Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Özet

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Özet

Nörofilament protein polimerleri aksonal taşımanın yavaş bileşeninde aksonlar boyunca ~0.35-3.5 mm/gün ortalama hızlarda hareket eder. Yakın zamana kadar yerinde bu hareketin çalışma sadece radyoizotopik darbe etiketleme kullanarak mümkün oldu, hangi gün bir zamansal çözünürlük ve milimetre bir mekansal çözünürlük ile tüm sinirlerde aksonal taşıma analizi sağlar. Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile yerinde nörofilament taşıma çalışma için, nörofilament protein M nöroniklerde fotoaktivabl GFP ile etiketlenmiş ifade eden bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare geliştirdi. Burada floresan fotoaktivasyon darbe kaçış ve nabız-spread yöntemleri bu fareler ex vivotibial sinirlerin tek miyelinli akson nörofilament taşıma analiz etmek için açıklar. İzole sinir segmentleri oksijenli salin ile perfüzyon ile mikroskop aşamasında korunur ve dönen disk konfokal floresan mikroskop mikroskopile görüntülenir. Mor ışık kısa bir aksonal pencerede floresan etkinleştirmek için kullanılır. Aktive ve yan bölgelerdefloresan zaman içinde analiz edilir, dakika ve mikron sırasına göre zamansal ve mekansal çözünürlük ile nörofilament taşıma çalışma izin, sırasıyla. Matematiksel modelleme hız, yön önyargı ve ortaya çıkan verilerden duraklama davranışı da dahil olmak üzere nörofilament taşıma kinetik parametreleri ayıklamak için kullanılabilir. Nabız kaçış ve nabız yayma yöntemleri de diğer sinirlerde nörofilament taşıma görselleştirmek için adapte edilebilir. Ek transgenik farelerin geliştirilmesi ile, bu yöntemler de görüntü ve akson diğer sitoskelet ve sitosolik proteinlerin aksonal taşıma analiz etmek için kullanılabilir.

Giriş

Nörofilamentlerin aksonal nakli ilk kez 1970'lerde radyoizotopik nabız etiketleme¹ile gösterilmiştir. Bu yaklaşım in vivonörofilament taşıma hakkında bilgi zenginliği vermiştir , ama nispeten düşük uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir, genellikle milimetre ve gün sırasına göre en iyi². Ayrıca, radyoizotopik darbe etiketleme enjeksiyon ve tek bir zaman ders oluşturmak için birden fazla hayvan kurban gerektiren dolaylı bir yaklaşımdır. 1990'larda floresan proteinlerin keşfi ve floresan mikroskopi deki gelişmelerle, daha sonra nörofilament naklini doğrudan kültürlü nöronlarda saniye veya dakika lık bir zaman ölçeğinde ve mikrometre altı uzamsal çözünürlükte görüntülemek mümkün hale geldi ve hareket^{mekanizmasına}çok daha fazla fikir kazandırdı 3 . Bu çalışmalar, aksonların nörofilament polimerlerinin mikrotübül motor proteinleri tarafından itilen mikrotübül parçaları boyunca hem anterograd hem de retrograd yönlerde hızlı ve aralıklı olarak hareket ettiğini ortaya koymuştur. Ancak, nörofilamentler genellikle nanometre sadece onlarca tarafından komşularından ayrı aralıklı olan çapı sadece 10 nm kırınım sınırlı yapılardır; bu nedenle, polimerler sadece hareket eden polimerler komşularından çözülebilir böylece seyrek dağıtılmış nörofilamentler içeren kültürlü nöronlar izlenebilir⁴. Bu nedenle, miyelinatlı aksongibi bol nörofilament polimerler içeren aksonlarda tek nörofilamentleri takip etmek günümüzde mümkün değildir.

Floresan mikroskopisi kullanarak nörofilament açısından zengin aksonların nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için, kültürlü sinir hücrelerindeki nörofilamentlerin uzun süreli duraklama davranışını incelemek için geliştirdiğimiz floresan fotoaktivasyon darbe kaçış yöntemini kullanıyoruz^4,5. Fotoaktibl floresan nörofilament füzyon proteini ile etiketlenen nörofilamentler akson kısa bir segmentte aktive edilir, ve daha sonra aktive bölgeden bu filamentlerin ayrılma oranı zaman içinde floresan çürüme ölçülerek ölçülür. Bu yaklaşımın avantajı, tek tek nörofilament polimerlerin hareketini izlemek için gerek kalmadan dakika veya saat bir zaman ölçeğinde uygulanabilir nörofilament taşıma bir nüfus düzeyinde analizi olmasıdır. Örneğin, miyelinating kültürlerde nörofilament transport kinetik analiz etmek için bu yöntemi kullandık⁶.

Son zamanlarda, insan nöron spesifik Thy1 organizatörü kontrolü altında nöronlarda bir paGFP etiketli nörofilament protein M (paGFP-NFM) düşük seviyelerde ifade bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare gelişimini anlattı⁷. Bu fare floresan mikroskopisi kullanarak yerinde nörofilament taşıma analizine izin verir. Bu makalede, bu farelerden gelen tibial sinirlerin miyelinli aksonları nörofilament naklini analiz etmek için deneysel yaklaşımları iki yaklaşım la açıklıyoruz. Bu yaklaşımlardan ilki yukarıda açıklanan darbe kaçış yöntemidir. Bu yöntem nörofilamentlerin duraklama davranışı hakkında bilgi üretebilir, ancak filamentlerin aktive edilen bölgeden ayrıldığı yöne kördür ve bu nedenle net yön ve taşıma hızının ölçülmesine izin vermez⁸. Bu yaklaşımların ikincisi, sadece aktive bölgeden gelen floresan kaybını değil, aynı zamanda floresan filamentlerin aktive edilen bölgeden hem anterograd hem de retrograd yönlerde hareket ettikleri iki yan penceredeki floresan geçici artışı da analiz ettiğimiz yeni bir nabız yayma yöntemidir. Her iki yaklaşımda da ortalama hız, net yönlülük ve duraklama davranışı gibi nörofilament taşıma parametreleri matematiksel analiz ve ölçüm pencerelerinde floresan değişikliklerin modelalınması ile elde edilebilir. Şekil 3 bu iki yaklaşımı göstermektedir.

Bu protokol, imageJ^9'unFIJI dağıtım paketini kullanarak elde edilen görüntülerden sinirin diseksiyonunu ve hazırlanmasını, paGFP floresansının aktivasyonu ve görüntülenmesi ve nörofilament taşınmasının niceliğini göstermektedir. Kaval siniri uzun (birkaç cm) olduğu ve dallanmadığı için kullanıyoruz; ancak, ilke olarak paGFP-NFM ifade eden herhangi bir sinir aksonlar zarar vermeden diseksiyon ve de-sheathed olabilir eğer bu teknik ile kullanmak için uygundur.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Sinir saline çözeltisinin hazırlanması

1. Breuer'in tuzlu^{10 10}mL'sini yapın : 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 1,5 mM CaCl₂, %5.6 D-glukoz, 23.8 mM NaHCO₃ çift distile suda.
2. Kabarcık 95% oksijen / 5% karbondioksit (carbogen) kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca tuzlu çözelti ile. Artık tuzlu bir hafta içinde yeniden kullanılabilir; ancak, her kullanımdan önce reoxygenated olmalıdır.
3. Oksijenli tuzlu eti 60 mL'lik şırınganın içine dökün ve şırıngada minimum hava kaldığından emin olun.

2. Sinir perfüzyon odasının ilk montajı

1. Şırıngayı ve tüpü Şekil 1A'dagösterildiği gibi bağlayın ve çıkış tüpünü bir atık şişesine yerleştirin.
2. Dış contayı perfüzyon odası gövdesine yerleştirin, akış giriş ve çıkış direklerinin contadaki deliklerle hizalanmasını sağlar.
3. İç contayı (silikon, 100 μm kalınlığında) #1,5 dairesel bir kapak fişinin üzerine (40 mm çapında) koyarak contadaki kırışıklıkları dikkatlice düzelterek sıkı bir conta sağlayın. Daha sonra montaj kolaylaştırmak için, bir kağıt havlu veya görev mendil üzerinde conta yukarı bakacak şekilde kapak ve conta yerleştirin.

3. Diseksiyon ve fare tibial sinir hazırlanması

1. Karbondioksit teneffüs veya başka bir kurumsal onaylı yöntem ile hayvan Kurban. Hayvan hareket / nefes durur zaman bir zamanlayıcı başlatın, deneyler sadece kurban 3 saat içinde yapılmalıdır⁷.
2. % 70 etanol ile kürk sprey ve bir elektrikli jilet kullanarak hayvanın bacakları ndan mümkün olduğunca çıkarmak ve geri.
3. Büyük diseksiyon makas bir çift kullanarak, omurganın ortasına yakın deride bir dorsal kesi yapmak ve hayvanın ventral yönü etrafında kesim devam. Bu kesimbaş, yavaş yavaş yavaşça kas uzak çekerek ve fasya keserek bacaklardan deri yansıtın.
4. Bir diseksiyon tepsisi üzerinde bir supine pozisyonda hayvan yerleştirin ve dört pençeleri pin. İsteğe bağlı olarak daha fazla hareketi azaltmak için kuyruk pin.
5. Mikrodiseksiyon makas kullanarak, siyatik sinir ortaya çıkarmak için kuyruk ve diz arasında orta uyluk kasları bir kesi yapmak. Kas yoluyla görülebilen sinirin kesilmediğinden emin olun.
6. Kas kaldırmak için kesi dorsally ve ventrally genişletin. Benzer şekilde, buzağı kasları kaldırmak, sinir zarar önlemek için kesikler sığ ve kısa tutmak.
7. Tibial sinir tamamen siyatik sinir dalları noktadan kadar kasları çıkarın (dizde) topuk(Şekil 2A).
   NOT: Tibial sinirin diseksiyonu da dahil olmak üzere ve aşağıdaki tüm adımlarda, sinirpaGFP olası tesadüfi aktivasyonu en aza indirmek için ortam ışığına gereksiz maruz kalmaktan kaçının.
8. Bir çift forceps ile omurga-proksimal ucunda tibial sinir kavramak ve mikrodiseksiyon makas bir çift kullanarak sinir kesti. Sinir üzerinde gerginlik koymak değil dikkat, kas uzak kaldırın, herhangi bir ekleri kesme.
9. Tibial sinirin omurga-distal ucunu kesin ve oda sıcaklığında oksijenli salin küçük bir Petri kabına transfer. Prosedürde bu noktadan itibaren, her zaman sinirproksimal ve distal biter takip etmek emin olun.
   NOT: Bunu yapmanın bir yolu, konik görünür gibi açılı bir kesim ile sinirdistal ucunu işaretlemektir.
10. Sinirproksimal ucundan başlayarak, yavaşça çok ince uçlu büşre bir çift ile maruz akson biter kavramak.
11. Forceps ikinci bir çift ile, proksimally sinir kılıfı kavramak, ve yavaş yavaş sinir distal sonuna doğru çekin. Sinir kılıfı en az direnç ile akson boyunca slayt olacaktır. Bu işlem sırasında sinire gereksiz gerginlik uygulanmadığından emin olun.

4. Son sinir perfüzyon odası montajı

1. Sinirin proksimal ucunu kavrayarak, tuzlu dan çıkarın ve yavaş yavaş iç conta dikdörtgen açılış içinde perfüzyon odasının coverslip üzerine yatıyordu, düz yatıyor böylece sinir üzerinde hafif gerginlik koruyarak.
2. Mikroakemer slaytı sinirin üzerinde, sinirlere bakan oluklu tarafı ve sinire paralel akış yönü ile yerleştirin. Kapak ve mikroakemer tertibatını ters çevirin ve dış contaya yerleştirilen mikroakemer kaydırağı ile perfüzyon odası gövdesine yerleştirin. Sinir ve çevreleyen iç conta şimdi coverslip ve conta ile ayrılır mikroakemer slayt arasında sıkışmış olacak, coverslip yukarı bakacak şekilde(Şekil 1B).
3. Perfüzyon haznesini metal gövdeye yerleştirerek ve kilitleme halkasını döndürerek sabitleyin. Plastik gövdenin tüm metal klipslerin tamamen altında olduğundan emin olun ve tuzlu su sızıntısını önlemek için iyice sıkın. Aşırı sıkma mikroakemer slayt veya coverslip çatlamak olabilir. Odayı ters çevirin ki kapak kayması aşağı bakacak şekilde.
4. Perfüzyon odasını doldurmak için tuzlu şırınga pistonuna yavaşça bastırın. Kurulum ve görüntüleme sırasında giriş ve çıkış borusu, çıkış şişesi ve şırıngayı her zaman odanın üzerinde tutun. Bu, kabarcıklar tanıtmak veya odasında negatif basınç nedeniyle odak istikrarsızlık neden sifon önler.
5. Perfüzyon tertibatını ters bir mikroskop aşamasına aktarın ve tuzlu şırıngayı şırınga pompasına monte edin. 0,25 mL/dk akış hızı için motoru uygun bir hızda çalıştırın. Ardından 37 °C'ye ayarlanmış sıralı solüsyon ısıtıcıyı bağlayın ve açın.
6. Nesnel ısıtıcıyı bağlayın ve 37 °C'ye ayarlayın, hedefe yağ uygulayın ve perfüzyon odasını sahne montajına takın.
7. Oda ısıtıcı pedyağı uygulayın ve perfüzyon odasına takın. Oda ısıtıcısını bağlayın ve açın; 37 °C olarak ayarlanır.
   NOT: Sıcaklıktaki değişiklikler çözeltinin gaz dan sıcağa bağlı olarak perfüzyon odasında kabarcıkların oluşmasına neden olabilir. Kabarcıklar oluşursa, kabarcıklar oda temizleyin kadar kısaca 5-10x tarafından çözelti akış hızını artırmak.
8. Perfüzyon odasını sahne adaptörüne kilitleyin ve nesnel yağı odanın alt tarafındaki kapak kaymasıyla temas ettirin.
   NOT: Burada kullanılan ASI stage adaptörü ile Bioptechs odası ters mikroskop yapılandırması için tasarlanmıştır.

5. Floresan aktivasyonu ve görüntü edinimi

1. Parlak alan aydınlatması kullanarak, kapak yüzeyine en yakın sinirin alt yüzeyindeki akson tabakasına odaklanın(Şekil 2B). Miyeline aksonlar (genellikle yetişkin farelerde çapı 1 -6 μm) kontrast geliştirme olmadan brightfield iletilmiş ışık aydınlatması altında görülebilir bir miyelin kılıf varlığı ile tespit edilebilir. Schmidt-Lanterman yarıkları ve Ranvier düğümleri de kolayca belirgindir. Miyelinated aksonlar daha incedir (genellikle <1 μm çapında) ve genellikle demetler halinde (Remak demetleri) bulunurlar ve genellikle birbirlerinden çözülemeyecek kadar yakın dırlar.
2. Mikroskopta varsa, zaman atlamalı görüntüleme boyunca odaklanmayı sürdürmek için otomatik odaklama sistemini etkinleştirin.
3. Brightfield referans görüntüsü elde edin. Sinirin yönünü (omurga-proksimal ve distal uçlar) görüntülerle ilgili olarak kaydedin.
4. Çamaşır suyu öncesi otofloresansı kaydetmek için 488 nm lazer ve paGFP 'ya (örn. 525/50 nm) uygun bir emisyon filtresi kullanarak bir konfokal görüntü edinin. Fotobeyaztasyonen aza indirmek için lazer gücünü düşük tutun, pozlama süresi soluk sinyali algılamak için buna göre ayarlanır. Örnek olarak, temsili veriler %5 lazer gücü ve 4 s pozlama ile elde edildi. Gelecekteki tüm denemelerde kullanılmak üzere edinme ayarlarını kaydedin.
   NOT: Fotoaktivasyondan sonra ideal görüntüleme ayarları bir sinyal-gürültü oranı > 8 ve 20 görüntü boyunca orijinal sinyalin %25'inden daha azını fotobeyaztlama sağlayacaktır. Aksonlar da biz başlangıçta⁷yaptığı gibi geniş alan epifloresan mikroskopisi ile görüntülenebilir , ama görüntü kalitesi konfokalitif eksikliği nedeniyle düşük olacaktır.
5. Lazer gücünü yaklaşık 5 kat normal görüntüleme gücüne ayarlayın ve 3-4 dakikalık pozlama süresine sahip bir görüntü elde edin. Gerekli olmasa da, bu adım arka plan sinyalini azaltmak ve böylece fotoaktik floresan sinyal-gürültü maksimize etmek için otofloresan ve istenmeyen floresan diğer kaynakları ağartmak için tavsiye edilir.
6. Bu ağartma adımından sonra etkinleştirme öncesi otomatik floresans kaydetmek için adım 5.4'te kullanılan ayarlarla bir görüntü edinin.
7. Brightfield görüntüsünde, aksonlarla paralel, istenilen etkinleştirme penceresi boyutuna eşit uzunlukta bir çizgi çizin. Bu pencerenin uzunluğu deneysel hedefe ve parametrelere bağlı olarak değişir, ancak tipik uzunlukları darbe kaçış paradigması için 5 μm ve darbe yayılımı için 40 m'dir.
8. Bu satırı kılavuz olarak kullanarak, aksonları dik görüş alanına dikdörtgen bir ilgi alanı (ROI) çizin. Bölge fotoaktif olması için tüm aksonları kapsamalıdır.
9. 405 nm aydınlatma ile fotoaktivasyon için en uygun ayarları belirleyin.
   NOT: Yalnızca bu adımı ve ilk deneysel etkinleştirmeden önce alt adımları gerçekleştirin. Deneme boyunca aynı fotoaktivasyon ayarları kullanılmalıdır.
   1. 405 nm lazer hattı, düşük lazer gücü (örn. %5) ve piksel çalışma süresi (örn. 40 μs) ve bir darbe kullanarak tekrar tekrar ilgi çekici bir bölgeyi etkinleştirin ve her aktivasyondan sonra aktif GFP floresanının görüntüsünü elde edin. Floresan artmadan tekrarlayın ve her görüntü için ilgi çekici bir bölgede floresan miktarını ölçün.
   2. Ortalama floresan yoğunluklarını nabız sayısına karşı çizin. Aktivasyon için en uygun darbe sayısı olarak floresan artık artar sonra darbelerin sayısını seçin.
10. 405 nm ışık ile desenli uyarma ile adım 5.8 çizilen bölge paGFP floresan etkinleştirin. Etkinleştirmeden hemen önce ve etkinleştirmeden hemen sonra görüntü nün elde edilmesini sağlayın.
    NOT: İdeal paGFP aktivasyonu, YGI'de yer alan keskin sınırlara sahip, açıkça tanımlanmış bir floresan bölgesi üretecektir.
11. Etkinleştirme sona ererken 1 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. 1 dakikasonunda, bir timelapse serisi nin edinimi başlar.
    NOT: PaGFP¹¹fotoaktivasyonu sonrasında gözlenen floresan artışı için 1 dakikalık gecikme gereklidir. Nabız yayma yöntemi için, 30 saniyelik zaman atlamalı aralıklarla 5-10 dakikalık bir kazanım periyodu, hız ve yönlülüğü ölçmek için merkezi ve yan pencerelerdeki ilk yamaçların ölçümü için yeterlidir. Darbe kaçış yöntemi için, 5 veya 10 dakikalık zaman atlamalı aralıklarla 30-150 dakikalık bir kazanım süresi filamentlerin uzun süreli duraklama davranışının analizine izin verir
12. Floresan aktivasyonu için kullanılan Yatırım Getirisi'nin yanı sıra elde edilen tüm görüntüleri kaydedin.
13. Siniryeni bir bölgeye taşıyın ve adımları 5.1-5.11 tekrarlayın. Yeni bölge aynı akson boyunca ise, diğer aktif bölgeden hareket eden floresan nörofilamentlerin tespitini önlemek için daha önce aktive edilen bölgeden en az 500 μm olmalıdır. Son zaman atlamalı edinme 3 saatlik pencerenin bitiminden önce bitirmelidir.
    NOT: Hazırlık 3 saatten daha uzun süre uygulanabilir olabilir, ancak biz teyit değil. Yeterli diseksiyon ve hazırlık ile, beş ila sekiz arasında 10 dakikalık timelapse görüntü setleri bu 3 saatlik pencere içinde elde edilebilir.
14. Son timelapse görüntü serisi elde edilip, tuzlu su akışını durdurun, çözelti ve oda ısıtıcıları kesmek ve mikroskop aşamasından perfüzyon cihazı çıkarın.

6. Düz alan ve darkfield görüntü edinimi

1. 0,5 mL çift distile suya 250 mg floresan tozu ekleyerek floresan çözeltisi yapın. Görünür parçacıklar olmayana kadar karıştırın ve çözünmemiş herhangi bir malzemeyi tortulamak için bir masa üstü santrifüjde 30 saniye boyunca çözeltiyi döndürün. Bu çözelti, ışığa maruz kalma durumunda 4 °C'de birkaç ay saklanabilir.
2. Bir slayta 8 μL floresan çözeltisi ekleyin ve #1,5 kapak kaydırın. Fazla sıvıyı temizleyin, oje ile kapatın ve kurumasını bekleyin.
   NOT: Bu yüksek konsantrasyonda, floresan boyanın güçlü emilimi çözelti içindeki aydınlatıcı Kirişi söndürür ve kapak yüzeyinde hem düzgün hem de hızlı difüzör değişimi nedeniyle fotobeyaznmeye karşı dayanıklı ince bir floresan düzlemi üretir¹².
3. Floresan slayt kapağını ters mikroskop aşamasına aşağı doğru yerleştirin ve kapağın yüzeyindeki ince floresan düzlemine odaklanın. Hava kabarcıkları (koyu noktalar) veya büyük floresan parçacıkları (parlak noktalar) içermeyen bir görüş alanı bulmak için slaytetrafında hareket ettirin.
4. Orta daki görüntünün orijinal odak düzlemi olması için 0,2 μm aralıklarla 6 μm'lik bir z yığını edinin. Floresan çok parlak olacağından kısa pozlama süresi (örn. 40 ms) kullanın. Bu z-stack edinimi, kapak kayma nadiren mükemmel yatay ve floresan floresan düzlemi çok dar olduğu gibi görüş alanı boyunca maksimal floresan yakalamak için gereklidir. Bunu toplam 25 görüş alanı için tekrarlayın ve sahneyi alanlar arasında herhangi bir yönde en az 20 m hareket ettirin.
5. Kamera deklanşörü de dahil olmak üzere tüm ışık yolu panjurlarını kapatın ve lazer gücünü ve pozlama süresini sıfıra ayarlayın. Bu ayarlarla 100 resim yığını edinin. Bu görüntüler karanlık akım ve kamera çipi üzerinde önyargı ofset düzeltmek için kullanılacak darkfield görüntü oluşturmak için ortalama olacaktır.
   NOT: Akış edinimi bu görüntüleri yakalamak için ideal bir yoldur.

7. Görüntüleme glikolitik çamaşır suyu düzeltme için sinirlerin inhibe

1. Adım 1'deki gibi tuzlu çözelti yapmak ve oksijenvermek; ancak D-glukoz yerine 2-deoksi-D-glukoz ve glikoliz inhibe etmek için 0.5 mM sodyum iyodoasetat ekleyin¹³. Biz buna "inhibitör tuzlu" olarak adlandırıyoruz.
2. 10-30 dakikalık timelapse görüntü adım 5.11 ayarlanmış, inhibitör tuzlu kullanarak adımları 2-5 tekrarlayın. Nörofilament taşımatam inhibisyonu sağlamak için görüntüleme den önce inhibitör tuzlu uygulamadan sonra 40-50 dakika bekleyin.
   NOT: Glikolitik inhibisyon sonunda aksonları öldürecek, böylece inhibisyondan sonra dar bir zaman penceresi vardır ve bu da genellikle yaklaşık 30 dakika veri elde etmek için. Metabolik inhibisyon düzeyinin bir göstergesi aksonal mitokondri flavin otofloresans, biz paGFP floresan1 görüntü için kullandığımız uzun pozlama nedeniyle timelapse serisi tespit edilebilir¹⁴. Tipik olarak, mitokondriyal otofloresans inhibitör tuzlu ile tedavi sırasında artacaktır. Mitokondri toparlamaya veya parçalanmaya başlarsa, görüntülemeyi durdurun.

8. ImageJ kullanarak görüntü işleme ve analiz

1. Düz alan ve darkfield düzeltme
   1. Darkfield görüntü yığınını açın ve Resim'i tıklatarak görüntüleri ortalamanız | Yığınlar | Z Project ve darkfield görüntüsünü oluşturmak için açılır menüde Ortalama Yoğunluk seçilir.
   2. Floresan flatfield görüntü yığınlarını açın ve Resim ' e tıklayarak her birinin (toplam 25) maksimum yoğunluklu projeksiyonu oluşturun | Yığınlar | Z Project ve açılan menüde Max Intensity'yi seçme.
   3. Resim | Yığınlar | Yığıngörüntüler. Resim ' e tıklayarak bu yığının ortalama yoğunluk projeksiyonu oluşturun | Yığınlar | Z Projesi ve düz alan görüntüsünüoluşturmak için açılan menüden Ortalama Yoğunluk seçilir.
   4. İşlem 'e tıklayarak darkfield görüntüsünü düz alan görüntüsünden çıkarma | Görüntü Hesap Makinesi, işlem olarak Çıkarma'yı seçer. 32 bit (float) sonuç seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Sonuç düzeltilmiş flatfield görüntüdür.
   5. Düzeltilmiş düz alan görüntüsünün ortalama piksel yoğunluğunu ilk olarak Analiz et | Ölçümleri ayarlayın ve Ortalama gri değer kutusunu işaretleyin ve ardından 'm' tuşuna basın.
   6. Düzeltilmiş düz alan görüntüsünü İşlem'e tıklayarak ortalama yoğunluğuna göre böl | Matematik | 7.1.5 adımda elde edilen ortalama gri değeri böl ve gir. Bu ters kazanç görüntü üretecektir.
   7. Devre arası görüntü yığınıyla birlikte etkinleştirme öncesi ve aktivasyon sonrası görüntüleri açın. Resim | Yığınlar | Araçlar | Açılanmenülerden görüntüleri kronolojik sırada tamamla ve seçin. 4B görüntü olarak Aç seçeneğinin seçilmediğinden emin olun. Ortaya çıkan yığın tam görüntü kümesidir.
   8. Tam görüntü kümesinde8.1.4 adımını tekrarlayın ve ardından İşlem 'e tıklayarak sonucu ters kazanç görüntüsüne bölün | Görüntü Hesap Makinesi ve işlem olarak Böl'ü seçin. Bu düzeltilmiş tam görüntü kümesiüretecek , hangi her görüntü aydınlatma alanında ve dedektör üzerinde olmayan tekdüzelik için düzeltilmiştir.
2. Görüntü yığını hizalama
   1. Sahne veya örnek kayması nedeniyle zaman atlama serisindeki görüntü düzlemlerinin yanlış hizalanmasını düzeltmek için, Eklentileri tıklatarak Hizalama'yı sabit bölge eklentisine(Ek Dosya 1)yükleyin | PlugIn'i yükleyin,eklenti dosyasını içeren klasöre gezinme ve eklentiyi seçin. Eklentiyi yükledikten sonra ImageJ'i yeniden başlatın.
      NOT: Bu eklenti görüntüleri "en az kareler congealing" ilkesine göre hizalar¹⁵.
   2. Birkaç aksonu kapsayan ve aksonların her birinde aktif floresan proksimal ve distal sınırları ötesine geçmez düzeltilmiş tam görüntü seti üzerinde bir YG çizin. Bölgenin geometrisi önemsizdir, ancak yapıların şekil veya boyut değiştirdiği alanlar hariç olmak üzere hizalamayı geliştirecektir.
   3. Eklentileri tıklatarak hizalama eklentisini çalıştırın | Sabit bölgeye göre hizalama. Eklenti, kareler arasındaki yer değiştirmeye varsayılan 2 piksellik maksimum yerleştirir, ancak örnekte önemli bir sürüklenme varsa bu durum ilk açılır pencerede ayarlanabilir. Hizalama, görüntü yığınının boyutuna bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.
   4. Hizalamanın kalitesini değerlendirmek için hizalanmış yığını görsel olarak inceleyin. Otomatik hizalama, çerçeveler arasındaki floresan büyük dalgalanmalar için iyi çalışmayabilir gibi, daha sonra bazı çerçeveler, el ile hizalanması gerekebilir. Bu, Resim | Dönüştür | Çevir. Yığının tamamının çevrilip çevrilmemesi gerektiğini soran aşağıdaki açılır pencerede Hayır'ı tıklatın. Çeviride yalnızca tümsado piksel değerlerini kullanın ve kesirli piksel kaydırma veya enterpolasyon piksel yoğunluklarının yeniden alabilmesi nedeniyle verileri değiştireceği için açılır menüenterasyon menüsünün Noneolarak ayarlandığından emin olun.
   5. Hizalanmış tam görüntü kümesi olarak bunu kaydedin.
3. Floresan yoğunluklarının ölçümü
   1. Hizalanmış tam görüntü kümesinin ilk karesinde, aktive bölgenin bir kenarı boyunca, aksonlarla dik ve ikinci kol dikey olan açı aracını kullanarak bir Yatırım Getirisi çizin. Açıyı ölçmek için 'm' tuşuna basın, bu da aksonun görüş alanındaki yönünü açıklar.
   2. Analiz et | Ölçek'i ayarlayın Scale ve uygun değerleri girin.
   3. Çözümle'yi tıklatarak Yatırım Getirisi yöneticisini açın | Araçlar | YRK Yöneticisi. Nabız kaçış paradigması için adım 8.3.7'ye geçin. Nabız yayılımı için, adım 8.3.4 devam edin.
   4. Herhangi bir boyuttan bir kare yy'ı çizin ve sonra Edit'i tıklatın | Seçim | Belirtin. Ölçeklenmiş birimler seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun ve yG'yi 15 μm genişliğe ve görüntünün yüksekliğine eşit veya daha yüksek bir yüksekliğe ayarlayın.
   5. Düzenleme ' yi tıklatarak YG'yi adım 8.3.1' de ölçülen açıya göre döndürün | Seçim | Aksonlarla dik hale getirmek için döndürün ve yG'yi aktive bölgenin proksimal kenarı boyunca bir tarafıyla yerleştirin. Proksimal kılavuz Yatırım Getirisi olarak adlandırılacağız bu Yatırım Getirisi'ni 't' tuşuna basarak yöneticiye ekleyin.
   6. YG'yi etkinleştirilen bölgenin distal kenarıyla hizalamak için sürükleyin ve 't' tuşuna basarak yG yöneticisine tekrar ekleyin. Biz distal kılavuzu RoI olarak bu bakın. Proksimal ve distal kılavuz ROI'lar daha sonra yan ölçüm ROI'larını çizmek için kullanılacaktır.
   7. Yukarıdaki adım 5.11'de edinilen timelapse görüntü sırasını kullanarak nicelleştirme için aksonu seçin. Bu görüntü dizisi, aksonların zayıf otofloresanlarını yakalayıp aktif bölgenin dışındaki morfolojilerini ortaya çıkardığı için bu amaç için yararlıdır.
      NOT: Aşağıdaki ölçütlere uymayan aksonlar analizden çıkarılır:
      1. Aksonlar tüm ölçüm pencerelerinin tüm uzunluğu boyunca odaklanmış olmalıdır.
      2. Aksonlar aktivasyon bölgesinin proksimal ve distal uçlarına dik 5° içinde olmalıdır.
      3. Aksonlar aktivasyon bölgesinin proksimal ve distal uçlarının 5μm içinde hiçbir invaginations olmalıdır.
      4. Görüntüleme sırasında gözle görülür şekilde şekil değiştiren aksonu hariç takın.
      5. Aktivasyon sonrası görüntüde ayrı bir aktive bölgenin yokluğunda kanıtlandığı gibi sağlıksız görünen aksonu hariç tutarak(Şekil 2C, altta), bu akson öldüğünde meydana gelen aktif floresan'ın diffüzif dağılımının göstergesidir.
   8. Aksoniçindeki otofloresan yapılar için adım 5.5'ten uzun pozlama beyazlatma görüntüsünü gözlemleyin. Bu floresan mitokondri içinde flavins kaynaklanmaktadır¹⁶. Bu mitokondriler, metabolik gerilemenin bir göstergesi olduğu için, uzatılmış, doğrusal yapıların(Şekil 2D, üst) aksine yuvarlak veya parçalanmış(Şekil 2D, alt) görünüyorsa aksonu analizden dışlayın.
   9. Yukarıda oluşturulan proksimal ve distal kılavuz ROI'ları kullanarak, analiz edilen akson başına üç ölçüm ROI'sı çizin: 40 μm aktif bölge içindeki akson'u kapsayan merkezi bir pencere ve yan pencere 15 μm ROI'lar ile sınırlandırılmış genişliğe sahip iki yan pencere ve aktivasyon bölgesinin sınırındaki akson çapı ile sınırlanan yükseklik. Üç bölgeyi de YG yöneticisine ekleyin. Glikolik inhibe aksonlar için, aktive bölgenin ortasında en fazla 5 μm genişliğinde ve akson dışında uzanan tek bir bölge çizin. Darbe kaçış paradigması için, aktif bölge sadece 5 μm genişliğindedir, bu nedenle tüm pencere kullanılmalıdır.
   10. Adım 8.3.7 ve 8.3.8 kriterlerini karşılayan tüm aksonlar için 8.3.9 adımını tekrarlayın.
   11. Etkin ölçümleri Analiz et ' e tıklayarak ortalama piksel yoğunluğuna ayarlayın | Ölçümleri ayarlayın ve Ortalama gri değer seçeneğini seçin. Başka ölçüm seçeneğinin kontrol olmadığından emin olun.
   12. Pencereyi seçerek ve 'Ctrl' + 'a' tuşuna basarak YG Yöneticisi penceresindeki tüm ROI'ları seçin. YG Yöneticisi penceresinde, Daha fazla | Floresan yoğunluklarını ölçmek için Çoklu Ölçü. Daha fazla analiz için sonuçlar penceresinden verileri elektronik tabloya kopyalayın.
   13. Etkin ölçümleri Analiz et' i tıklatarak bölge alanına ayarlama | Ölçümleri ayarlayın ve Alan seçeneğini seçin. Başka ölçüm seçeneğinin kontrol olmadığından emin olun.
   14. Adımı 8.3.12'yi tekrarlayın. Alan zamana göre değişmediği için, alan için sonuçların yalnızca bir satırını kopyalamak gerekir.

9. Photobleach düzeltme

1. Glikoletik olarak inhibe edilen aksonlara ait veri tablosunda, belirli bir Yatırım Getirisi için çerçeve 3'ten (ilk zaman atlamalı çerçeve) başlayarak her çerçevenin ortalama floresanından kare 1'in (aktivasyon öncesi çerçeve) ortalama floresanını çıkarın. Sonuçlar arka plan-çıkarılan anlamına gelir.
2. Verileri, çerçeve numaraları yla abscissa olarak bir dağılım çizimi olarak çizin. Ae^-bxşeklinde bir denklem ile her YG (en elektronik tablo programları bu işleve sahip) verilere bir üstel eğilim çizgisi sığdırMak . Bu denklem fotobleaching fonksiyonu F_t = F₀ * e^-tin f₀ zaman atlamasının ilk karesinde floresan olduğu eşdeğerdir, üstel ağartma hızı, t zaman ve e doğal logaritma tabanıdır.
3. Glikolikinik inhibe sinirlertüm akson tüm ROI için tekrar adımları 9.1.1-9.1.2. Fotobeyaztma oranının en doğru tahmini için, en az 5 ayrı sinirden en az 15 akson kullanın. Fotobeyaztma için deneysel verileri düzeltmek için tüm inhibe aksonların üstel beyazlatma oranlarının ortalamasını (10) kullanın. Fotobeyaztasyon görüntü edinme ayarlarına ve zaman içinde değişebilen lazer gücüne bağlı olduğundan, her deney veya çalışma için yeni bir beyazlatma kalibrasyonu yapılmalıdır.
4. Normal salin ile görüntülenen aksonun tüm bölgeleri için 9.1.1 adımını tekrarlayın (yani glikoletik olarak inhibe edilmez).
5. Her veri noktasını e^-tt'yebölün, t için zaman ve 9.1.3 adımda bulunan ortalama bir süreyi kullanarak. Bunlar fotobleach düzeltilmiş anlamına gelir.
6. Her zaman o bölgedeki toplam floresan bulmak için ilgi alanı için her veri noktası ile çarpın.

Sonuçlar

Şekil 3, darbe kaçışı ve darbe yayılımı deneylerinden temsili görüntüler gösterir. Biz darbe-kaçış yöntemi ve bu^verilerinanalizi için yöntemlerimiz^5,6,,7,8,17kullanılarak elde edilen verileri açıklayan çeşitli çalışmalar yayınladık. Aşağıda, nabız yayılımı verilerinin daha önce bildirmediğimiz ...

Tartışmalar

Bakım-kaçış ve nabız yayılımı deneylerinin analizinde dikkatli olunmalıdır, çünkü özellikle düz alan düzeltmesi, görüntü hizalama ve çamaşır suyu düzeltmesi sırasında, işlem sonrası hatanın ortaya çıkması için önemli bir potansiyel vardır. Düz alan düzeltmesi, aydınlanmadaki tekdüzelik için düzeltmegereklidir, bu da merkezden çevreye görüş alanı boyunca yoğunlukta bir düşüşe neden olur. Tekdüzeliğin kapsamı dalga boyuna bağlıdır ve bu nedenle, her zaman deneysel ver...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors