切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

要約

光活性化可能なニューロフィラメントタンパク質を発現するトランスジェニックマウス由来の末梢神経の単一ミリン化軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析する蛍光光活性化法について説明する。

要約

ニューロフィラメントタンパク質ポリマーは、軸索輸送の遅い成分の軸索に沿って、平均速度が0.35~3.5mm/日で移動します。最近まで、この動きの研究は、放射性同位体パルス標識を使用してのみ可能でした, これは、日の時間分解能とミリメートルの空間分解能と神経全体の軸索輸送の分析を可能にします.より高い時間的および空間的分解能を有するインサイチュにおけるニューロフィラメント輸送を研究するために、ニューロンにおける光活性化可能なGFPでタグ付けされたニューロフィラメントタンパク質Mを発現するhThy1-paGFP-NFMトランスジェニックマウスを開発した。ここでは、これらのマウス ex vivoから脛骨神経の単一のミリン化軸索における神経フィラメント輸送を解析するための蛍光光活性化パルスエスケープおよびパルス拡散法について説明する。単離された神経セグメントは、酸素化生理食類を灌流することにより顕微鏡ステージ上に維持され、ディスク共焦点蛍光顕微鏡を紡糸することによって画像化される。バイオレットライトは短軸窓で蛍光を活性化するために使用されます。活性化領域と横回し領域の蛍光は時間の経過とともに分析され、分およびミクロンのオーダーで時間的および空間的解像度を伴うニューロフィラメント輸送の研究が可能になる。数学的モデリングは、結果データから速度、方向バイアス、一時停止行動を含むニューロフィラメント輸送の運動パラメータを抽出するために使用できます。パルスエスケープ法およびパルス拡散法は、他の神経におけるニューロフィラメント輸送を可視化するためにも適応することができる。追加のトランスジェニックマウスの開発により、これらの方法は、軸索中の他の細胞骨格および細胞質タンパク質の軸索輸送を画像化し、分析するためにも使用することができる。

概要

ニューロフィラメントの軸索輸送は、1970年代にラジオアイソトピックパルス標識¹によって初めて実証された。このアプローチは 、インビボでのニューロフィラメント輸送に関する豊富な情報を生み出したが、空間的および時間的解像度が比較的低く、通常はミリメートルと最高の日の順序で^2.また、ラジオアイソトピックパルス標識は、単一の時間経過を生成するために複数の動物の注入と犠牲を必要とする間接的なアプローチです。1990年代に蛍光タンパク質の発見と蛍光顕微鏡の進歩により、その後、培養ニューロン内のニューロフィラメント輸送を数秒または数分の時間スケールで直接画像化し、マイクロメートル以下の空間分解能を用いて、動きのメカニズムに関するより大きな洞察を得る^{ようになりました3。}これらの研究は、軸索中のニューロフィラメントポリマーが微小管運動タンパク質によって推進される微小管トラックに沿って前向きおよび逆行方向の両方で迅速かつ断続的に移動することを明らかにした。しかし、ニューロフィラメントは直径わずか10nmの回折限定構造であり、通常は数十ナノメートルの間だけ隣人と離れている。したがって、ポリマーは、移動ポリマーが隣人から解決できるように、まばらに分布した神経フィラメントを含む培養ニューロン内でのみ追跡することができる^4。したがって、現在では、ミエリン軸索のような豊富なニューロフィラメントポリマーを含む軸索中の単一の神経フィラメントを追跡することは不可能である。

蛍光顕微鏡を用いた神経フィラメント豊富軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析するために、培養神経細胞^,4,5における神経フィラメントの長期休止挙動を研究するために開発した蛍光光活性化パルスエスケープ法を用いた。⁴光活性化可能な蛍光ニューロフィラメント融合タンパク質でタグ付けされたニューロフィラメントは、軸索の短いセグメントで活性化され、その後、活性化領域からのそれらのフィラメントの出発速度は、時間の経過に伴う蛍光の減衰を測定することによって定量化されます。このアプローチの利点は、個々のニューロフィラメントポリマーの動きを追跡することなく、数分または数時間の時間スケールで適用することができるニューロフィラメント輸送の集団レベルの分析であるということです。例えば、この方法を用いて、ミエリン化培養6におけるニューロフィラメント輸送の運動を^{分析した。}

最近、ヒトニューロン特異的Thy1プロモーター⁷の制御下にあるニューロンにおいて、paGFPタグ付きニューロフィラメントタンパク質M(paGFP-NFM)の低レベルを発現するhThy1-paGFP-NFMトランスジェニックマウスの開発について説明した。このマウスは蛍光顕微鏡を用いたその場所でのニューロフィラメント輸送の分析を可能にする。本稿では、2つのアプローチを用いて、これらのマウスから脛骨神経のミエリン軸索におけるニューロフィラメント輸送を分析するための実験的アプローチについて述べた。これらのアプローチの最初は、上記のパルスエスケープ方式です。この方法は、ニューロフィラメントの一時停止挙動に関する情報を生成することができるが、フィラメントが活性化領域を出発する方向に盲目であり、したがって正味方向および輸送速度⁸の測定を可能にしない。第2のアプローチは、活性化領域からの蛍光の損失だけでなく、蛍光フィラメントが前向きおよび逆行方向の両方で活性化領域を出発する際に蛍光が移動する2つの側面窓における蛍光の一過性増加を分析する新しいパルス拡散法である。どちらのアプローチでも、測定窓における蛍光変化の数学的分析とモデリングを用いて、平均速度、正味方向性および一時停止行動などのニューロフィラメント輸送のパラメータを得ることができる。 図 3 は、これら 2 つのアプローチを示しています。

このプロトコルは、神経の解剖および調製、paGFP蛍光の活性化および画像化、およびImageJ⁹のFIJI配布パッケージを用いて取得した画像からのニューロフィラメント輸送の定量を示す。それは長い(数cm)であり、分岐しないので、私たちは脛骨神経を使用します。しかし、原理的にpaGFP-NFMを発現する神経は、軸索を損傷することなく解剖し脱整えることができる場合、この技術で使用するのに適している。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、オハイオ州立大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 神経生理液の調製

1. ブロイアーの生理食音¹⁰の100 mLを作る:98 mM NaCl、1 mM KCl、2 mM KH₂PO_4、1mM MgSO 4、1.5 mM CaCl_2、5.6%D-グルコース、23.8 mM NaHCO₃を二重蒸留水で。₄
2. 95%の酸素/5%炭酸ガス(カルボゲン)を使用前に少なくとも30分間、生理食液を通して泡立てます。残った生理的な生理物は1週間以内に再利用できます。ただし、各使用前に再酸素化する必要があります。
3. 60 mLのシリンジに酸素化した生理食音を注ぎ、シリンジに残っている空気が最小限であることを確認します。

2. 神経灌流室の初期集合

1. 図1Aに示すように、シリンジとチューブを接続し、流出管を廃棄物フラスコに入れます。
2. 外側のガスケットを灌流室ハウジングに入れ、フロー入口と出口ポストがガスケットの穴に合わせられるようにします。
3. 内側のガスケット(シリコーン、厚さ100μm)を#1.5円形カバースリップ(直径40mm)に置き、ガスケットのシワを慎重に平滑化して密閉します。後で組み立てやすくするために、ペーパータオルの上にカバースリップとガスケットを置くか、ガスケットを上に向けて拭きます。

3. マウス脛骨神経の解剖と準備

1. 二酸化炭素吸入または別の制度的に承認された方法によって動物を犠牲にする。実験は犠牲⁷の3時間以内に行われなければならないので、動物が動き/呼吸を停止したときにタイマーを開始します。
2. 毛皮に70%のエタノールをスプレーし、電気カミソリを使用して動物の足からできるだけ取り除き、戻ります。
3. 大きな解剖はさみを使用して、背骨の真ん中付近の皮膚に背部切開を行い、動物の腹側の側面の周りに切り傷を続ける。このカットから始めて、筋肉からそっと引き離し、筋膜を切断することによって、脚からゆっくりと皮膚を反射します。
4. 動物を解剖トレイの上の上の上の上の上に置き、4つの足をすべてピン留めします。必要に応じて、さらに動きを減らすために尾を固定します。
5. マイクロディションハサミを使用して、尾と膝の中間の太ももの筋肉を切開して坐骨神経を露出させます。筋肉を通して見える神経が切れないようにしてください。
6. 筋肉を取り除くために、心筋と腹腔内の切開を延長します。同様に、ふくらはぎの筋肉を取り除き、神経を傷つけることを避けるために切り傷を浅く短く保ちます。
7. 脛骨神経が坐骨神経(膝)からかかとに分岐する点から完全に露出するまで筋肉を取り除く(図2A)。
   注:脛骨神経の解剖を含む、および続くすべてのステップでは、神経中のpaGFPの可能な偶発的な活性化を最小限に抑えるために、周囲光への不必要な暴露を避けてください。
8. 脊椎近位端の脛骨神経を鉗子でつかみ、マイクロディクショレンハサミを使って神経を切る。神経に緊張を入れないように注意し、筋肉から離れて持ち上げ、添付ファイルを切断します。
9. 脛骨神経の背骨遠端を切り取り、室温酸素化生理食前の小さなペトリ皿に移します。手順のこの時点から、常に神経の近位および遠位の端を追跡することを確認してください。
   注: これを行う 1 つの方法は、テーパが見えるように斜めのカットで神経の遠位の端をマークします。
10. 神経の近位端から始めて、露出した軸索の端を非常に細かい鉗子でそっとつかむ。
11. 鉗子の第二のペアで、近位の神経鞘をつかみ、ゆっくりと神経の遠位の端に向かって引っ張る。神経鞘は、最小限の抵抗で軸索に沿ってスライドします。このプロセス中に過度の緊張が神経に適用されないようにしてください。

4. 最終神経灌流チャンバーアセンブリ

1. 神経の近位端をつかんで、生理食布地から取り出し、内側のガスケットの長方形の開口部内の灌流室のカバースリップにゆっくりと置き、まっすぐに横たわるように神経に穏やかな緊張を保つ。
2. 神経に面した溝のある側で、神経の上にマイクロ水道管スライドを置き、そして、神経に平行に流れる方向を置きます。カバースリップとマイクロ水道アセンブリを裏返し、外側のガスケットに割り当てるマイクロ水道管スライドで灌流室ハウジング内に置きます。神経と周囲の内部ガスケットは、カバースリップとガスケットで分離されたマイクロ水道スライドの間に挟まれ、カバースリップは上向きです(図1B)。
3. 金属ハウジングに入れ、ロックリングを回転させることで、灌流チャンバーを固定します。プラスチックハウジングがすべての金属クリップの下にあることを確認し、生理食動物の漏れを防ぐためによく締めます。過度に締め付けは、マイクロ水道のスライドやカバースリップをクラックすることができます。カバースリップが下向きになるようにチャンバーをひっくり返します。
4. 生理食糸注射器プランジャーをゆっくりと落ち込ませ、灌流チャンバーを満たします。インレットと出口チューブ、アウトレットフラスコ、シリンジを常に設定とイメージング中にチャンバー自体の上に高く保ちます。これは、気泡を導入したり、チャンバー内の負圧による焦点不安定を引き起こす可能性のあるサイフォンを回避します。
5. 灌流アセンブリを反転した顕微鏡ステージに移し、シリン注射器をシリンジポンプに取り付けます。0.25 mL/minの流量に適した速度でモータを始動します。次に、37 °Cに設定されたインラインソリューションヒーターを接続してオンにします。
6. 目的ヒーターを接続し、37°Cに設定し、目的に油を適用し、ステージマウントに灌流チャンバーを挿入します。
7. チャンバーヒーターパッドにオイルを塗布し、灌流室に取り付けます。チャンバーヒーターを接続してオンにします。37 °Cに設定します。
   注:温度の変化は、溶液の外気のために灌流チャンバに泡を形成する可能性があります。気泡が形成された場合は、泡がチャンバーをクリアするまで溶液の流量を5〜10倍に簡単に増やします。
8. 灌流チャンバをステージアダプターにロックし、目的のオイルをチャンバーの下側のカバースリップに接触させる。
   注:ここで使用するASIステージアダプタを備えたBioptechsチャンバーは、逆顕微鏡構成用に設計されています。

5. 蛍光活性化と画像取得

1. 明視野照明を使用して、カバースリップ表面に最も近い神経の底面の軸索の層に焦点を当てる(図2B)。ミエリー化軸索(通常、成体マウスの直径1〜6μm)は、コントラスト強化なしに明視野透過光照明下で可視であるミエリン鞘の存在によって識別することができる。シュミット・ランターマン裂け目とランヴィエのノードも容易に明らかである。非髄色の軸索はより細く(通常は<1 μmの直径)、一般的にバンドル(Remakバンドル)に存在し、一般的に互いに解決するにはあまりにも密接にアポスされています。
2. 顕微鏡で利用可能な場合は、タイムラプスイメージングの過程で焦点を維持するためにオートフォーカスシステムをアクティブにします。
3. 明視野参照画像を取得します。画像に対する神経の向き(脊椎近位および遠位端)を記録します。
4. 488 nmレーザーを用いた共焦点像とpaGFPに適した発光フィルタ(例えば525/50nm)を取得し、漂白前自家蛍光を記録します。レーザーパワーを低く抑え、光の消光を最小限に抑え、かすかな信号を検出するために露出時間を調整します。例として、代表的なデータは、5%のレーザーパワーと4s露光で取得した。今後のすべての実験で使用するために取得設定を記録します。
   注:光の活性化後、理想的なイメージング設定では、20枚の画像の間に、信号対雑音比>8と元の信号の25%未満の光の点滅が生成されます。軸索は、当初⁷のように広視野発蛍光顕微鏡で画像化することもできますが、共焦点性の欠如により画質が劣ります。
5. レーザーパワーを通常の5倍程度の撮影電力に設定し、3~4分の露光時間で画像を取得します。必須ではありませんが、このステップは、バックグラウンドシグナルを低減し、光活性化蛍光の信号対雑音を最大化するために、自己蛍光および望ましくない蛍光の他のソースを漂白することをお勧めします。
6. この漂白ステップの後に、起動前の自己蛍光を記録するためにステップ5.4で使用される設定で画像を取得します。
7. 明視野のイメージで、目的のアクティベーションウィンドウサイズと等しい長さの軸索に平行な線を描きます。このウィンドウの長さは、実験の目標とパラメータによって異なりますが、パルスエスケープパラダイムの場合は通常の長さは5μm、パルス拡散パラダイムの場合は40μmです。
8. この線をガイドとして使用して、軸索に対して垂直な視野をまたぐ長方形の領域(ROI)を描きます。領域は、光活性化されるすべての軸索を包含する必要があります。
9. 405 nm照明で光活性化に最適な設定を決定します。
   注: 最初の実験的なアクティベーションの前に、このステップとサブステップのみを実行してください。実験の過程で、同じ写真の活性化設定を使用する必要があります。
   1. 405nmレーザーラインを使用して目的領域を繰り返し活性化し、低レーザーパワー(例えば、5%)、およびピクセルドウェル時間(例えば、40μs)、および1パルスを、各活性化後に活性化されたGFP蛍光の画像を取得する。蛍光が増えなくなるまで繰り返し、各画像の対象領域で蛍光を定量化します。
   2. 平均蛍光強度とパルス数をプロットします。蛍光が増加しなくなった後のパルス数を、活性化のための最適なパルス数として選択します。
10. 405 nm光によるパターン励起により、ステップ5.8で描かれた領域のpaGFP蛍光を活性化します。イメージがアクティベーションの直前に取得され、アクティベーションの直後に取得されていることを確認します。
    注:理想的なpaGFP活性化はROI内に含まれる鋭い境界を有する蛍光の明確に定義された領域を生成する。
11. アクティベーションが完了したら、1分間のタイマーを開始します。1分の終わりに、タイムラプスシリーズの取得を開始します。
    注:1分の遅延は、paGFP¹¹の光活性化後に観察される蛍光の増加を可能にするために必要です。パルス拡散法では、30秒のタイムラプス間隔を持つ5〜10分の取得期間で、中央および側面の窓の初期傾斜角を測定して速度と方向性を測定するのに十分です。パルスエスケープ法の場合、5分または10分のタイムラプス間隔で30〜150分の取得期間を使用すると、フィラメントの長期休止行動の分析が可能
12. 取得したすべての画像と、蛍光活性化に使用されるROIを保存します。
13. 神経の新しい領域に移動し、手順 5.1 から 5.11 を繰り返します。新しい領域が同じ軸索に沿っている場合、他の活性化領域から移動した蛍光神経フィラメントの検出を避けるために、以前活性化された領域から少なくとも500 μmである必要があります。最終タイムラプスの取得は、3時間のウィンドウの終了前に終了する必要があります。
    注:準備が3時間以上有効である可能性がありますが、確認していません。熟練した解剖および準備により、この3時間のウィンドウ内で5〜8個の10分間のタイムラプス画像セットが取得される可能性があります。
14. 最終的なタイムラプス画像系列が取得された後、生理食物の流れを停止し、溶液とチャンバーヒーターを切断し、顕微鏡ステージから灌流装置を取り外します。

6. フラットフィールドとダークフィールド画像の取得

1. 250mgのフルオレセインパウダーを0.5mLの二重蒸留水に加えて、フルオレセインの溶液を作ります。目に見える粒子がなくなるまで混ぜ、卓上遠心分離機で30秒間溶液を回転させて、溶解していない材料を沈下させます。この溶液は光の露出から保護される場合4 °Cで数ヶ月間保存することができる。
2. 8 μLのフルオレセイン溶液をスライドに加え、#1.5カバースリップを塗布します。余分な液体をブロットし、マニキュアで密封し、乾燥させます。
   注:この高濃度では、フルオレセイン色素の強い吸収は溶液内の照明ビームを消し、急速な拡散交換¹²による光漂白に対して均一かつ耐性のあるカバースリップの表面で蛍光の薄い面を生成する。
3. 蛍光スライドのカバースリップ側を反転した顕微鏡ステージに下に置き、カバースリップの表面の蛍光の薄い面に焦点を合わせます。スライドの周囲を移動して、気泡(暗い斑点)や大きなフルオレスセイン粒子(明るいスポット)を含まない視野を見つけます。
4. 中央の画像が元のフォーカスプレーンになるように、0.2 μm間隔で6 μmに及ぶZスタックを取得します。蛍光は非常に明るくなるので、短時間の暴露時間(例えば、40ミリ秒)を使用してください。このzスタックの取得は、カバースリップが完全に水平になることはめったになく、蛍光の面が非常に狭いため、視野全体で最大蛍光を捕捉するために必要です。この操作を繰り返して、合計 25 の視野で、フィールド間の任意の方向にステージを少なくとも 20 μm 移動します。
5. カメラのシャッターを含むすべてのライトパスシャッターを閉じ、レーザーパワーと露出時間をゼロに設定します。これらの設定で100枚の画像のスタックを取得します。これらの画像は、ダークフィールド画像を生成するために平均化され、カメラチップの暗電流とバイアスオフセットを補正するために使用されます。
   注: ストリーミング取得は、これらの画像をキャプチャする理想的な方法です。

7. 漂白剤補正のための神経を解答的に阻害した画像化

1. ステップ1のように生理食前の溶液を作り、酸素化する。しかし、D-グルコースに対して2-デオキシD-グルコースを置換し、0.5 mMヨードアセテートナトリウムを添加して解糖¹³を阻害する。これを「阻害生理活性」と呼んでいます。
2. 抑制生理生理活性を使用して、ステップ5.11に設定された10〜30分のタイムラプス画像を使用して、ステップ2〜5を繰り返します。神経フィラメント輸送の完全な阻害を確実にするために、イメージングの前に阻害生理液を塗布した後40〜50分を許可する。
   注:解糖阻害は最終的に軸索を殺すので、阻害後の狭い時間枠があり、通常は約30分です。代謝抑制のレベルの指標は、axonalミトコンドリアのフラビン自己蛍光であり、paGFP蛍光¹⁴を画像化するために使用する長時間露光のためにタイムラプスシリーズで検出することができる。典型的には、ミトコンドリア自己蛍光は、阻害生理的な生理学による治療中に増加する。ミトコンドリアが切り上げまたは断片化し始めた場合は、イメージングを中止します。

8. ImageJを用いた画像処理と解析

1. フラットフィールドとダークフィールド補正
   1. ダークフィールドイメージスタックを開き、[画像] メニューの [画像] をクリックして画像の平均を 取得します。スタック |Z プロジェクト を選択し、ドロップダウン メニューで [平均強度 ] を選択して 、ダークフィールド イメージを生成します。
   2. フルオレセイン フラットフィールド イメージ スタックを開き、[ イメージ |スタック |Z プロジェクト を選択し、ドロップダウン メニューで [最大強度 ] を選択します。
   3. [イメージ | スタック |スタックするイメージ。 [イメージ|スタック |Z プロジェクト を選択し、ドロップダウン メニューから 平均強度 を選択して フラットフィールド イメージを生成します。
   4. [プロセス ] をクリックしてフラットフィールド イメージからダークフィールド イメージを引きます 。イメージ計算機で、演算として [減算 ] を選択します。 32 ビット (浮動小数点) 結果 オプションがチェックされていることを確認します。結果は 、修正されたフラットフィールドイメージになります。
   5. 最初に [分析] をクリックして、修正したフラットフィールド イメージのピクセルの平均強度 を測定する |[測定値] を設定 し、[ 平均グレー 値] ボックスをオンにして、'm' キーを押します。
   6. [プロセス ] をクリックして、修正したフラットフィールド イメージを平均強度で割ります 。数学 |ステップ 7.1.5 で得られた平均グレー値を分割して入力します。逆 ゲイン イメージが生成されます。
   7. タイムラプスイメージスタックと共に、起動前およびアクティベーション後の画像を開きます。[イメージ] をクリックして画像を 1 つのスタックに結合 する |スタック |ツール |を連結し、ドロップダウンメニューから時系列で画像を選択します。 [4D 画像として開く ] オプションが選択されていないかどうかを確認します。結果のスタックは 、完全なイメージ セットです。
   8. フルイメージセットでステップ 8.1.4 を繰り返し、結果を逆ゲイン画像で除算するには、[プロセス |画像計算機を選択し、操作として除算を選択します。これにより、各画像が照明分野および検出器上の不均一性に対して補正されたフルイメージセットが生成されます。
2. 画像スタックの配置
   1. ステージまたはサンプルドリフトによるタイムラプスシリーズのイメージプレーンのずれを修正するには、[プラグイン] をクリックして 固定領域 プラグイン (補足ファイル 1)による配置 をインストールします。PlugInをインストールし、プラグインファイルを含むフォルダに移動し、プラグインを選択します。プラグインをインストールした後、ImageJ を再起動します。
      注:このプラグインは、「最小二乗」の原則¹⁵に基づいて画像を整列させます。
   2. いくつかの軸索にまたがり、各軸索内の活性化蛍光の近位および遠位境界を越えて伸びない 補正されたフルイメージセット にROIを描画します。領域のジオメトリは重要ではありませんが、構造の形状やサイズが変化すると位置合わせが改善される領域は除外されます。
   3. [プラグイン] をクリックしてアライメント プラグインを実行する |固定領域による整列:プラグインはフレーム間の変位にデフォルトの 2 ピクセルの最大値を設定しますが、サンプルの有意なドリフトがある場合は、初期ポップアップウィンドウで調整できます。イメージ スタックのサイズによっては、配置に数分かかる場合があります。
   4. 整列されたスタックを視覚的に検査して、整列の品質を評価します。自動アライメントはフレーム間の蛍光の大きな変動に対してうまく機能しない可能性があるため、一部のフレームは手動で調整する必要があります。これは、[ イメージ |変換 |翻訳.次のポップアップで[ いいえ ]をクリックし、スタック全体を変換するかどうかを尋ねられます。ピクセルのピクセル値のリサンプリングによって小数のピクセルシフトまたは補間がデータを変更するため、変換に整数ピクセル値のみを使用し、ドロップダウン補間メニューが Noneに設定されていることを確認します。
   5. これを整列フルイメージセットとして保存します。
3. 蛍光強度の測定
   1. アクティブ領域の 1 つのエッジに沿って、軸索に垂直、2 番目のアームを垂直に沿って最初の腕で 設定した、位置合わせフル イメージ の最初のフレームに対して[角度]ツールを使用して ROI を描画します。'm' キーを押して、視野の軸索の方向を示す角度を測定します。
   2. [分析] をクリックして、画像のスケールをミクロン単位で測定するように設定します。スケールを設定し、適切な値を入力します。
   3. [分析] をクリックして ROI マネージャを開きます 。ツール |ROI マネージャー.パルスエスケープパラダイムの場合は、ステップ 8.3.7 に進みます。パルス拡散の場合は、ステップ 8.3.4 に進みます。
   4. 任意の寸法の四角い ROI を描画し、[編集] をクリックします。選択 |を指定します。[スケール単位]オプションがオンになっていることを確認し、ROI を 15 μm の幅と高さがイメージの高さ以上に設定します。
   5. ステップ 8.3.1 で測定した角度で ROI を回転するには、[ 編集] をクリックします。選択 |回転 して軸索に垂直にし、アクティブ領域の近位エッジに沿って片側の ROI を配置します。この ROI を、近位ガイド ROI と呼ぶ場合は、't' キーを押してマネージャーに追加します。
   6. アクティブ領域の遠位エッジに合わせて ROI をドラッグし、't' キーを押して ROI マネージャに再度追加します。これは遠位ガイド ROI と呼ぶ。近位および遠位ガイドROIは後で、隣接する測定ROIを描くために使用されます。
   7. 上記のステップ5.11で取得したタイムラプス画像シーケンスを使用して、定量する軸索を選択します。この画像シーケンスは、軸索の弱い自己蛍光を捕捉し、活性化領域の外側の形態を明らかにするので、この目的に役立ちます。
      注: 次の基準を満たさない軸索は、解析から除外されます。
      1. 軸索は、すべての測定ウィンドウの全長に沿って焦点を合わせる必要があります。
      2. 軸索は、活性化領域の近位および遠位端に対して垂直の5°以内になければなりません。
      3. 軸索は、活性化領域の近位および遠位端の5μm以内に内径を有してはならない。
      4. イメージングの過程で目に見えて形状を変化させる軸索を除外します。
      5. これは、アクソンが死んだときに起こる活性化蛍光の拡散分散を示すものであるため、活性化後の画像(図2C、下部)に離散活性化領域がないことによって証明されるように異常に見える軸索を除外する。
   8. 軸索内の自己蛍光構造に対して、ステップ5.5からの長時間露光漂白画像を観察します。この蛍光はミトコンドリア¹⁶内のフラビンによるものである。これらのミトコンドリアが丸みを帯びたまたは断片化しているように見える場合(図2D、下)、拡張された直線的な構造(図2D、上)とは対照的に、分析から軸索を除外します。
   9. 上記で作成した近位ガイドと遠位ガイドROIを使用して、分析中の軸索ごとに3つの測定ROIを描きます:40μm活性化領域内の軸索を包含する中央窓と、活性化領域の境界で軸索の直径によって制約される側面窓15μm ROIと高さによって制約される幅を持つ2つの側面窓。3 つの地域をすべて ROI マネージャに追加します。分解的に阻害された軸索の場合、活性化領域の中央に幅5μm以下で、軸索の外側に伸びない単一領域を描きます。パルスエスケープパラダイムの場合、活性化領域の幅はわずか5μmなので、ウィンドウ全体を使用する必要があります。
   10. ステップ 8.3.7 および 8.3.8 の基準を満たすすべての軸索について、ステップ 8.3.9 を繰り返します。
   11. [分析] メニューの [分析] をクリックして、アクティブな測定をピクセルの平均強度に設定します 。[測定値] を設定 し、[ グレーの平均値 ] オプションを選択します。他の測定オプションがチェックされていないことを確認します。
   12. [ROI マネージャ]ウィンドウで[Ctrl]+[a]を押して、すべてのROIを選択します。[ROI マネージャ]ウィンドウで、[ 詳細] をクリックします。 蛍光強度を測定するマルチメジャー。結果ウィンドウからスプレッドシートにデータをコピーして、さらに分析します。
   13. [分析] をクリックしてアクティブな計測値を領域領域に設定する |[計測値] を設定 し、[ 面積 ] オプションを選択します。他の測定オプションがチェックされていないことを確認します。
   14. ステップ 8.3.12 を繰り返します。エリアは時間によって変化しないため、エリアの結果の 1 行だけをコピーする必要があります。

9. フォトブリーチ補正

1. 糖分解的に阻害された軸索のデータスプレッドシートでは、所定のROIのフレーム3(最初のタイムラプスフレーム)から始まる各フレームの平均蛍光からフレーム1(プレ活性化フレーム)の平均蛍光を差し引きます。結果は 、背景を減算した平均です。
2. このデータを、横軸としてフレーム番号を使用して散布図としてプロットします。指数近似曲線を、各 ROI のデータに適合します (ほとんどのスプレッドシート プログラムはこの関数を持ちます) Ae^-bxの形式の数式を使用します。この式は、Ft=F0*e-tɣのフォト₀ブリーチ関数^-tɣと同等であり_t、F0はタイムラプスの第1フレームにおける蛍光であり、ɣは指数的な漂白速度、tは時間、eは自然対数基底値である。
3. 解答性抑制神経のすべての軸索のすべてのROIについて、ステップ9.1.1~9.1.2を繰り返します。光の切開率の最も正確な推定値を得る場合は、少なくとも5つの別々の神経から合計で少なくとも15軸索を使用してください。すべての阻害軸索からの指数漂白率(ɣ)の平均を使用して、フォトブリーチングの実験データを修正します。フォトブリーチは画像取得の設定とレーザーパワーに依存するため、時間の経過とともに変化する可能性があるため、実験または研究ごとに新しい漂白キャリブレーションを実行する必要があります。
4. 正常な生理食糸で画像化された軸索のすべての領域(すなわち、解糖的に阻害されない)について、ステップ9.1.1を繰り返します。
5. t の時間と、ステップ 9.1.3 で見つかった平均ɣを使用して、各データポイントを e^-tɣで除算します。これらは フォトブリーチ補正手段です。
6. 各データポイントに対象領域の面積を掛けると、その地域の 蛍光の合計 が毎回見つかります。

結果

図3は、パルスエスケープおよびパルス拡散実験の代表的な画像を示しています。パルスエスケープ法を用いて得られたデータと、それらのデータ^{5、6、7、8、176,7}の⁵分析方法を用いて得られたいくつかの研究^,8を17発表しました。以下に、これまで?...

ディスカッション

後処理時に、主にフラットフィールド補正、画像アライメント、漂白剤補正の間に誤差が導入される可能性が大きいため、パルスエスケープおよびパルス拡散実験の分析には注意が必要です。フラットフィールド補正は、照明の不均一性を補正するために必要であり、その結果、中心から周辺までの視野全体の強度が低下します。不均一性の程度は波長依存であり、したがって、常に実験デ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Round Gasket w/ Holes	Bioptechs	1907-08-750	outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	dissection dishes
40mm round coverslips	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecting pins	Fine Science Tools	26001-70
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-30	fine tipped forceps
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Dissection pan with wax	Ginsberg Scientific	568859
Dissection scissors	Fine Science Tools	14061-09	initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	060319-2-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20	initial dissection forceps
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	for fluorescein slide
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective heater system	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Potassium chloride	Fisher	P217
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium iodoacetate	Sigma-Aldrich	I2512
Syringe pump	Sage Instruments	Model 355
Tubing adapter - female	Small Parts Inc.	1005109
Tubing adapter - male	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors