절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

요약

우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.

초록

Neurofilament 단백질 폴리머는 일평균 ~ 0.35-3.5 mmmm의 속도로 축산 수송의 느린 성분에서 축축을 따라 움직입니다. 최근까지 이 운동의 연구는 방사성 이소토피맥 라벨링을 사용하여 가능했으며, 이는 며칠간의 시간적 해상도와 밀리미터의 공간 해상도로 전체 신경에서 축산 수송을 분석할 수 있게 해주였습니다. 더 높은 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송을 연구하기 위해, 우리는 뉴런에서 광액표 GFP로 태그 신경 필라멘트 단백질 M을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질 성 마우스를 개발했습니다. 여기서우리는 이러한 마우스 ex vivo로부터의 한 골수염 축삭에서 신경필라멘트 수송을 분석하기 위해 형광활성화 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법을 설명한다. 고립 된 신경 세그먼트는 산소식염수와 관류에 의해 현미경 단계에서 유지되고 디스크 공초점 형광 현미경 을 회전하여 이미지화됩니다. 보라색 빛은 짧은 축축절 창에서 형광을 활성화하는 데 사용됩니다. 활성화 및 측면 영역의 형광은 시간이 지남에 따라 분석되어 분 및 미크론 순서에 대한 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송 연구를 허용합니다. 수학 모델링은 결과 데이터에서 속도, 방향 편향 및 일시 중지 동작을 포함하여 neurofilament 전송의 운동 매개 변수를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법은 또한 그밖 신경에 있는 신경 필라멘트 수송을 시각화하기 위하여 적응될 수 있습니다. 추가 형질 전환 마우스의 발달로, 이 방법은 또한 착상에 있는 그밖 사이토스켈레탈 및 세포경 단백질의 축축한 수송을 심상 하고 분석하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

서문

신경필라멘트의 축축 전달은 1970년대에 방사성 이소성 맥박 라벨링^1에의해 처음 입증되었다. 이 접근법은 생체 내에서 신경 필라멘트 수송에대한 풍부한 정보를 산출했지만, 일반적으로 밀리미터와 일의 순서에 상대적으로 낮은 공간 및 시간적 해상도를 갖는다^2. 더욱이, 방사성 동위원소 펄스 라벨링은 단일 시간 과정을 생성하기 위해 여러 동물의 주사와 희생을 요구하는 간접적인 접근법이다. 1990년대에 형광성 단백질의 발견과 형광 현미경 검사법의 발전으로, 이후 초 또는 분 의 시간 척도및 서브 마이크로미터 공간 해상도로 배양 된 뉴런에서 직접 신경 필라멘트 수송을 이미지화하여 운동^3의메커니즘에 훨씬 더 큰 통찰력을 제공하게되었습니다. 이러한 연구는 축축산에 신경 필라멘트 폴리머가 미세 투튜룰 모터 단백질에 의해 추진 된 마이크로 투룰 트랙을 따라 영양 및 역행 방향 모두에서 신속하고 간헐적으로 이동한다는 것을 밝혔습니다. 그러나, 신경필라멘트는 수십 나노미터에 의해 그들의 이웃에서 떨어져 일반적으로 간격을 둔 직경에 다만 10 nm의 회절 제한 구조물입니다; 따라서, 중합체는 이동 폴리머가^{이웃4로부터}해결될 수 있도록 드물게 분산된 신경필라멘트를 포함하는 배양된 뉴런에서만 추적될 수 있다. 따라서, 골수염축산축산과 같은 풍부한 신경필라멘트 폴리머를 함유한 축축에서 단일 신경필라멘트를 추적할 수 없다.

형광 현미경을 이용한 신경필라멘트-풍부한 축산에서 신경필라멘트의 축축수송을 분석하기 위해, 배양된^{신경세포4,,5에서}신경필라멘트의 장기 일시 중지 동작을 연구하기 위해 개발한 형광활성화 펄스-이스케이프 방법을 사용하고 있다. 광액활성 형광 성 신경필라멘트 융합 단백질로 태그된 신경필라멘트는 축종의 짧은 세그먼트에서 활성화되고, 활성화된 부위로부터의 필라멘트의 이탈 속도는 시간이 지남에 따라 형광 부패를 측정하여 정량화된다. 이 접근법의 장점은 개별 신경필라멘트 폴리머의 움직임을 추적할 필요 없이 시간 척도에 적용될 수 있는 신경필라멘트 수송의 인구 수준 분석이라는 것입니다. 예를 들어, 우리는 골수 배양^6에서신경 필라멘트 수송의 운동을 분석하기 위해이 방법을 사용했다.

최근에는 인간 뉴런 특이적 Thy1 프로모터^7의통제 하에 뉴런에서 paGFP 태그된 신경필라멘트 단백질 M(paGFP-NFM)의 낮은 수준을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질전환 마우스의 개발을 설명했다. 이 마우스는 형광 현미경 검사를 사용하여 시상에서 신경 필라멘트 수송의 분석을 허용합니다. 이 문서에서는, 우리는 2개의 접근을 사용하여 이 마우스에서 양철 신경의 골수화한 축소에 있는 신경필라멘트 수송을 분석하기 위한 실험적인 접근을 기술합니다. 이러한 접근법의 첫 번째는 위에서 설명한 펄스 이스케이프 방법입니다. 이 방법은 신경필라멘트의 일시 중지 동작에 대한 정보를 생성할 수 있지만 필라멘트가 활성화된 영역을 출발하는 방향으로 눈이 멀어 순 방향성 및 수송 속도^8의측정을 허용하지 않는다. 이러한 접근법의 두 번째는 활성화된 영역에서형광손실뿐만 아니라 형광필라멘트가 전방 및 역행 방향으로 활성화된 영역을 떠날 때 이동하는 두 개의 측면 창에서 형광의 일시적인 증가를 분석하는 새로운 펄스 확산 방법입니다. 두 가지 접근법 모두에서 평균 속도, 순 방향성 및 일시 중지 동작과 같은 신경 필라멘트 수송의 매개 변수는 측정 창에서 형광변화의 변화에 대한 수학적 분석 및 모델링을 사용하여 얻을 수 있습니다. 그림 3은 이 두 가지 방법을 보여 줍니다.

이 프로토콜은 ImageJ^9의FIJI 분포 패키지를 사용하여 획득 된 이미지에서 paGFP 형광의 신경 의 해부 및 제조, 활성화 및 이미징, 및 신경 필라멘트 수송의 정량화를 보여줍니다. 우리는 긴 (몇 cm)이며 분기하지 않기 때문에 경골 신경을 사용합니다. 그러나, 원칙적으로 paGFP-NFM을 표현하는 신경은 축축을 손상시키지 않고 해부되고 탈피될 수 있는 경우에 이 기술로 사용하기에 적합합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 신경 식염수 용액의 준비

1. 브루어의 식염수^100mL만들기 : 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH₂PO_4,1 mM MgSO_4,1.5 mM CaCl_2,5.6 % D-포도당, 23.8 mM NaHCO₃ 을 이중 증류수로 만듭니다.
2. 사용 전 30분 이상 식염수 용액을 통해 95%의 산소/5%의 이산화탄소(carbogen)를 거품을 낸다. 남은 식염수는 1주일 이내에 재사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 각 사용 하기 전에 재산소 해야 합니다.
3. 산소식 식염수에 60mL 주사기에 붓고 주사기에 최소한의 공기가 남아 있는지 확인합니다.

2. 신경 관류 챔버의 초기 조립

1. 그림 1A에표시된 대로 주사기와 튜브를 연결하여 유출 튜브를 폐기물 플라스크에 넣습니다.
2. 외부 개스킷을 관류 챔버 하우징에 배치하여 유동 입구와 콘센트 기둥이 개스킷의 구멍과 정렬되도록 합니다.
3. 내부 개스킷(실리콘, 두께 100μm)을 #1.5 원형 커버슬립(직경 40mm)에 놓고 개스킷의 주름을 조심스럽게 매끄럽게 하여 단단한 밀봉을 보장합니다. 나중에 조립을 용이하게하려면 개스킷이 위를 향하도록 커버슬립과 개스킷을 종이 타월이나 작업 닦아 놓습니다.

3. 마우스 경골 신경의 해부 및 준비

1. 이산화탄소 흡입 또는 다른 제도적으로 승인된 방법으로 동물을 희생하십시오. 실험은 희생^7의3 시간 이내에 수행되어야하기 때문에 동물이 운동 / 호흡을 중단 할 때 타이머를 시작합니다.
2. 모피를 70% 에탄올로 스프레이하고 전기 면도기로 동물의 다리와 등에서 가능한 한 많이 제거합니다.
3. 큰 해부 가위를 사용하여 척추 의 중간 근처 피부에 등색 절개를하고 동물의 복부 측면 주위에 절단을 계속합니다. 이 컷부터 근육에서 부드럽게 당기고 근막을 절단하여 다리에서 피부를 천천히 반사합니다.
4. 해부 트레이에 동물을 척추 위치에 놓고 네 발을 모두 고정합니다. 선택적으로 꼬리를 고정하여 움직임을 더 줄입니다.
5. 미세 절 가위를 사용 하 여, 꼬리와 무릎 사이 중간 허벅지 근육에 절개를 하 고 좌 골 신경을 노출. 근육을 통해 볼 수있는 신경이 절단되지 않았는지 확인하십시오.
6. 절개를 등대와 통풍구로 확장하여 근육을 제거합니다. 마찬가지로, 종아리의 근육을 제거, 신경 손상을 피하기 위해 얕고 짧은 상처를 유지.
7. 신경이 완전히 발 뒤꿈치(그림 2A)에상골 신경 (무릎에서)에서 분기 지점에서 노출 될 때까지 근육을 제거합니다.
   참고: 경골 신경의 해부를 포함 하 고 다음 하는 모든 단계에서, 신경에 paGFP의 가능한 부수적인 활성화를 최소화 하기 위해 주변 빛에 불필요 한 노출을 방지.
8. 척추 근위쪽 끝에 있는 양철 신경을 한 쌍의 집게로 잡고 미세 절 가위를 사용하여 신경을 잘라냅니다. 신경에 긴장을 두지 않도록주의하고, 근육에서 들어 올려 첨부 파일을 절단하십시오.
9. 경골 신경의 척추 말단을 자르고 실온 산소식식염수의 작은 페트리 접시로 옮습니다. 절차에서이 시점에서, 항상 신경의 근위 및 말단 끝을 추적 하는 것이 확실 하다.
   참고: 이 작업을 수행하는 한 가지 방법은 테이퍼가 보이도록 각진 절단으로 신경의 말단 끝을 표시하는 것입니다.
10. 신경의 근접 끝에서 시작하여 노출된 축축을 매우 미세한 집게로 부드럽게 잡습니다.
11. 두 번째 집게를 사용하면 신경 칼집을 근교로 잡고 천천히 신경의 말단쪽으로 당깁니다. 신경 칼집은 최소한의 저항으로 축을 따라 미끄러집니다. 이 과정에서 신경에 과도한 긴장이 적용되지 않도록 하십시오.

4. 최종 신경 관류 챔버 조립

1. 신경의 근위 쪽 끝을 잡고, 식염수에서 제거하고 천천히 내부 개스킷의 직사각형 개구부 내 관혈 챔버의 커버 슬립에 내려 놓고, 당신이 똑바로 누워 있도록 신경에 부드러운 긴장을 유지.
2. 신경을 향한 홈이 있는 측면과 신경에 평행하게 흐르는 흐름방향으로 마이크로커덕트 슬라이드를 신경 위에 놓습니다. 커버슬립 및 마이크로커덕트 어셈블리를 뒤집어 서큐레이션 챔버 하우징 내에 배치하는 마이크로커덕슬라이드를 외부 개스킷에 배치합니다. 신경과 주변 내부 개스킷은 이제 개스킷에 의해 분리되는 커버슬립과 마이크로커덕트 슬라이드 사이에 끼워져 커버슬립(도1B)을향하고 있다.
3. 금속 하우징에 배치하고 잠금 링을 회전하여 관류 챔버를 확보하십시오. 플라스틱 하우징이 모든 금속 클립 아래에 완전히 있는지 확인하고 식염수 누출을 방지하기 위해 잘 조여십시오. 과조는 미세 로크 슬라이드 또는 커버 슬립을 해독 할 수 있습니다. 커버슬립이 아래로 향하고 있도록 챔버를 뒤집습니다.
4. 식염수 주사기 플런저를 천천히 우울하여 관류 챔버를 채웁니다. 설치 및 이미징 중에 입구와 콘센트 튜브, 콘센트 플라스크 및 주사기를 항상 챔버 자체 위로 올려 놓습니다. 이것은 거품을 소개하거나 챔버에 있는 부정적인 압력 때문에 초점 불안정을 일으키는 원인이 될 수 있는 사이펀을 방지합니다.
5. 관류 어셈블리를 반전 된 현미경 단계로 옮기고 식염수 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 0.25 mL/min의 유량에 적합한 속도로 모터를 시작합니다. 그런 다음 37°C로 설정된 인라인 용액 히터를 연결하고 켭니다.
6. 객관적인 히터를 연결하고 37°C로 설정하고, 목표에 오일을 적용하고, 계열 탈산에 관류 챔버를 삽입한다.
7. 챔버 히터 패드에 오일을 바르고 관류 챔버에 부착하십시오. 연결 및 챔버 히터를 켭니다. 37 °C로 설정합니다.
   참고: 온도의 변화로 인해 용액의 가스유출로 인해 관혈챔버에서 기포가 형성될 수 있다. 거품이 형성되면 거품이 챔버를 지울 때까지 용액 유량을 5-10배 증가시면 잠시 증가합니다.
8. 관류 챔버를 무대 어댑터에 잠그고 목표 오일을 챔버 밑면의 커버슬립과 접촉합니다.
   참고: 여기에 사용되는 ASI 단계 어댑터가 있는 Bioptechs 챔버는 반전된 현미경 구성을 위해 설계되었습니다.

5. 형광 활성화 및 이미지 수집

1. 밝은 필드 조명을 사용하여, 커버 슬립 표면에 가장 가까운 신경의 하단 표면에 축축의 층에 초점(도 2B). 골수화 축축(일반적으로 성인 마우스의 직경 1 -6 μm)은 명암 칼집의 존재에 의해 식별될 수 있으며, 이는 대조 향상 없이 밝은 필드 전달 광 조명 아래에서 볼 수 있다. 슈미트 란터만갈라의 갈라진 갈라진 부분과 랜비어의 노드도 쉽게 드러나고 있습니다. 미켈라인축축은 더 가느다란(일반적으로 & 1 μm 직경)이며 일반적으로 번들(Remak 번들)에 존재하며, 일반적으로 서로 해결하기에는 너무 가깝게 양치되어 있습니다.
2. 현미경에서 사용할 수 있는 경우, 타임랩스 이미징의 과정을 통해 초점을 유지하기 위해 자동 초점 시스템을 활성화.
3. 밝은 필드 참조 이미지를 획득합니다. 이미지와 관련하여 신경의 방향(척추 근위및 단부 끝)을 기록합니다.
4. 488nm 레이저와 paGFP(예: 525/50 nm)에 적합한 방출 필터를 사용하여 공초점 이미지를 획득하여 표백제 전 자동 불발성을 기록합니다. 레이저 전력을 낮게 유지하여 광표백을 최소화하고, 노출 시간이 그에 따라 조정되어 희미한 신호를 감지합니다. 예를 들어, 대표적인 데이터는 5% 레이저 전력과 4s 노출로 획득되었습니다. 향후 모든 실험에서 사용할 획득 설정을 기록합니다.
   참고: 포토활성화 후 이상적인 이미징 설정은 20개의 이미지 동안 원래 신호의 25% 미만의 신호 대 잡음 비율 > 8 및 광표백을 생성합니다. 축축은 또한 우리가 원래 했던 것처럼 와이드 필드 epifluorescence 현미경 검사법에 의해 심상될 수 있습니다^7,그러나 화질은 공초점의 부족 때문에 열등할 것입니다.
5. 레이저 전력을 약 5배의 일반 이미징 전력으로 설정하고 노출 시간으로 3-4분의 노출 시간으로 이미지를 획득합니다. 필수적지는 않지만, 이 단계는 배경 신호를 줄이고 광활성화 형광의 신호 대 노이즈를 최대화하기 위해 자동 형광 및 원치 않는 형광의 다른 소스를 표백하는 것이 좋습니다.
6. 이 표백 단계 후 사전 활성화 자동 형광을 기록하기 위해 5.4 단계에서 사용되는 설정으로 이미지를 획득합니다.
7. 브라이트필드 이미지에서 원하는 활성화 창 크기와 동일한 길이의 축축에 평행선을 그립니다. 이 창의 길이는 실험 목표 및 매개 변수에 따라 다르지만, 일반적인 길이는 펄스 이스케이프 패러다임에 대한 5 μm, 펄스 확산 패러다임의 경우 40 μm입니다.
8. 이 선을 가이드로 사용하여 축축에 수직으로 시야를 가로질러 직사각형 관심 영역(ROI)을 그립니다. 영역은 광활성화할 모든 축축을 포함해야 합니다.
9. 405 nm 조명으로 포토활성화를 위한 최적의 설정을 결정합니다.
   참고: 첫 번째 실험 활성화 전에 이 단계와 하위 단계만 수행합니다. 실험 을 진행하는 동안 동일한 포토활성화 설정을 사용해야 합니다.
   1. 405 nm 레이저 라인, 저레이저 전력(예를 들어, 5%), 픽셀 거주 시간(예: 40 μs) 및 1펄스를 사용하여 관심 영역을 반복적으로 활성화하여 각 활성화 후 활성화된 GFP 형광의 이미지를 획득한다. 형광이 더 이상 증가하지 않는 때까지 반복한 다음 각 이미지에 대한 관심 영역에서 형광을 정량화합니다.
   2. 펄스 수 대 평균 형광 강도를 플롯합니다. 활성화를 위한 최적의 펄스 수로 형광이 더 이상 증가하지 않는 펄스 수를 선택합니다.
10. 405nm 광으로 패턴 난관에 의해 5.8단계에서 그려진 영역을 paGFP 형광을 활성화한다. 활성화 직전에 바로 다음에 이미지를 획득해야 합니다.
    참고: 이상적인 paGFP 활성화는 ROI 내에 포함된 선명한 경계가 있는 명확하게 정의된 형광 영역을 생성합니다.
11. 활성화가 완료되면 1분 타이머를 시작합니다. 1분 후, 타임랩스 시리즈를 시작하세요.
    참고: paGFP^11의광활성화 에 따라 관찰되는 형광의 증가를 허용하기 위해 1분 지연이 필요하다. 펄스 확산 방법의 경우, 30초 타임랩스 간격을 가진 5-10분 획득 기간은 속도와 방향성을 측정하기 위해 중앙 및 측면 창의 초기 경사를 측정하기에 충분합니다. 펄스 이스케이프 방법의 경우, 5분 또는 10분 의 타임랩스 간격으로 30-150분의 획득 기간을 통해 필라멘트의 장기 일시 중지 동작에 대한 분석을 허용합니다.
12. 획득한 모든 이미지와 형광 활성화에 사용되는 ROI를 저장합니다.
13. 신경의 새로운 영역으로 이동하고 단계를 반복 5.1-5.11. 새로운 영역이 동일한 축축을 따라 있는 경우, 다른 활성화 된 지역에서 이동형 신경 필라멘트의 검출을 피하기 위해 이전에 활성화 된 영역에서 적어도 500 μm이어야한다. 최종 타임랩스 의 획득은 3시간 기간이 끝나기 전에 완료되어야 합니다.
    참고: 3시간 이상 준비가 가능할 수 있지만, 이를 확인하지 는 않았습니다. 숙련된 해부와 준비를 통해 이 3시간 기간 내에 5~8개의 10분 타임랩스 이미지 세트를 획득할 수 있습니다.
14. 최종 타임랩스 이미지 시리즈를 획득한 후, 식염수의 흐름을 멈추고 용액및 챔버 히터를 분리하고 현미경 단계에서 관류 장치를 제거한다.

6. 플랫 필드 및 암필드 이미지 수집

1. 250 mg의 형광 분말을 0.5mL의 이중 증류수에 추가하여 형광액을 만듭니다. 눈에 보이는 입자가 없을 때까지 섞고 탁상 원심분리기에서 30초 동안 용액을 회전하여 용해되지 않은 물질을 침전시합니다. 이 용액은 광 노출로부터 보호되는 경우 4 °C에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
2. 8 μL의 형광용액을 슬라이드에 넣고 #1.5 커버슬립을 적용합니다. 여분의 액체를 블롯하고 매니큐어로 밀봉하고 건조시키십시오.
   참고: 이 고농도에서, 형광염염의 강한 흡수는 용액 내에서 조명 빔을 소화하여, 급속한 확산^{교환(12)으로}인해 균일하고 광표백에 강한 커버슬립 의 표면에 형광의 얇은 평면을 생성한다.
3. 형광 슬라이드 커버슬립 측을 반전 된 현미경 단계에 놓고 커버 슬립의 표면에 형광의 얇은 평면에 초점을 조정합니다. 슬라이드 를 이동하여 기포 (어두운 반점) 또는 큰 형광 입자 (밝은 반점)가 없는 시야를 찾습니다.
4. 0.2 μm 간격으로 6 μm에 달하는 z 스택을 획득하여 중간 이미지가 원래 초점 평면입니다. 형광이 매우 밝기 때문에 짧은 노출 시간 (예를 들어, 40 ms)을 사용합니다. 이 z 스택 획득은 커버 슬립이 거의 완벽하게 수평되지 않으며 형광의 평면이 매우 좁기 때문에 시야를 가로 질러 최대 형광을 포착하는 데 필요합니다. 총 25개의 시야 필드에 대해 반복하여 스테이지를 필드 사이의 모든 방향으로 최소 20 μm로 이동합니다.
5. 카메라 셔터를 포함한 모든 라이트 패스 셔터를 닫고 레이저 출력과 노출 시간을 0으로 설정합니다. 이러한 설정으로 100개의 이미지 스택을 획득합니다. 이러한 이미지는 어두운 전류와 카메라 칩의 바이어스 오프셋을 보정하는 데 사용되는 암필드 이미지를 생성하는 데 평균됩니다.
   참고: 스트리밍 수집은 이러한 이미지를 캡처하는 이상적인 방법입니다.

7. 표백제 교정을 위한 글리코리티 억제 신경을 이미징

1. 1단계에서와 같이 식염수 용액을 만들고 산소화하십시오. 그러나 D-포도당을 위한 2-deoxy-D-포도당을 대체하고^{당화분해(13)를}억제하기 위해 0.5mM 나트륨 요도아세테이트를 첨가한다. 우리는 이것을 "억제식염"이라고 부릅니다.
2. 10-30분 타임랩스 이미지가 5.11 단계로 설정된 억제식염을 사용하여 2-5단계를 반복합니다. 신경 필라멘트 수송의 완전한 억제를 보장하기 위해 이미징 전에 억제 식염수의 적용 후 40-50 분을 허용합니다.
   참고: 글리코리스틱 억제는 결국 축축을 죽여서 일반적으로 약 30분 동안 데이터를 획득하는 억제 후 시간의 좁은 창이 있습니다. 대사 억제의 수준을 나타내는 지표는 축삭 미토콘드리아의 플라빈 자동 형광이며, 이는 우리가 paGFP^{형광(14)을}이미지화하는 데 사용하는 긴 노출로 인해 타임랩스 시리즈에서 검출될 수 있다. 전형적으로, 미토콘드리아 자가형광은 억제식염수로 치료하는 동안 증가할 것이다. 미토콘드리아가 반올림하거나 단편화되기 시작하면 이미징을 중단하십시오.

8. ImageJ를 이용한 이미지 처리 및 분석

1. 플랫필드 및 암필드 보정
   1. 이미지를 클릭하여 암필드 이미지 스택을 열고 이미지를 평균 | 스택 | Z 프로젝트 및 드롭다운 메뉴에서 평균 강도를 선택하여 암필드 이미지를 생성합니다.
   2. 형광 평면장 이미지 스택을 열고 이미지를 클릭하여 각(총 25개)의 최대 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트 및 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택합니다.
   3. 결과 25개의 최대 투영 이미지를 하나의 스택에 결합하여 이미지를 클릭 | 스택 | 스택할 이미지입니다. 이미지를 클릭하여 이 스택의 평균 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트 및 드롭다운 메뉴에서 평균 강도를 선택하여 플랫필드 이미지를 생성합니다.
   4. 프로세스를 클릭하여 평평한 필드 이미지에서 암필드 이미지를 빼내다 | 이미지 계산기,작업으로 빼기를 선택합니다. 32비트(플로트) 결과 옵션을 선택합니다. 결과는 수정된 플랫필드 이미지입니다.
   5. 먼저 클릭하여 수정된 플랫필드 이미지의 평균 픽셀 강도를 측정 | 측정값을 설정하고 평균 회색 값 상자를 확인한 다음 'm' 키를 누른 다음 누를 수 있습니다.
   6. 프로세스를 클릭하여 수정된 플랫필드 이미지를 평균 강도로 나눕니다 | 수학 | 7.1.5 단계에서 얻은 평균 회색 값을 나누고 입력합니다. 이렇게 하면 역이득 이미지가 생성됩니다.
   7. 타임랩스 이미지 스택과 함께 사전 활성화 및 사후 활성화 이미지를 엽니다. 이미지를 클릭하여 이미지를 단일 스택으로 결합 | 스택 | 도구 | 드롭다운메뉴에서 이미지를 연대순으로 선택합니다. 4D 이미지로 열기 옵션이 선택되지 않았는지 확인합니다. 결과 스택은 전체 이미지 집합입니다.
   8. 전체 이미지 세트에서8.1.4 단계를 반복한 다음 프로세스를 클릭하여 역게인 이미지로 결과를 나눕니다 | 이미지 계산기 및 분할을 작업으로 선택합니다. 이렇게 하면 각 이미지가 조명 분야와 검출기에서 균일하지 않은 것에 대해 수정된 수정된 전체 이미지 집합이생성됩니다.
2. 이미지 스택 정렬
   1. 스테이지 또는 샘플 드리프트로 인해 타임랩스 시리즈의 이미지 평면 의 정렬 불량을 수정하려면 플러그인을 클릭하여 고정 지역플러그인(보충 파일 1)으로 정렬을 설치 | 플러그인을 설치,플러그인 파일을 포함하는 폴더로 탐색하고 플러그인을 선택합니다. 플러그인을 설치 한 후 ImageJ를 다시 시작합니다.
      참고 :이 플러그인은 "최소 사각형 congealing"원칙^15에따라 이미지를 정렬합니다.
   2. 여러 축축에 걸쳐 각 축축 내의 활성화된 형광의 근위 및 단면 경계를 넘어 확장되지 않는 보정된 전체 이미지 세트에 ROI를 그립니다. 영역의 형상은 중요하지 않습니다.
   3. 플러그인을 클릭하여 정렬 플러그인을 실행 | 고정 된 영역에 의해 정렬. 플러그인은 프레임 사이의 변위에 기본 2 픽셀 최대값을 배치하지만 샘플의 상당한 드리프트가있는 경우 초기 팝업 창에서 조정할 수 있습니다. 선형은 이미지 스택의 크기에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
   4. 정렬된 스택을 시각적으로 검사하여 정렬 품질을 평가합니다. 자동화된 정렬이 프레임 간의 형광의 큰 변동에 대해 잘 작동하지 않을 수 있기 때문에 일부 프레임을 수동으로 정렬해야 할 수 있습니다. 이미지를 클릭하여 이동해야 하는 프레임을 보면서 이 작업을 수행할 수 있습니다| 변환 | 번역. 전체 스택을 번역해야 하는지 여부를 묻는 다음 팝업에서 아니요를 클릭합니다. 번역에서 정수 픽셀 값만 사용하고 픽셀 강도의 리샘플링으로 인해 일부 픽셀 이동 또는 보간이 데이터를 변경하므로 드롭다운 보간 메뉴가 없음으로설정되어 있는지 확인합니다.
   5. 정렬된 전체 이미지 집합으로 저장합니다.
3. 형광 강도 의 측정
   1. 활성화 된 영역의 한 가장자리를 따라 첫 번째 팔로 정렬 된 전체 이미지 세트의 첫 번째 프레임에 각도 도구를 사용하여 ROI를 그립니다, 축삭에 수직, 두 번째 팔 수직. 'm' 키를 눌러 시야의 축축의 방향을 설명하는 각도를 측정합니다.
   2. 분석/축소를 클릭하여 치수를 미크론으로 측정할 수 있도록 이미지의 배율을 설정 | 배율을 설정하고 적절한 값을 입력합니다.
   3. 분석 을 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다 | 도구 | ROI 매니저. 펄스 탈출 패러다임의 경우 8.3.7 단계로 건너뜁니다. 펄스 확산의 경우 8.3.4 단계를 계속합니다.
   4. 차원의 사각형 ROI를 그린 다음 편집을 클릭 | 선택 | 를 지정합니다. 배율 조정된 단위 옵션을 확인한 다음 ROI를 15μm 너비와 이미지 높이와 같거나 큰 높이로 설정합니다.
   5. 편집을 클릭하여 8.3.1 단계에서 측정된 각도로 ROI를 회전 | 선택 | 회전하여 축삭에 수직으로 만들고 활성화 된 영역의 근접 가장자리를 따라 ROI를 한쪽으로 놓습니다. 이 ROI를 추가하면 't' 키를 눌러 관리자에게 근위 가이드 ROI라고 합니다.
   6. ROI를 드래그하여 활성화된 영역의 단면 모서리에 맞춰 't' 키를 눌러 ROI 관리자에 다시 추가합니다. 우리는 이것을 단상 가이드 ROI라고 부를 것입니다. 근위 및 단부 가이드 ROI는 측면 측정 ROI를 그리는 데 나중에 사용됩니다.
   7. 위의 5.11 단계에서 획득한 타임랩스 이미지 시퀀스를 사용하여 정량화를 위해 축축을 선택합니다. 이 이미지 시퀀스는 축축의 약한 자동 불발성을 캡처하여 활성화 된 영역 외부에서 자신의 형태를 드러내기 때문에이 목적을 위해 유용합니다.
      참고: 다음 기준을 충족하지 않는 축축수는 분석에서 제외됩니다.
      1. 축축은 모든 측정 창의 전체 길이를 따라 초점을 맞추어야 합니다.
      2. 축축은 활성화 영역의 근해 및 단부 끝에 수직으로 5° 이내여야 합니다.
      3. 축축은 활성화 영역의 근위 및 단부 끝의 5μm 이내에 질이 없어야합니다.
      4. 이미징 과정에서 모양을 눈에 띄게 변경하는 축삭을 제외합니다.
      5. 이는 축착이 죽을 때 발생하는 활성형 형광의 확산 분산을 나타내기 때문에 사후 활성화이미지(도 2C,아래)에서 이산 활성화 영역의 부재에 의해 입증된 바와 같이 건강에 해로운 것처럼 보이는 축축을 제외한다.
   8. 축선 내의 자동 형광 구조물에 대해 5.5 단계에서 장노출 표백 이미지를 관찰하십시오. 이 형광은 미토콘드리아¹⁶내의 플라빈으로 인한 것이다. 이러한 미토콘드리아가 둥글거나 단편화된 경우 분석에서 축축을배제(도 2D,하단), 확장, 선형 구조(도2D,위), 이대사 감소의 표시로.
   9. 위에 생성된 근해 및 단층 가이드 ROI를 사용하여 분석되는 축축당 3개의 측정 ROI를 그립니다: 40 μm 활성화 영역 내의 축축을 포괄하는 중앙 창, 그리고 측면 창 15 μm ROI에 의해 구속된 너비가 있는 두 개의 측면 창과 활성화 영역의 축축의 직경에 의해 구속된 높이. ROI 관리자에 세 영역을 모두 추가합니다. 글리코리티억제축의 경우, 활성 영역의 중간에 5 μm 이하의 폭이 없고 축축외부로 확장되지 않는 단일 영역을 그립니다. 펄스 이스케이프 패러다임의 경우 활성화된 영역은 폭이 5μm에 불과하므로 전체 창을 사용해야 합니다.
   10. 8.3.7 단계 및 8.3.8 단계의 기준을 충족하는 모든 축에 대해 8.3.9 단계를 반복하십시오.
   11. 분석 을 클릭하여 활성 측정을 평균 픽셀 강도로 설정 | 측정값을 설정하고 평균 회색 값 옵션을 선택합니다. 다른 측정 옵션을 선택하지 않도록 합니다.
   12. 창을 선택하고 'Ctrl' + 'a'를 눌러 ROI 관리자 창의 모든 ROI를 선택합니다. ROI 관리자 창에서 더 많은 것을 클릭 | 형광 강도를 측정하기 위한 다중 측정값. 추가 분석을 위해 결과 창에서 스프레드시트에 데이터를 복사합니다.
   13. 분석 을 클릭하여 지역 영역으로 활성 측정 설정 | 측정값을 설정하고 영역 옵션을 선택합니다. 다른 측정 옵션을 선택하지 않도록 합니다.
   14. 반복 단계 8.3.12. 영역이 시간에 따라 달라지지 않으므로 해당 영역에 대한 결과의 행 을 복사하기만 하면 됩니다.

9. 포토블리치 수정

1. 글리코리티 억제축을 위한 데이터 스프레드시트에서, 주어진 ROI에 대해 프레임 3(첫 번째 타임랩스 프레임)에서 시작하는 각 프레임의 평균 형광으로부터 프레임 1(사전 활성화 프레임)의 평균 형광을 빼는다. 결과는 배경 빼기 수단입니다.
2. 데이터를 프레임 번호가 abscissa로 사용하여 분산플롯으로 플롯합니다. Ae-bx의 형태로 방정식과 각 ROI (대부분의 스프레드 시트 프로그램이이 기능을 가지고)의 데이터에 지수 추세선을^{맞춥니다.} 이 방정식은_F0이 타임랩스의 첫 번째 프레임에서 형광인 광표백 함수 F_t = F₀ *^e-tɣ, ɣ 지수 표백 속도, t는 시간이며, e는 천연 로가릿베이스이다.
3. 반복 단계 9.1.1-9.1.2 글리코리티 억제 신경에서 모든 축종의 모든 ROI에 대 한. 광표백 속도의 가장 정확한 추정을 위해, 적어도 5 개의 분리된 신경에서 총 15개의 축축을 사용하십시오. 모든 억제축축에서 기하급수적 표백속도(ɣ)의 평균을 사용하여 광표백을 위한 실험 데이터를 수정한다. photo표백은 이미지 획득 설정과 시간이 지남에 따라 변경될 수 있는 레이저 전원에 따라 달라지므로 각 실험 이나 연구에 대해 새로운 표백 보정을 수행해야 합니다.
4. 정상 식염수로 이미지된 축축의 모든 영역에 대해 9.1.1을 반복합니다(즉, 글리코리티로 억제되지 않음).
5. 각 데이터 포인트를^전자-tɣ나누어 t에 대한 시간과 9.1.3 단계에서 발견되는 평균 ɣ 사용합니다. 이들은 포토블리치 수정 수단입니다.
6. 관심 영역의 각 데이터 점을 곱하여 각 영역에서 각 영역의 총 형광을 찾을 수 있습니다.

결과

그림 3은 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 대표적인 이미지를 보여줍니다. ^,우리는 펄스 탈출 방법과 그 데이터^{5,,6,,7,8,17의}분석을위한 우리의 방법을 사용하여 얻은 데이터를 설명하는 여러 연구를 발표했다.⁸ 아래에서 펄스 확산 데이터가 이전에...

토론

주로 평평한 필드 보정, 이미지 정렬 및 표백제 교정 중에 후처리 중에 오류가 발생할 가능성이 크므로 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 분석에 주의를 기울여야 합니다. 평지 보정은 조명의 비 균일성을 보정하는 데 필요하며, 이로 인해 중심에서 주변까지 시야 를 가로질러 강도가 떨어집니다. 비균일성의 정도는 파장에 의존하므로, 항상 실험 데이터를 획득하는 데 사용되는 파장에서 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors