Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

Resumen

Describimos métodos de fotoactivación de fluorescencia para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios periféricos de ratones transgénicos que expresan una proteína neurofilament fotoactivable.

Resumen

Los polímeros de proteína de neurofilamento se mueven a lo largo de los axones en el componente lento del transporte axonal a velocidades medias de 0,35-3,5 mm/día. Hasta hace poco el estudio de este movimiento in situ sólo era posible utilizando el etiquetado de pulsos radioisotópicos, lo que permite el análisis del transporte axonal en nervios enteros con una resolución temporal de días y una resolución espacial de milímetros. Para estudiar el transporte de neurofilamento in situ con mayor resolución temporal y espacial, desarrollamos un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa la proteína de neurofilament M etiquetada con GFP fotoactivable en las neuronas. Aquí describimos los métodos de fuga de pulsos y propagación de pulsos de fluorescencia para analizar el transporte de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios tibiales de estos ratones ex vivo. Los segmentos nerviosos aislados se mantienen en la etapa del microscopio por perfusión con solución salina oxigenada y se visualizan mediante microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio. La luz violeta se utiliza para activar la fluorescencia en una ventana axonal corta. La fluorescencia en las regiones activadas y flanqueantes se analiza a lo largo del tiempo, permitiendo el estudio del transporte de neurofilamento con resolución temporal y espacial en el orden de minutos y micras, respectivamente. El modelado matemático se puede utilizar para extraer parámetros cinéticos del transporte de neurofilamento, incluyendo la velocidad, el sesgo direccional y el comportamiento de pausa de los datos resultantes. Los métodos de escape de pulsos y propagación de pulsos también se pueden adaptar para visualizar el transporte de neurofilamento en otros nervios. Con el desarrollo de ratones transgénicos adicionales, estos métodos también podrían utilizarse para crear imágenes y analizar el transporte axonal de otras proteínas citoesqueléticas y citosólicas en axones.

Introducción

El transporte axonal de neurofilamentos se demostró por primera vez en la década de 1970 mediante el etiquetado de pulsos radioisotópicos^1. Este enfoque ha producido una gran cantidad de información sobre el transporte de neurofilamento in vivo,pero tiene una resolución espacial y temporal relativamente baja, típicamente en el orden de milímetros y días en el mejor^2. Además, el etiquetado por pulsos radioisópicos es un enfoque indirecto que requiere la inyección y el sacrificio de múltiples animales para generar un solo curso de tiempo. Con el descubrimiento de proteínas fluorescentes y los avances en la microscopía de fluorescencia en la década de 1990, posteriormente se hizo posible imaginar el transporte de neurofilamento directamente en las neuronas cultivadas en una escala de tiempo de segundos o minutos y con resolución espacial subcrómetro, lo que ofrece una visión mucho mayor del mecanismo de movimiento³. Estos estudios han revelado que los polímeros de neurofilamento en los axones se mueven rápida e intermitentemente en direcciones anterogradas y retrógradas a lo largo de las vías de los microtúbulos, propulsados por proteínas del motor de microtúbulos. Sin embargo, los neurofilamentos son estructuras limitadas por difracción de sólo 10 nm de diámetro que normalmente están espaciadas aparte de sus vecinos por sólo decenas de nanómetros; por lo tanto, los polímeros sólo pueden ser rastreados en neuronas cultivadas que contienen neurofilamentos escasamente distribuidos para que los polímeros en movimiento puedan ser resueltos de sus vecinos⁴. Por lo tanto, actualmente no es posible rastrear neurofilamentos individuales en axones que contienen abundantes polímeros de neurofilamento, como axones mielinados.

Para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones ricos en neurofilamento utilizando microscopía de fluorescencia, utilizamos un método de fotoactivación de fluorescencia de pulso-escape que desarrollamos para estudiar el comportamiento pausador a largo plazo de los neurofilamentos en las células nerviosas cultivadas^4,,5. Los neurofilamentos etiquetados con una proteína de fusión de neurofilamento fluorescente fotoactivable se activan en un segmento corto de axón, y luego la velocidad de salida de esos filamentos de la región activada se cuantifica midiendo la descomposición de la fluorescencia con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que es un análisis a nivel de población del transporte de neurofilamento que se puede aplicar en una escala de tiempo de minutos u horas sin la necesidad de rastrear el movimiento de polímeros de neurofilamento individuales. Por ejemplo, hemos utilizado este método para analizar la cinética del transporte de neurofilamento en cultivos mielizantes⁶.

Recientemente, describimos el desarrollo de un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa bajos niveles de una proteína de neurofilamento etiquetada con paGFP M (paGFP-NFM) en las neuronas bajo el control del promotor Thy1 específico de la neurona humana⁷. Este ratón permite el análisis del transporte de neurofilamento in situ utilizando microscopía de fluorescencia. En este artículo, describimos los enfoques experimentales para analizar el transporte de neurofilamento en axones mielinados de nervios tibiales de estos ratones utilizando dos enfoques. El primero de estos enfoques es el método de escape de pulsos descrito anteriormente. Este método puede generar información sobre el comportamiento de pausa de los neurofilamentos, pero es ciego a la dirección en la que los filamentos salen de la región activada, y por lo tanto no permite la medición de la direccionalidad de la red y la velocidad de transporte⁸. El segundo de estos enfoques es un nuevo método de propagación de pulsos en el que analizamos no sólo la pérdida de fluorescencia de la región activada, sino también el aumento transitorio de la fluorescencia en dos ventanas de flanqueo a través de las cuales los filamentos fluorescentes se mueven a medida que salen de la región activada tanto en direcciones anterogradas como retrógradas. En ambos enfoques, se pueden obtener parámetros de transporte de neurofilamento como la velocidad media, la direccionalidad de la red y el comportamiento de pausa mediante el análisis matemático y el modelado de los cambios en la fluorescencia en las ventanas de medición. La Figura 3 ilustra estos dos enfoques.

Este protocolo demuestra la disección y preparación del nervio, la activación y la toma de imágenes de la fluorescencia paGFP, y la cuantificación del transporte de neurofilamento a partir de las imágenes adquiridas utilizando el paquete de distribución FIJI de ImageJ⁹. Usamos el nervio tibial porque es largo (varios cm) y no se ramifica; sin embargo, en principio cualquier nervio que exprese paGFP-NFM es apropiado para su uso con esta técnica si puede ser diseccionado y desenvado sin dañar los axones.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.

1. Preparación de la solución salina nerviosa

1. Hacer 100 mL de la solución salina de Breuer¹⁰: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 1.5 mM CaCl₂, 5.6% D-glucose, 23.8 mM NaHCO₃ en agua doble destilada.
2. Burbuja 95% oxígeno/5% dióxido de carbono (carbógeno) a través de la solución salina durante al menos 30 minutos antes de su uso. La solución salina sobrante se puede reutilizar en el plazo de una semana; sin embargo, debe ser reoxigenado antes de cada uso.
3. Vierta la solución salina oxigenada en una jeringa de 60 ml y asegúrese de que quede un aire mínimo en la jeringa.

2. Montaje inicial de la cámara de perfusión nerviosa

1. Conecte la jeringa y el tubo como se muestra en la Figura 1A,colocando el tubo de salida en un matraz de residuos.
2. Coloque la junta exterior en la carcasa de la cámara de perfusión, asegurándose de que los postes de entrada y salida de flujo estén alineados con los orificios de la junta.
3. Coloque la junta interior (silicona, 100 m de espesor) sobre un cubreobjetos circular #1,5 (40 mm de diámetro), suavizando cuidadosamente las arrugas de la junta para asegurar un sellado hermético. Para facilitar el montaje posterior, coloque el cubreobjetos y la junta en una toalla de papel o una toallita de tarea con la junta hacia arriba.

3. Disección y preparación del nervio tibial del ratón

1. Sacrificar al animal por inhalación de dióxido de carbono u otro método aprobado institucionalmente. Iniciar un temporizador cuando el animal deja de movimiento / respiración, ya que los experimentos sólo deben llevarse a cabo dentro de las 3 horas de sacrificio⁷.
2. Rocíe el pelaje con un 70% de etanol y retírelo tanto como sea posible de las piernas y la espalda del animal con una maquinilla de afeitar eléctrica.
3. Usando un par de tijeras de disección grandes, haz una incisión dorsal en la piel cerca del centro de la columna vertebral y continúa el corte alrededor del aspecto ventral del animal. A partir de este corte, refleja lentamente la piel de las piernas tirando suavemente del músculo y cortando la fascia.
4. Coloque el animal en una posición supina en una bandeja de disección y coloque las cuatro patas. Opcionalmente, ancle la cola para reducir aún más el movimiento.
5. Usando tijeras de microdisección, haz una incisión en los músculos del muslo a medio camino entre la cola y la rodilla para exponer el nervio ciático. Asegúrese de que el nervio, que es visible a través del músculo, no se corta.
6. Extienda la incisión dorsal y ventralmente para eliminar el músculo. Del mismo modo, retire los músculos de la pantorrilla, manteniendo los cortes superficiales y cortos para evitar dañar el nervio.
7. Retire los músculos hasta que el nervio tibial esté completamente expuesto desde el punto donde se ramifica desde el nervio ciático (en la rodilla) hasta el talón (Figura 2A).
   NOTA: En todos los pasos, incluyendo y después de la disección del nervio tibial, evite la exposición innecesaria a la luz ambiental para minimizar la posible activación incidental de paGFP en el nervio.
8. Agarra el nervio tibial en el extremo de la columna vertebral-proximal con un par de fórceps y corta el nervio usando un par de tijeras de microdisección. Teniendo cuidado de no poner tensión en el nervio, levantarlo del músculo, cortar cualquier accesorio.
9. Cortar el extremo de la columna vertebral-distal del nervio tibial y transferir a un pequeño plato Petri de solución salina oxigenada a temperatura ambiente. A partir de este punto en el procedimiento, siempre asegúrese de realizar un seguimiento de los extremos proximal y distal del nervio.
   NOTA: Una manera de hacer esto es marcar el extremo distal del nervio con un corte en ángulo de tal manera que el cónico sea visible.
10. A partir del extremo proximal del nervio, agarre suavemente los extremos del axón expuesto con un par de fórceps de punta muy fina.
11. Con un segundo par de fórceps, agarre la vaina nerviosa proximally, y tire lentamente hacia el extremo distal del nervio. La vaina nerviosa se deslizará a lo largo de los axones con una resistencia mínima. Asegúrese de que no se aplica ninguna tensión indebida al nervio durante este proceso.

4. Ensamblaje final de la cámara de perfusión nerviosa

1. Agarrando el extremo proximal del nervio, retíralo de la solución salina y colóquelo lentamente sobre el cubreobjetos de la cámara de perfusión dentro de la abertura rectangular de la junta interior, manteniendo una suave tensión sobre el nervio mientras lo colocas para que quede recto.
2. Coloque el microaqueducto deslizarse sobre el nervio con el lado ranurado hacia el nervio y la dirección del flujo paralelo al nervio. Voltee el conjunto de cubreobjetos y microaqueductos y colóquelo dentro de la carcasa de la cámara de perfusión con la corredera de microaqueducto se coloca en la junta exterior. El nervio y la junta interior circundante ahora se intercalarán entre el cubreobjetos y el portaobjetos de microaqueducto, que están separados por la junta, con el cubreobjetos hacia arriba (Figura 1B).
3. Asegure la cámara de perfusión colocándola en la carcasa metálica y girando el anillo de bloqueo. Asegúrese de que la carcasa de plástico esté completamente debajo de todos los clips metálicos y apriete bien para evitar fugas de solución salina. El apriete excesivo puede romper el portaobjetos del microaquero o el cubreobjetos. Dé la vuelta a la cámara para que el cubreobjetos esté mirando hacia abajo.
4. Presione lentamente el émbolo de la jeringa salina para llenar la cámara de perfusión. Mantenga el tubo de entrada y salida, el matraz de salida y la jeringa elevados por encima de la propia cámara en todo momento durante la configuración y la toma de imágenes. Esto evita el sifón, que puede introducir burbujas o causar inestabilidad de enfoque debido a la presión negativa en la cámara.
5. Transfiera el conjunto de perfusión a una etapa de microscopio invertido y monte la jeringa salina en la bomba de la jeringa. Encienda el motor a una velocidad adecuada para un caudal de 0,25 ml/min. A continuación, conecte y encienda el calentador de solución en línea ajustado a 37 oC.
6. Conecte el calentador objetivo y ajuste a 37 oC, aplique aceite al objetivo e inserte la cámara de perfusión en el soporte de la etapa.
7. Aplique aceite a la almohadilla del calentador de la cámara y adjúntelo a la cámara de perfusión. Conecte y encienda el calentador de la cámara; establecido en 37 oC.
   NOTA: Los cambios de temperatura pueden hacer que se formen burbujas en la cámara de perfusión debido a la desgasificación de la solución. Si se forman burbujas, aumente brevemente el caudal de la solución en 5-10x hasta que las burbujas despejen la cámara.
8. Bloquee la cámara de perfusión en el adaptador de escenario y ponga el aceite objetivo en contacto con el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara.
   NOTA: La cámara Bioptechs con adaptador de etapa ASI utilizado aquí está diseñada para una configuración de microscopio invertido.

5. Activación de la fluorescencia y adquisición de imágenes

1. Usando la iluminación de campo brillante, concéntrese en la capa de axones en la superficie inferior del nervio más cercano a la superficie del cubreobjetos (Figura 2B). Los axones mielinados (normalmente de 1 a 6 m de diámetro en ratones adultos) se pueden identificar por la presencia de una vaina de mielina, que es visible bajo iluminación de luz transmitida por campo brillante sin mejora de contraste. Las hendiduras y los ganglios de Ranvier también son evidentes. Los axones no miinlinados son más delgados (normalmente <1 ám de diámetro) y generalmente están presentes en los paquetes (paquetes Remak), donde generalmente se aplica demasiado para ser resueltos entre sí.
2. Si está disponible en el microscopio, active el sistema de enfoque automático para mantener el enfoque a lo largo del tiempo.
3. Adquiera una imagen de referencia de campo brillante. Registre la orientación del nervio (extremos espinal-proximal y distal) con respecto a las imágenes.
4. Adquiera una imagen confocal utilizando un láser de 488 nm y un filtro de emisión apropiado para paGFP (por ejemplo, 525/50 nm) para registrar la autofluorescencia de pre-lejía. Mantenga la potencia del láser baja para minimizar el fotoblancada, con el tiempo de exposición ajustado en consecuencia para detectar la señal débil. Por ejemplo, se adquirieron datos representativos con un 5% de potencia láser y 4 s de exposición. Registre la configuración de adquisición para su uso en todos los experimentos futuros.
   NOTA: Después de la fotoactivación, los ajustes de imagen ideales producirán una relación señal-ruido > 8 y el fotoblanchado de menos del 25% de la señal original en el transcurso de 20 imágenes. Los axones también se pueden tomar imágenes por microscopía de epifluorescencia de campo ancho como lo hicimos originalmente^7,pero la calidad de imagen será inferior debido a la falta de confocalidad.
5. Ajuste la potencia del láser a aproximadamente 5 veces la potencia de imagen normal y adquiera una imagen con un tiempo de exposición de 3-4 minutos. Aunque no es esencial, este paso se recomienda para blanquear la autofluorescencia y otras fuentes de fluorescencia no deseada con el fin de reducir la señal de fondo y así maximizar la señal-ruido de la fluorescencia fotoactivada.
6. Adquiera una imagen con los ajustes utilizados en el paso 5.4 para registrar la autofluorescencia previa a la activación después de este paso de blanqueo.
7. En la imagen de campo brillante, dibuje una línea paralela a los axones con una longitud igual al tamaño de ventana de activación deseado. La longitud de esta ventana variará dependiendo del objetivo experimental y los parámetros, pero las longitudes típicas son de 5 m para el paradigma de escape de pulsos y de 40 m para el paradigma de propagación de pulsos.
8. Usando esta línea como guía, dibuje una región rectangular de interés (ROI) a través del campo de visión perpendicular a los axones. La región debe abarcar todos los axones que se van a fotoactivar.
9. Determine los ajustes óptimos para la fotoactivación con iluminación de 405 nm.
   NOTA: Realice solo este paso y sub-pasos antes de la primera activación experimental. En el transcurso de un experimento, se deben utilizar los mismos ajustes de fotoactivación.
   1. Active una región de interés repetidamente utilizando la línea láser de 405 nm, baja potencia láser (por ejemplo, 5%) y el tiempo de permanencia de píxeles (por ejemplo, 40 s) y un pulso, adquiriendo una imagen de la fluorescencia GFP activada después de cada activación. Repita hasta que la fluorescencia ya no aumente y, a continuación, cuantifique la fluorescencia en una región de interés para cada imagen.
   2. Trazar las intensidades medias de fluorescencia frente al número de pulso. Seleccione el número de pulsos después de los cuales la fluorescencia ya no aumenta como el número óptimo de pulsos para la activación.
10. Active la fluorescencia paGFP de la región dibujada en el paso 5.8 por excitación modelada con luz de 405 nm. Asegúrese de que una imagen se adquiere justo antes y justo después de la activación.
    NOTA: La activación paGFP ideal producirá una región claramente definida de fluorescencia con límites nítidos contenidos dentro del ROI.
11. Inicie un temporizador de 1 minuto a medida que finalice la activación. Al final de 1 minuto, comience la adquisición de una serie timelapse.
    NOTA: El retardo de 1 minuto es necesario para permitir el aumento de la fluorescencia que se observa después de la fotoactivación de paGFP¹¹. Para el método de propagación de pulsos, un período de adquisición de 5-10 minutos con intervalos de tiempo de 30 segundos es suficiente para la medición de los taludes iniciales en las ventanas centrales y flanqueantes para medir la velocidad y la direccionalidad. Para el método de escape de pulsos, un período de adquisición de 30-150 minutos con intervalos de timelapse de 5 o 10 minutos permite analizar el comportamiento de pausa a largo plazo de los filamentos
12. Guarde todas las imágenes adquiridas, así como el ROI utilizado para la activación de la fluorescencia.
13. Muévete a una nueva región del nervio y repite los pasos 5.1-5.11. Si la nueva región se encuentra a lo largo del mismo axón, debe ser de al menos 500 m de la región previamente activada para evitar la detección de neurofilamentos fluorescentes que se movieron fuera de la otra región activada. La adquisición del timelapse final debe finalizar antes del final de la ventana de 3 horas.
    NOTA: Es posible que la preparación sea viable durante más de 3 horas, pero no lo hemos confirmado. Con una disección y preparación competentes, se pueden adquirir conjuntos de imágenes de tiempo de entre cinco y ocho minutos dentro de esta ventana de 3 horas.
14. Después de adquirir la serie de imágenes de timelapse final, detenga el flujo de solución salina, desconecte la solución y los calentadores de cámara, y retire el aparato de perfusión de la etapa del microscopio.

6. Adquisición de imágenes de Flatfield y darkfield

1. Hacer una solución de fluoresceína añadiendo 250 mg de polvo de fluoresceína a 0,5 ml de agua destilada doble. Mezclar hasta que no haya partículas visibles y girar la solución durante 30 segundos en una centrífuga de sobremesa para sedimentar cualquier material no disuelto. Esta solución se puede almacenar durante varios meses a 4 oC si está protegida contra la exposición a la luz.
2. Añadir 8 l de solución de fluoresceína a una diapositiva y aplicar un cubreobjetos #1,5. Borre el exceso de líquido, selle con esmalte de uñas y deje secar.
   NOTA: A esta alta concentración, la fuerte absorción del tinte de fluoresceína extingue el haz iluminador dentro de la solución, produciendo un plano delgado de fluorescencia en la superficie del cubreobjetos que es uniforme y resistente al fotoblanqueo debido al rápido intercambio difusor¹².
3. Coloque la cubierta de la corredera de fluoresceína hacia abajo en la etapa del microscopio invertido y ajuste el enfoque en el plano delgado de fluorescencia en la superficie del cubreobjetos. Muévete por la diapositiva para encontrar un campo de visión que no contenga burbujas de aire (manchas oscuras) o partículas de fluoresceína grandes (puntos brillantes).
4. Adquiera una pila z que abarque 6 m a intervalos de 0,2 m de modo que la imagen central sea el plano de enfoque original. Utilice un tiempo de exposición corto (por ejemplo, 40 ms) porque la fluorescencia será muy brillante. Esta adquisición de la pila z es necesaria para capturar la fluorescencia máxima a través del campo de visión, ya que el cubreobjetos rara vez es perfectamente horizontal y el plano de fluorescencia de fluoresceína es muy estrecho. Repita esto para un total de 25 campos de visión, moviendo la etapa por al menos 20 m en cualquier dirección entre campos.
5. Cierre todas las persianas de trayectoria de luz, incluido el obturador de la cámara, y ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición a cero. Adquiera una pila de 100 imágenes con estos ajustes. Estas imágenes se promediarán para generar la imagen de campo oscuro, que se utilizará para corregir la corriente oscura y el desplazamiento de polarización en el chip de la cámara.
   NOTA: La adquisición de streaming es una forma ideal de capturar estas imágenes.

7. Nervios inhibidos glicóticamente por imágenes para la corrección de lejía

1. Hacer y oxigenar una solución salina como en el paso 1; sin embargo sustituir 2-deoxy-D-glucose para D-glucosa y añadir 0.5 mM de yodoacetato sódico para inhibir la glucólisis¹³. Nos referimos a esto como "solución salina inhibitorio".
2. Repita los pasos 2-5 utilizando la solución salina inhibitora, con una imagen timelapse de 10-30 minutos establecida en el paso 5.11. Permita 40-50 minutos después de la aplicación de solución salina inhibitoria antes de la toma de imágenes para asegurar la inhibición completa del transporte del neurofilamento.
   NOTA: La inhibición glicéptica eventualmente matará a los axones por lo que hay una ventana estrecha de tiempo después de la inhibición en la que adquirir datos, por lo general unos 30 minutos. Un indicador del nivel de inhibición metabólica es la autofluorescencia flavina de las mitocondrias axonales, que se pueden detectar en la serie timelapse debido a las exposiciones largas que utilizamos para tomar imágenes de la fluorescencia paGFP¹⁴. Por lo general, la autofluorescencia mitocondrial aumentará durante el tratamiento con solución salina inhibitoria. Si las mitocondrias comienzan a redondear hacia arriba o fragmentarse, entonces deje de tomar imágenes.

8. Procesamiento y análisis de imágenes utilizando ImageJ

1. Corrección de Flatfield y darkfield
   1. Abra la pila de imágenes de campo oscuro y promediar las imágenes haciendo clic en Imagen . Pilas ? Z Proyecto y seleccionando Intensidad media en el menú desplegable para generar la imagen de campo oscuro.
   2. Abra las pilas de imágenes de campo plano de fluoresceína y cree una proyección de intensidad máxima de cada una (25 en total) haciendo clic en Imagen . Pilas ? Z Proyecto y selección de Intensidad máxima en el menú desplegable.
   3. Combine las 25 imágenes de proyección máxima resultantes en una pila haciendo clic en Imagen . Pilas ? Imágenes para apilar. Cree una proyección de intensidad media de esta pila haciendo clic en Imagen Pilas ? Z Proyecto y seleccionando Intensidad media en el menú desplegable para generar la imagen de campo plano.
   4. Restar la imagen de campo oscuro de la imagen de campo plano haciendo clic en Procesar . Calculadora de imágenes, seleccionando Restar como operación. Asegúrese de que la opción de resultado de 32 bits (flotante) esté marcada. El resultado es la imagen de campo plano corregida.
   5. Mida la intensidad media de píxeles de la imagen de campo plano corregida haciendo clic primero en Analizar . Establezca Mediciones y marcando la casilla Valor gris medio y, a continuación, presione la tecla 'm'.
   6. Divida la imagen de campo plano corregida por su intensidad media haciendo clic en Procesar . Matemáticas ? Divida e introduzca el valor gris promedio obtenido en el paso 7.1.5. Esto producirá la imagen de ganancia inversa.
   7. Abra las imágenes de pre-activación y post-activación junto con la pila de imágenes timelapse. Combine las imágenes en una sola pila haciendo clic en Imagen . Pilas ? Herramientas ? Concateney seleccione las imágenes en orden cronológico en los menús desplegables. Asegúrese de que la opción Abrir como imagen 4D no esté seleccionada. La pila resultante es el conjunto de imágenes completo.
   8. Repita el paso 8.1.4 en el conjunto de imágenes completoy, a continuación, divida el resultado por la imagen de ganancia inversa haciendo clic en Procesar . Calculadora de imágenes y seleccionando Dividir como operación. Esto producirá el conjunto de imágenes completo corregido,en el que cada imagen se ha corregido para la no uniformidad en el campo de la iluminación y en el detector.
2. Alineación de la pila de imágenes
   1. Para corregir la desalineación de los planos de imagen en la serie timelapse debido a la deriva de etapa o muestra, instale el complemento Alineación por región fija (Archivo Suplementario 1) haciendo clic en Plugins . Instale PlugIn, navegando a la carpeta que contiene el archivo del plugin y seleccionando el plugin. Reinicie ImageJ después de instalar el plugin.
      NOTA: Este plugin alinea las imágenes en función del principio^{15 de}"congealing de mínimos cuadrados".
   2. Dibuje un ROI en el conjunto de imágenes completo corregido que abarca varios axones y no se extiende más allá de los límites proximal y distal de la fluorescencia activada dentro de cada uno de los axones. La geometría de la región no es importante, sin embargo, excluir las áreas en las que las estructuras cambian de forma o tamaño mejorará la alineación.
   3. Ejecute el complemento de alineación haciendo clic en Plugins (Plugins) Alineación por región fija. El plugin coloca un máximo predeterminado de 2 píxeles en el desplazamiento entre fotogramas, sin embargo, esto se puede ajustar en la ventana emergente inicial si hay una deriva significativa de la muestra. La alineación puede tardar varios minutos, dependiendo del tamaño de la pila de imágenes.
   4. Inspeccione visualmente la pila alineada para evaluar la calidad de la alineación. Es posible que algunos fotogramas deba alinearse manualmente, ya que la alineación automatizada puede no funcionar bien para grandes fluctuaciones en la fluorescencia entre fotogramas. Esto se puede lograr mientras se visualiza un marco que se debe cambiar haciendo clic en Imagen Transformar (Transform) Traducir. Haga clic en No en la siguiente ventana emergente preguntando si se debe traducir toda la pila. Utilice solo valores de píxeles enteros en la traducción y asegúrese de que el menú de interpolación desplegable esté establecido en Ninguno, ya que los cambios de píxel fraccionarios o la interpolación alterarán los datos debido al remuestreo de las intensidades de píxeles.
   5. Guarde esto como el conjunto de imágenes completos alineado.
3. Medición de las intensidades de fluorescencia
   1. Dibuje un ROI utilizando la herramienta Angulo en el primer fotograma del conjunto de imágenes completos alineado con el primer brazo a lo largo de un borde de la región activada, perpendicular a los axones, y el segundo brazo vertical. Pulse la tecla 'm' para medir el ángulo, que describe la orientación de los axones en el campo de visión.
   2. Establezca la escala de las imágenes para que las dimensiones se miden en micras haciendo clic en Analizar . Establezca Escala e introduzca los valores adecuados.
   3. Abra el gestor de ROI haciendo clic en Analizar . Herramientas ? ROI Manager. Para el paradigma de escape de pulsos, vaya al paso 8.3.7. Para la propagación de pulsos, continúe con el paso 8.3.4.
   4. Dibuje un ROI cuadrado de cualquier dimensione y, a continuación, haga clic en Editar . Selección de la selección de la selección de Especifique. Asegúrese de que la opción Unidades escaladas units esté activada y, a continuación, establezca el ROI en un ancho de 15 m y una altura igual o superior a la altura de la imagen.
   5. Gire el ROI por el ángulo medido en el paso 8.3.1 haciendo clic en Editar . Selección de la selección de la selección de Gire para hacerlo perpendicular a los axones y coloque el ROI con un lado a lo largo del borde proximal de la región activada. Añada este ROI, al que nos referiremos como el ROI de guía proximal, al gerente pulsando la tecla 't'.
   6. Arrastre el ROI para alinearlo con el borde distal de la región activada y agréguelo de nuevo al gestor de ROI pulsando la tecla 't'. Nos referiremos a esto como el ROI de la guía distal. Los ROI guías proximales y distales se utilizarán más adelante para dibujar los ROI de medición de flanqueo.
   7. Seleccione axones para la cuantificación, utilizando la secuencia de imágenes timelapse adquirida en el paso 5.11 anterior. Esta secuencia de imágenes es útil para este propósito porque captura la autofluorescencia débil de los axones, revelando su morfología fuera de la región activada.
      NOTA: Los axones que no cumplen los siguientes criterios se excluyen del análisis:
      1. Los axones deben estar enfocados a lo largo de toda la longitud de todas las ventanas de medición.
      2. Los axones deben estar dentro de 5o de perpendicular a los extremos proximal y distal de la región de activación.
      3. Los axones no deben tener invaginaciones dentro de los 5 m de los extremos proximal y distal de la región de activación.
      4. Excluir los axones que cambian de forma visiblemente durante el transcurso de la toma de imágenes.
      5. Excluir los axones que parezcan insalubres como lo demuestra la ausencia de una región activada discreta en la imagen posterior a la activación(Figura 2C, parte inferior), ya que esto es indicativo de la dispersión difusa de la fluorescencia activada, lo que sucede cuando el axón muere.
   8. Observe la imagen de blanqueo de larga exposición del paso 5.5 para las estructuras autofluorescentes dentro de los axones. Esta fluorescencia se debe a flavinas dentro de las mitocondrias¹⁶. Excluya los axones del análisis si estas mitocondrias aparecen redondeadas o fragmentadas(Figura 2D, inferior), a diferencia de las estructuras lineales extendidas(Figura 2D, superior), ya que esto es una indicación de deterioro metabólico.
   9. Usando los ROI guías proximales y distales creados anteriormente, dibuje tres ROI de medición por axón que se está analizando: una ventana central que abarque el axón dentro de la región activada de 40 m, y dos ventanas de flanqueo con anchura restringida por GARdi de 15 m de ventana y altura restringida por el diámetro del axón en el borde de la región de activación. Agregue las tres regiones al administrador de ROI. Para los axones inhibidos glicóticamente, dibuje una sola región que no tenga más de 5 m de ancho en el centro de la región activada y que no se extienda fuera del axón. Para el paradigma de escape de pulsos, la región activada es de solo 5 m de ancho, por lo que se debe utilizar toda la ventana.
   10. Repita el paso 8.3.9 para todos los axones que cumplan los criterios de los pasos 8.3.7 y 8.3.8.
   11. Establezca las mediciones activas en intensidad media de píxeles haciendo clic en Analizar . Establezca Mediciones y seleccione la opción Valor gris medio. Asegúrese de que no se comprueba ninguna otra opción de medición.
   12. Seleccione todos los ROI en la ventana de ROI Manager seleccionando la ventana y pulsando 'Ctrl' + 'a'. En la ventana Administrador de ROI, haga clic en Más Multi Medida para medir las intensidades de fluorescencia. Copie los datos de la ventana de resultados en una hoja de cálculo para su posterior análisis.
   13. Establezca las mediciones activas en el área de la región haciendo clic en Analizar . Establezca Mediciones y seleccione la opción Area. Asegúrese de que no se comprueba ninguna otra opción de medición.
   14. Repita el paso 8.3.12. Sólo es necesario copiar una fila de los resultados para el área, ya que el área no varía con el tiempo.

9. Corrección de Photobleach

1. En la hoja de cálculo de datos para axones inhibidos glicóticamente, reste la fluorescencia media del fotograma 1 (el marco de pre-activación) de la fluorescencia media de cada fotograma a partir del fotograma 3 (el primer marco de timelapse) para un ROI dado. Los resultados son las medias restadas en segundo plano.
2. Trazar los datos como una gráfica de dispersión con los números de fotograma como abscisa. Ajustar una línea de tendencia exponencial a los datos de cada ROI (la mayoría de los programas de hoja de cálculo tienen esta función) con una ecuación en forma de Ae^-bx. Esta ecuación es equivalente a la función de fotoblanqueo F_t - F₀ * e^-tɣ donde F₀ es la fluorescencia en el primer fotograma del timelapse, ɣ es la tasa de blanqueo exponencial, t es el tiempo, y e es la base del logaritmo natural.
3. Repita los pasos 9.1.1-9.1.2 para todos los ROI de todos los axones de los nervios inhibidos glicóticamente. Para la estimación más precisa de la tasa de fotoblanqueo, utilice al menos 15 axones en total de al menos 5 nervios separados. Utilice el promedio de las tasas de blanqueo exponencial (ɣ) de todos los axones inhibidos para corregir los datos experimentales de fotoblancada. Se debe realizar una nueva calibración de blanqueo para cada experimento o estudio, ya que el fotoblanchado depende de la configuración de adquisición de imágenes y de la potencia láser, que puede cambiar con el tiempo.
4. Repita el paso 9.1.1 para todas las regiones de axones con solución salina normal (es decir, no inhibidas glicóticamente).
5. Divida cada punto de datos por e^-tɣ, utilizando el tiempo para t y el promedio ɣ encuentra en el paso 9.1.3. Estos son los medios corregidos por fotobleach.
6. Multiplique cada punto de datos por el área de esa región de interés para encontrar la fluorescencia total en esa región en cada momento.

Resultados

La Figura 3 muestra imágenes representativas de experimentos de escape de pulsos y de propagación de pulsos. Hemos publicado varios estudios que describen los datos obtenidos utilizando el método de escape de pulsos y nuestros métodos para el análisis de esos datos^5,6,7,8,17. A continuación, mostramos cómo los datos de prop...

Discusión

Se debe tener cuidado en el análisis de los experimentos de fuga de pulsos y propagación de pulsos porque existe un potencial significativo para la introducción de errores durante el postprocesamiento, principalmente durante la corrección de campo plano, la alineación de la imagen y la corrección del lejía. La corrección de campo plano es necesaria para corregir la no uniformidad en la iluminación, lo que resulta en una caída de intensidad en todo el campo de visión desde el centro hasta la periferia. El grado...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors