח אותו, כך שהוא שוכב ישר.
2. מניחים את החלקה מיקרו-מים מעל העצב כאשר הצד החריץ פונה לעצב, ואת כיוון הזרימה במקביל לעצב. הפוך את כיסויי הכיסוי ואת מכלול microaqueduct מעל, ולמקם אותו בתוך הדיור תא התזתוב עם מגלשת microaqueduct התפייסות לאוטם החוץ. העצב והטם הפנימי שמסביב יהיו כעת כריך בין כיסוי הגלישה ואת מגלשת microaqueduct, אשר מופרדים על ידי האטם, עם כיסוי פונהכלפי למעלה (איור 1B).
3. אבטחו את תא ההזתה על-ידי הצבתו בבית המתכת וסיבוב טבעת הנעילה. ודא כי דיור פלסטיק הוא באופן מלא תחת כל קליפי מתכת להדק היטב כדי למנוע דליפת תמיסת מלח. לחץ יתר עלול לפצח את מגלשת המיקרו-מים או את כיסוי הכיסוי. הפוך את התא כך כיסוי הוא פונה כלפי מטה.
4. לדכא לאט את בוכנה מזרק תמיסת מלח כדי למלא את תא התבעוב. שמור את הצינורות שקע ושקע, בקבוקון שקע ומזרק מוגבה מעל התא עצמו בכל עת במהלך ההתקנה וההדמיה. זה מונע שאיבת, אשר יכול להציג בועות או לגרום לחוסר יציבות פוקוס בשל לחץ שלילי בתא.
5. מעבירים את מכלול ההתזות לשלב מיקרוסקופ הפוך והניבו את המזרק המסתור לתוך משאבת המזרק. הפעל את המנוע במהירות מתאימה לקצב זרימה של 0.25 מ"ל/דקה. לאחר מכן התחבר והפעיל את דוד הפתרון ההתירמוכן ל- 37°C.
6. חבר את התנור האובייקטיבי והגדר ל-37°C, החל שמן על המטרה והכנס את תא הזבות להרכבה על הבמה.
7. מורחת שמן על משטח התנור התא וצורפים לתא התפר. חבר והפעיל את דוד התא; הגדר ל- 37 °C.
   הערה: שינויים בטמפרטורה עלולים לגרום בועות להיווצר בתא התועבת עקב outgassing של הפתרון. אם נוצרות בועות, הגדל לזמן קצר את קצב זרימת הפתרון ב-5-10x עד שהבועות יתבהרו.
8. נעל את תא התסיסה לתוך מתאם הבמה ומביא את השמן האובייקטיבי במגע עם הכיסוי בצד התחתון של התא.
   הערה: תא הביוטק עם מתאם שלב ASI המשמש כאן מיועד לתצורת מיקרוסקופ הפוכה.

5. הפעלת פלואורסנס ורכישת תמונה

1. באמצעות תאורת brightfield, התמקד בשכבת האקסונים על פני השטח התחתון של העצב הקרוב ביותר למשטח כיסוי(איור 2B). אקסונים מילינים (בדרך כלל 1 - 6 μm קוטר בעכברים בוגרים) ניתן לזהות על ידי הנוכחות של נדן מילין, אשר נראה תחת תאורת אור שידור brightfield ללא שיפור ניגודיות. שכך גם שצועצוצוץ וצמהונים של רנביר ניכרים. אקסונים לא מומינליים דקים יותר (בדרך כלל <1 μm קוטר) והם בדרך כלל נוכחים בחבילות (חבילות Remak), שם הם בדרך כלל קרוב מדי apposed כדי להיפתר אחד מהשני.
2. אם זמין במיקרוסקופ, הפעל את מערכת המיקוד האוטומטי כדי לשמור על מיקוד במהלך הדמיית זמן.
3. רכש תמונת הפניה של Brightfield. הקלט את הכיוון של העצב (עמוד השדרה-proximal וקצוות דיסטליים) ביחס לתמונות.
4. רכש תמונה מדבקת באמצעות לייזר של 488 ננ"מ ומסנן פליטה המתאים ל-paGFP (לדוגמה, 525/50 ננ"מ) כדי לתעד את שפעת טרום האקונומיקה האוטומטית. שמור על כוח הלייזר נמוך כדי למזער את ההתכה, כאשר זמן החשיפה מותאם בהתאם כדי לזהות את האות הקלוש. כדוגמה, נתונים מייצגים נרכשו ב-5% כוח לייזר ו-4 חשיפות. רטוט את הגדרות הרכישה לשימוש בכל הניסויים העתידיים.
   הערה: לאחר הפעלה פוטואקטיבית, הגדרות ההדמיה האידיאליות ייצרו יחס אות לרעש > 8 וצילום של פחות מ-25% מהאות המקורי במהלך 20 תמונות. האקסונים יכולים להיות גם בתמונה על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסץ רחב כפי^{שעשינו במקור 7}, אבל איכות התמונה תהיה נחותה בשל חוסר הקונסוליות.
5. הגדר את כוח הלייזר כ-5x כוח הדמיה רגיל ורכוש תמונה עם זמן חשיפה של 3-4 דקות. למרות לא חיוני, צעד זה מומלץ להלבין autofluorescence ומקורות אחרים של פלואורסץ לא רצויים על מנת להפחית את אות הרקע ובכך למקסם את האות לרעש של פלואורסץ פוטואקטיבי.
6. רכוש תמונה עם ההגדרות המשמשות בשלב 5.4 כדי להקליט את קדם-הפעלה אוטומטית לאחר שלב הלבנה זה.
7. בתדמית brightfield, צייר קו מקביל לאקסונים באורך השווה לגודל חלון ההפעלה הרצוי. אורכו של חלון זה ישתנה בהתאם למטרה הניסיונית ולפרמטרים, אך אורכים אופייניים הם 5 μm עבור פרדיגמת הבריחה דופק ו 40 μm עבור פרדיגמת התפשטות הדופק.
8. באמצעות קו זה כמדריך, צייר אזור מלבני של עניין (ROI) על-פני שדה התצוגה בניצב אל האקסונים. האזור חייב להקיף את כל האקסונים כדי להיות פוטואקטיבי.
10. הפעל את הפלואורסצנציה paGFP האזור נמשך בשלב 5.8 על ידי דוגמאות של תדר עם אור 405 צפון צפון. ודא שתמונה נרכשת ממש לפני ההפעלה ובדיוק לאחר ההפעלה.
    הערה: הפעלת paGFP האידיאלית תייצר אזור מוגדר בבירור של פלואורסצנס עם גבולות חדים הכלולים ב-ROI.
11. התחל שעה של דקה אחת עם סיום ההפעלה. בתום דקה אחת, התחילו ברכישה של סדרת זמן.
    הערה: העיכוב של דקה אחת יש צורך לאפשר את העלייה בפלואורסצנס שנצפה לאחר פוטו-הפעלה של paGFP¹¹. עבור שיטת התפשטות הדופק, תקופת רכישה של 5-10 דקות עם מרווחי זמן של 30 שניות מספיקה למדידת המדרונות הראשוניים בחלונות המרכזיים והמאגפים כדי למדוד מהירות וכיוון. עבור שיטת הבריחה דופק, תקופת רכישה של 30-150 דקות עם 5 או 10 דקות מרווחי זמן מאפשר ניתוח של התנהגות ההשהיה לטווח ארוך של התיים
12. שמור את כל התמונות שנרכשו, כמו גם את ההחזר על ההשקעה המשמש להפעלת פלואורסצית.
13. עבור לאזור חדש של העצב וחזור על שלבים 5.1-5.11. אם האזור החדש הוא לאורך אותו axon, זה חייב להיות לפחות 500 μm מהאזור שהופעל בעבר כדי למנוע זיהוי של neurofilaments פלורסנט שעברו מהאזור הפעיל האחר. רכישת הזמן הסופי חייבת להסתיים לפני סוף חלון ה-3 שעות.
    הערה: ייתכן שההכנה עשויה להיות בת קיימא למשך יותר מ- 3 שעות, אך לא אישרנו זאת. עם ניתוק והכנה מיומנים, בין חמש לשמונה ערכות תמונה של 10 דקות ניתן לרכוש בתוך חלון זה של 3 שעות.
14. לאחר רכשה סדרת התמונה האחרונה, הפסק את זרימת תמיסת מלח, נתק את התמיסה ואת תנורי התא, והסר את אפליקציית הסבז'ן לשלב המיקרוסקופ.

6. רכישת תמונות פלאטפילד ו- Darkfield

1. להפוך פתרון של פלואורסצ'ין על ידי הוספת 250 מ"ג של אבקת פלואורסצ'ין 0.5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים. מערבבים עד שאין חלקיקים גלויים ומסובבים את הפתרון למשך 30 שניות צנטריפוגה על השולחן כדי לחשמל כל חומר לא פתור. ניתן לאחסן פתרון זה במשך מספר חודשים ב- 4 °C אם מוגן מפני חשיפה לאור.
2. הוסף 8 μL של פתרון פלואורסצ'ין לשקופית ולהחיל #1.5. כתם נוזל עודף, לאטום עם לק, ולאפשר לייבוש.
   הערה: בריכוז גבוה זה, הספיגה החזקה של צבע הפלואורסגין מכבה את הקרן המאירה בתוך הפתרון, ומייצרת מישור דק של פלואורסצנטיות על פני השטח של כיסוי הכיסוי, כי הוא גם אחיד ועמיד בפני פוטו-בליך^{עקב חילופי מפזר מהיר 12}.
3. מקם את החלקה הפלואורסצ'ין מכסה-צד כלפי מטה על שלב מיקרוסקופ הפוך ולהתאים את המיקוד על המישור הדק של פלואורסצסצט על פני השטח של כיסוי. לנוע סביב השקופית כדי למצוא שדה תצוגה שאינו מכיל בועות אוויר (כתמים כהים) או חלקיקי פלואורסן גדולים (נקודות בהירות).
4. לרכוש z-stack המשתרע על פני 6 μm במרווחי 0.2 μm כך התמונה האמצעית היא מישור המיקוד המקורי. השתמש בזמן חשיפה קצר (לדוגמה, 40 ms) מכיוון שהפלואורסוצנס יהיה בהיר מאוד. רכישת z-stack זה הכרחי כדי ללכוד את הפלואורסצנטיות המקסימלית על פני שדה התצוגה כמו כיסוי הוא לעתים רחוקות אופקי בצורה מושלמת ומישור פלואורסצנטיות פלורסין הוא צר מאוד. חזור על פעולה זו עבור סך של 25 שדות תצוגה, הזזת השלב על-ידי לפחות 20 μm בכל כיוון בין שדות.
5. סגור את כל תריסי נתיב האור, כולל תריס המצלמה, והגדר את כוח הלייזר ואת זמן החשיפה לאפס. רכוש ערימה של 100 תמונות עם הגדרות אלה. תמונות אלה יהיו בממוצע כדי ליצור את התמונה darkfield, אשר ישמש לתיקון עבור זרם כהה ואת היסט הטיה על שבב המצלמה.
   הערה: רכישת זרימה היא דרך אידיאלית ללכוד תמונות אלה.

7. הדמיה גליקולית מעוכבת עצבים לתיקון אקונומיקה

1. להפוך ולחמצן תמיסת מלח כמו בשלב 1; עם זאת תחליף 2-deoxy-D-גלוקוז עבור D-גלוקוז ולהוסיף 0.5 mM נתרן iodoacetate לעכב גליקוליזה¹³. אנחנו קוראים לזה "תמיסת מלח מעכבת".
2. חזור על שלבים 2-5 באמצעות תמיסת מלח מעכבת, עם תמונה של 10-30 דקות של זמן מוגדר בשלב 5.11. אפשר 40-50 דקות לאחר היישום של תמיסת מלח מעכבת לפני ההדמיה כדי להבטיח עיכוב מלא של תחבורת neurofilament.
   הערה: עיכוב גליקוליטיק בסופו של דבר יהרוג את האקסונים כך שיש חלון צר של זמן לאחר עיכוב שבו להשיג נתונים, בדרך כלל על 30 דקות. אינדיקטור של רמת העיכוב חילוף החומרים הוא הפלבין autofluorescence של המיטוכונדריה אקסורציה, אשר ניתן לזהות בסדרת timelapse בשל החשיפות הארוכות בהן אנו משתמשים כדי למצוא את הפלואורסצנציה paGFP¹⁴. בדרך כלל, מיטוכונדריה autofluorescence יגדל במהלך הטיפול עם תמיסת מלח מעכבת. אם המיטוכונדריה מתחילה לאסוף או לרסיס, אז להפסיק את ההדמיה.

8. עיבוד וניתוח תמונה באמצעות ImageJ

1. תיקון שטוחפילד ושדה אפל
   1. פתח את מחסנית התמונות Darkfield וממוצע התמונות על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | Z Project ובחירה בעוצמה ממוצעת בתפריט הנפתח כדי ליצור את תמונת Darkfield.
   2. פתח את ערימות התמונה flatfield פלואורסצ'ין וליצור הקרנת עוצמה מרבית של כל (25 בסך הכל) על ידי לחיצה על תמונה | ערימות | Z Project ובחירה בעוצמה מרה בתפריט הנפתח.
   3. שלב את 25 תמונות ההקרנה המרביות לתוך מחסנית אחת על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | תמונות לערימה. צור הקרנת עוצמה ממוצעת של מחסנית זו על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | Z Project ובחירה בעוצמה ממוצעת מהתפריט הנפתח כדי ליצור את תמונת השד השטוח.
   4. הפחת את תמונת השדה האפל מתדמית השד השטוח על-ידי לחיצה על 'הפוך ל'תהליך' | מחשבון תמונה, בחירה באפשרות חיסור כפעולה. ודא שאפשרות התוצאה של 32 סיביות (ציפה) מסומן. התוצאה היא תמונת השד השטוח התוקנה.
   5. מדוד את עוצמת הפיקסל הממוצעת של תמונת השד השטוח התוקנת על-ידי לחיצה ראשונה על נתח | הגדר מדידות ובדוק את התיבה ערך אפור ממוצע ולאחר מכן הקש על מקש 'm'.
   6. חלק את תמונת השד השטוח ההתקן בעוצמה הממוצעת שלה על-ידי לחיצה על '22' | מתמטיקה | חלק והזן את הערך האפור הממוצע שהושג בשלב 7.1.5. כך תפיק תמונת רווח הפוכה.
   7. פתח את התמונות שלפני ההפעלה ולאחר ההפעלה יחד עם מחסנית התמונות של timelapse. שלב את התמונות בערימה בודדת על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | כלים ומידע | תסנכרןובחר את התמונות בסדר כרונולוגי מהתפריטים הנפתחים. ודא שהאפשרות פתח כתדמית 4D לא נבחרה. המחסנית שנוצרה היא סט התמונה המלא.
   8. חזור על שלב 8.1.4 בסדרת התמונה המלאהולאחר מכן חלק את התוצאה בתדמית ההברך על-ידי לחיצה על תהליך | מחשבון תמונה ובחירה באפשרות חלק כפעולה. פעולה זו תייצר את סט התמונההמלא התוקן , שבו תוקנה כל תמונה עבור אי-אחידות בתחום התאורה ועל הגלאי.
2. יישור מחסנית תמונות
   1. כדי לתקן אי התאמה של מישורים תמונה בסדרת timelapse עקב שלב או סחיפה לדוגמה, להתקין את היישור על ידי תוסף אזור קבוע (קובץ משלים 1) על ידי לחיצה על תוספים | התקן אתה- Plug-In , ניווט לתיקיה המכילה את קובץ התוסף ובחר את התוסף. הפעל מחדש את ImageJ לאחר התקנת התוסף.
      הערה: תוסף זה מיישר תמונות בהתבסס על עקרון "הכי פחות ריבועים מתנוונים"¹⁵.
   2. צייר החזר השקעה על סט התמונה המלאה מתוקנת המשתרעת על פני מספר אקסונים ואינה משתרעת מעבר לגבולות הפרוקסימליים והדיסטליים של הפלואורסצנציה המופעלת בתוך כל אחד מהאקסונים. הגיאומטריה של האזור אינה חשובה, אולם לא כולל אזורים שבהם מבנים לשנות צורה או גודל ישפרו את היישור.
   3. הפעל את תוסף היישור על-ידי לחיצה על תוספים | יישור לפי אזור קבוע. התוסף ממקם ברירת מחדל של 2 פיקסלים לכל היותר על העקירה בין מסגרות, אולם ניתן להתאים זאת בחלון המוקפץ הראשוני אם יש סחיפה משמעותית של הדגימה. היישור עשוי להימשך מספר דקות, בהתאם לגודל מחסנית התמונה.
   4. בדוק באופן חזותי את המחסנית המיושרת כדי להעריך את איכות היישור. ייתכן שמסגרות מסוימות יצטרכו להיות מיושרות באופן ידני, מכיוון שהיישור האוטומטי עשוי שלא לתפקד היטב עבור תנודות גדולות בפלואורסצנטיות בין מסגרות. ניתן לבצע אפשרות זו בעת הצגת מסגרת שיש להזיזה על-ידי לחיצה על תמונה | שינוי צורה | תרגם. לחץ על לא ברשימה הה מוקפץ הבאה השואלת אם יש לתרגם את המחסנית כולה. השתמשו רק בערכי פיקסלים שלמים בתרגום וודאו שתפריט האינטרפולציה הנפתח מוגדר כ'ללא'- מכיוון ששינויי פיקסלים חלקיים או אינטרפולציה ישנו את הנתונים עקב גמילה מחדש של עוצמת הפיקסלים.
   5. שמור זאת כערכת התמונה המלאה המיושרת.
3. מדידה של עוצמות פלואורס
   1. צייר ROI באמצעות הכלי זווית במסגרת הראשונה של סט התמונה המלאה המיושרת עם הזרוע הראשונה לאורך קצה אחד של האזור הפעיל, ניצב לאקסונים והזרוע השנייה אנכית. הקש על מקש 'm' כדי למדוד את הזווית, המתארת את כיוון האקסונים בשדה התצוגה.
   2. הגדר את קנה המידה של התמונות כך שממדים נמדדים במיקרון על-ידי לחיצה על נתח | הגדר קנה מידה והזן את הערכים המתאימים.
   3. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על נתח | כלים ומידע | מנהל ROI. לפפרדיגמה של בריחת הדופק, דלג לשלב 8.3.7. להתפשטות הדופק, המשך לשלב 8.3.4.
   4. צייר ROI מרובע של ממדים כלשהם ולאחר מכן לחץ על ערוך | בחירה | ציין. ודא שהאפשרות יחידות עם קנה מידה מסומן ולאחר מכן הגדר את ההחזר על ההשקעה לרוחב של 15μm וגובה השווה לגובה התמונה או גדול מהם.
   5. סובב את ההחזר על ההשקעה בזווית הנמדדת בשלב 8.3.1 על-ידי לחיצה על ערוך | בחירה | סובב כדי להפוך אותו בניצב לאקסונים, והצב את ההחזר על ההשקעה עם צד אחד לאורך הקצה הפרוקסימלי של האזור המופעל. הוסף החזר השקעה זה, אותו נתייחס אליו כמדריך הפרוקסימלי ROI, למנהל על-ידי הקשה על מקש 't'.
   6. גרור את ההחזר על ההשקעה כדי ליישר עם הקצה הדיסטלי של האזור המופעל והוסף שוב למנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי הקשה על מקש 't'. אנו נתייחס לזה כאל מדריך דיסטל ROI. המדריך הפרוקסימלי והדיסטלי ROIs ישמש מאוחר יותר כדי לצייר את המדידה איגוף ROIs.
   7. בחר אקסונים לכמת, באמצעות רצף התמונה של timelapse שנרכש בשלב 5.11 לעיל. רצף תמונה זה מועיל למטרה זו מכיוון שהוא לוכד את הפלואורסנציה האוטומטית החלשה של האקסונים, וחושף את המורפולוגיה שלהם מחוץ לאזור הפעיל.
      הערה: אקסונים שאינם עומדים בקריטריונים הבאים אינם נכללים בניתוח:
      1. על האקסונים להיות בפוקוס לאורך כל חלונות המדידה.
      2. האקסונים חייבים להיות בטווח של 5° בניצב לקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של אזור ההפעלה.
      3. לאקסון אסור יהיו תמורות בטווח של 5μm מהקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של אזור ההפעלה.
      4. אל תכלול אקסונים המ משנים צורה באופן ניכר במהלך ההדמיה.
      5. אל תכלול אקסונים שנראים לא בריאים כפי שמעיד היעדר אזור דיסקרטי המופעל בתדמית שלאחרההפעלה (איור 2C,למטה), מכיוון שזה מעיד על פיזור מפוזר של הפלואורסצסצנה המופעלת, מה שקורה כאשר האקסון מת.
   8. צפה בתדמית הלבנה בחשיפה ארוכה ממדרגה 5.5 למבנים בעלי שפעת אוטומטית בתוך האקסונים. פלואורסצנס זה נובע מפלווינס בתוך המיטוכונדריה¹⁶. אל תכלול אקסונים מניתוח אם המיטוכונדריה הזומופיעה מעוגלת או מפוצלת (איור 2D, למטה), בניגוד למבנים ליניאריים מורחבים(איור 2D, למעלה), מכיוון שזו אינדיקציה לירידה מטבולית.
   9. באמצעות המדריך הפרוקסימלי והדיסטלי ROIs שנוצר לעיל, לצייר שלוש ROIs מדידה לכל axon להיות מנותח: חלון מרכזי המקיף את האקסון בתוך האזור מופעל 40 μm, ושני חלונות איגוף עם רוחב מוגבל על ידי חלון איגוף 15 μm ROIs וגובה מוגבל על ידי הקוטר של האקסון בגבול אזור ההפעלה. הוסף את כל שלושת האזורים למנהל ההחזר על ההשקעה. עבור אקסונים מעוכבים גליקולית, צייר אזור אחד כי הוא לא יותר מ 5 μm רחב באמצע האזור מופעל, כי אינו משתרע מחוץ לאקסון. עבור פרדיגמת פעימה לברוח, האזור הפעיל הוא רק 5 μm רחב, כך החלון כולו חייב לשמש.
   10. חזור על שלב 8.3.9 עבור כל האקסונים התועדים לקריטריונים של שלבים 8.3.7 ו- 8.3.8.
   11. הגדר מידות פעילות לעוצמת פיקסלים ממוצעת על-ידי לחיצה על נתח | הגדר מידות ובחר באפשרות ערך אפור ממוצע. ודא שלא נבדקו אפשרויות מדידה אחרות.
   12. בחר את כל ROIs בחלון ROI Manager על-ידי בחירת החלון והקשה על 'Ctrl' + 'a'. בחלון מנהל ROI, לחץ על עוד | רב מידה כדי למדוד את עוצמת הפלואורסס העתק את הנתונים מחלון התוצאות בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
   13. הגדר מידות פעילות לאזור על-ידי לחיצה על נתח | הגדר מידות ובחר באפשרות אזור. ודא שלא נבדקו אפשרויות מדידה אחרות.
   14. חזור על שלב 8.3.12. יש צורך להעתיק רק שורה אחת של התוצאות עבור האזור, מכיוון שהזמן אינו משתנה.

9. תיקון פוטובלאך

1. בגיליון האלקטרוני של הנתונים עבור אקסונים מעוכבים גליקוליטיקה, להפחית את הפלואורסציה ממוצעת של מסגרת 1 (מסגרת טרום ההפעלה) מן הפלואורסציה ממוצעת של כל מסגרת החל במסגרת 3 (מסגרת הזמן הראשונה) עבור החזר השקעה נתון. התוצאות הן אמצעי חיסור ברקע.
2. התווה את הנתונים כעלילת פיזור עם מספרי המסגרות כמו האבסיסה. התאם קו מגמה מעריכי לנתונים מכל ROI (לרוב תוכניות הגיליון האלקטרוני יש פונקציה זו) עם משוואה בצורת Ae^-bx. משוואה זו שווה ערך לפונקציית ההתפכה F_t = F₀ * e^-tɣ כאשר F₀ הוא הפלואורסצנציה במסגרת הראשונה של הזמן, ɣ הוא קצב ההלבנה המעריכי, t הוא הזמן, ו- e הוא בסיס הלוגאריתם הטבעי.
3. חזור על שלבים 9.1.1-9.1.2 עבור כל ROIs של כל האקסונים מן העצבים המעוכבים גליקוליטיקה. להערכה המדויקת ביותר של קצב ההתפתלות, השתמשו בלפחות 15 אקסונים בסך הכל מ-5 עצבים נפרדים לפחות. השתמש בממוצע של שיעורי הלבנה אקספוננציאליים (ɣ) מכל האקסונים המעוכבים כדי לתקן את הנתונים הניסיוניים עבור פוטו-בליך. כיול הלבנה חדש חייב להתבצע עבור כל ניסוי או מחקר, מכיוון שצילום-בליח תלוי בהגדרות רכישת התמונה ובכוח הלייזר, שיכולים להשתנות עם הזמן.
4. חזור על שלב 9.1.1 עבור כל אזורי האקסונים התמונה עם תמיסת מלח רגילה (כלומר לא מעוכב גליקולית).
5. חלק כל נקודת נתונים ב- e^-tɣ, תוך שימוש בזמן עבור t ɣ נמצא בשלב 9.1.3. אלה האמצעים פוטובלאך מתוקן.
6. הכפל כל נקודת נתונים לפי האזור כדי שאזור עניין זה ימצא את הפלואורסץ הכולל באזור זה בכל פעם.

תוצאות

איור 3 מציג תמונות מייצגות מניסויים בפעימה והתפשטות פולסים. פרסמנו מספר מחקרים המתארים נתונים שהושגו בשיטת הבריחה מהדופק והשיטות שלנו לניתוח^{נתונים אלה 5,,6,,7,,8,,17}. להלן, אנו מראים כיצד ?...

Discussion

יש לנקוט טיפול בניתוח של ניסויי פעימה-בריחה והתפשטות פולסים, כי יש פוטנציאל משמעותי להקדמה של שגיאה במהלך העיבוד שלאחר העיבוד, בעיקר במהלך תיקון שדה שטוח, יישור תמונה ותיקון אקונומיקה. תיקון שדה שטוח הכרחי כדי לתקן את אי אחידות התאורה, מה שופך לירידה בעוצמה על פני שדה הראייה ממרכז לפריפריה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors