Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول ملخصا مفصلا لاستراتيجيات تلقيح جذور النباتات بالميكروبات التي تنقلها التربة. مثال على الفطريات Verticillium longisporum و Verticillium dahliae ، يتم وصف ثلاثة أنظمة عدوى جذرية مختلفة. يتم تسليط الضوء على التطبيقات المحتملة والتحليلات النهائية المحتملة ، وتناقش المزايا أو العيوب لكل نظام.

Abstract

يضم الريزوسفير مجتمعا ميكروبيا شديد التعقيد حيث يتم تحدي جذور النباتات باستمرار. الجذور على اتصال وثيق مع مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة ، ولكن الدراسات حول التفاعلات التي تنقلها التربة لا تزال وراء تلك التي أجريت على الأعضاء فوق سطح الأرض. على الرغم من أن بعض استراتيجيات التلقيح لإصابة النباتات النموذجية بمسببات الأمراض الجذرية النموذجية موصوفة في الأدبيات ، إلا أنه لا يزال من الصعب الحصول على نظرة عامة منهجية شاملة. لمعالجة هذه المشكلة ، يتم وصف ثلاثة أنظمة تلقيح جذرية مختلفة بدقة يمكن تطبيقها لاكتساب رؤى ثاقبة في بيولوجيا تفاعلات الجذر والميكروبات. وللتوضيح، استخدمت أنواع Verticillium (أي V. longisporum و V . dahliae) كمسببات أمراض نموذجية غازية للجذور. ومع ذلك ، يمكن تكييف الطرق بسهولة مع الميكروبات الأخرى الاستعمارية الجذرية - المسببة للأمراض والمفيدة على حد سواء. من خلال استعمار نبات xylem ، تظهر الفطريات التي تنقلها التربة الوعائية مثل Verticillium spp. أسلوب حياة فريد. بعد غزو الجذر ، تنتشر عبر أوعية xylem acropetally ، وتصل إلى تبادل لاطلاق النار ، وتثير أعراض المرض. تم اختيار ثلاثة أنواع نباتية تمثيلية كمضيفين نموذجيين: Arabidopsis thaliana ، اغتصاب البذور الزيتية المهم اقتصاديا (Brassica napus) ، والطماطم (Solanum lycopersicum). يتم إعطاء بروتوكولات خطوة بخطوة. يتم عرض النتائج التمثيلية لاختبارات الإمراض ، والتحليلات النسخية لجينات العلامات ، والتأكيدات المستقلة بواسطة تركيبات المراسلين. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة مزايا وعيوب كل نظام تطعيم بدقة. يمكن أن تساعد هذه البروتوكولات المثبتة في توفير مناهج لأسئلة البحث حول التفاعلات بين الجذور والميكروبات. إن معرفة كيفية تعامل النباتات مع الميكروبات في التربة أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات جديدة لتحسين الزراعة.

Introduction

يسكن التربة الطبيعية عدد مذهل من الميكروبات التي يمكن أن تكون محايدة أو ضارة أو مفيدة للنباتات1. العديد من مسببات الأمراض النباتية تنتقل عن طريق التربة ، وتحيط بالجذور ، وتهاجم العضو تحت الأرض. تنتمي هذه الكائنات الحية الدقيقة إلى مجموعة واسعة من الكلاديس: الفطريات ، oomycetes ، البكتيريا ، الديدان الخيطية ، الحشرات ، وبعض الفيروسات 1,2. بمجرد أن تفضل الظروف البيئية العدوى ، ستصبح النباتات المعرضة للإصابة بالمرض وتنخفض غلة المحاصيل. وستؤدي آثار تغير المناخ، مثل الاحترار العالمي والظواهر الجوية المتطرفة، إلى زيادة نسبة مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة3. لذلك ، سيصبح من المهم أكثر فأكثر دراسة هذه الميكروبات المدمرة وتأثيرها على إنتاج الأغذية والأعلاف ، ولكن أيضا على النظم الإيكولوجية الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تبادلات ميكروبية في التربة تتفاعل بإحكام مع الجذور وتعزز نمو النبات وتطوره ومناعته. عند مواجهة مسببات الأمراض ، يمكن للنباتات تجنيد خصوم محددين بنشاط في الريزوسفير الذي يمكن أن يدعم بقاء المضيف عن طريق قمع مسببات الأمراض4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن التفاصيل الميكانيكية والمسارات المشاركة في التفاعلات المفيدة بين الجذر والميكروبات غالبا ما تكون غير معروفة6.

لذلك ، من الضروري توسيع الفهم العام للتفاعلات بين الجذر والميكروبات. تعد الطرق الموثوقة لتلقيح الجذور بالكائنات الحية الدقيقة التي تنقلها التربة ضرورية لإجراء دراسات نموذجية ونقل النتائج إلى التطبيقات الزراعية. تتم دراسة التفاعلات المفيدة في التربة ، على سبيل المثال ، مع Serendipita indica (المعروفة سابقا باسم Piriformospora indica) ، أو Rhizobium spp. المثبتة للنيتروجين ، أو الفطريات الفطرية ، في حين أن مسببات الأمراض النباتية المعروفة التي تنقلها التربة تشمل Ralstonia solanacearum ، Phytophthora spp. ، Fusarium spp. ، و Verticillium spp.1. الأخيران هما أجناس فطرية موزعة عالميا وتسبب أمراض الأوعية الدموية2. يمكن أن يصيب Verticillium spp. (Ascomycota) مئات الأنواع النباتية - إلى حد كبير ثنائيات الفلقة ، بما في ذلك الحولية العشبية ، والنباتات المعمرة الخشبية ، والعديد من نباتات المحاصيل 2,8. تدخل Hyphae من Verticillium الجذر وتنمو على حد سواء بين الخلايا وداخل الخلايا نحو الأسطوانة المركزية لاستعمار أوعية xylem 2,9. في هذه الأوعية ، يبقى الفطر لمعظم دورة حياته. نظرا لأن عصارة xylem فقيرة بالمغذيات وتحمل مركبات الدفاع النباتي ، يجب أن تتكيف الفطريات مع هذه البيئة الفريدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إفراز البروتينات المرتبطة بالاستعمار التي تمكن العامل الممرض من البقاء على قيد الحياة في مضيفه10,11. بعد الوصول إلى الأوعية الدموية الجذرية ، يمكن أن ينتشر الفطر داخل أوعية xylem بشكل كبير إلى أوراق الشجر ، مما يؤدي إلى استعمار منهجي للمضيف 9,12. في هذه المرحلة ، يتأثر النبات سلبا في النمو9،10،13. على سبيل المثال ، يحدث التقزم والأوراق الصفراء وكذلك الشيخوخة المبكرة13،14،15،16.

أحد أعضاء هذا الجنس هو Verticillium longisporum ، الذي يتكيف بشكل كبير مع المضيفات النحاسية ، مثل اغتصاب البذور الزيتية المهم زراعيا ، والقرنبيط ، والنبات النموذجي Arabidopsis thaliana12. جمعت العديد من الدراسات بين V. longisporum و A. thaliana للحصول على رؤى واسعة النطاق حول أمراض الأوعية الدموية التي تنقلها التربة واستجابات الدفاع الجذري الناتجة13،15،16،17. يمكن تحقيق اختبار القابلية المباشر باستخدام نظام نموذج V. longisporum / A. thaliana والموارد الوراثية الراسخة المتاحة لكلا الكائنين. يرتبط ارتباطا وثيقا ب V. longisporum هو الممرض Verticillium dahliae. على الرغم من أن كلا النوعين الفطريين يؤديان عملية مماثلة على نمط الحياة الوعائية والغزو ، إلا أن كفاءة انتشارهما من الجذور إلى الأوراق وأعراض المرض المستحثة في A. thaliana مختلفة: في حين أن V. longisporum عادة ما يحفز الشيخوخة المبكرة ، فإن عدوى V. dahliae تؤدي إلى الذبول18. في الآونة الأخيرة ، قدم ملخص منهجي استراتيجيات تلقيح جذرية مختلفة لإصابة A. thaliana ب V. longisporum أو V. dahliae ، مما ساعد في تخطيط الإعدادات التجريبية19. في هذا المجال ، يسبب V. longisporum أحيانا أضرارا كبيرة في إنتاج اغتصاب البذور الزيتية12 ، في حين أن V. dahliae لديه مجموعة مضيفة واسعة جدا تضم العديد من الأنواع المزروعة ، مثل كرمة العنب والبطاطا والطماطم8. وهذا يجعل كلا من مسببات الأمراض نماذج مثيرة للاهتمام اقتصاديا للدراسة.

وبالتالي ، تستخدم البروتوكولات التالية كلا من V. longisporum و V. dahliae كمسببات أمراض جذرية نموذجية لتجسيد النهج الممكنة لتلقيح الجذر. تم اختيار أرابيدوبسيس (أرابيدوبسيس تاليانا)، واغتصاب البذور الزيتية (براسيكا نابوس)، والطماطم (سولانوم ليكوبيرسيكوم) كمضيفين نموذجيين. يمكن العثور على أوصاف مفصلة للمنهجيات في النص أدناه والفيديو المصاحب له. وتناقش مزايا وعيوب كل نظام تلقيح. يمكن أن تساعد مجموعة البروتوكولات هذه مجتمعة في تحديد طريقة مناسبة لأسئلة بحثية محددة في سياق التفاعلات بين الجذر والميكروبات.

Protocol

1. وسائل الإعلام للثقافات الفطرية وأنظمة تلقيح النباتات

  1. مرق سكر العنب السائل للبطاطس (PDB): تحضير 21 جم / لتر PDB في ماء فائق النقاء في قارورة مستقرة حراريا.
  2. مرق سكر العنب السائل Czapek (CDB): تحضير 42 جم / لتر CDB في ماء فائق النقاء في قارورة مستقرة حراريا.
  3. متوسطة لنظام تلقيح طبق بتري: قم بإعداد قارورة مستقرة للحرارة مع 1.5 جم / لتر من موراشيج و Skoog متوسطة (MS) و 8 جم / لتر من الأجار في ماء فائق النقاء.
    ملاحظة: تجنب السكر في هذا الوسط لأنه سيؤدي إلى نمو فطري مفرط بعد التلقيح.
  4. متوسطة لنظام التلقيح القائم على الكوب البلاستيكي: قم بإعداد قارورة مستقرة للحرارة مع 4.4 جم / لتر MS ، و 0.2 جم / لتر MgSO4 ، و 1 جم / لتر KNO3 ، و 0.5 جم / لتر 2-(N-morpholino) حمض الإيثانسلفونيك (MES) ، و 6.0 جم / لتر أجار في ماء فائق النقاء واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.7 مع 5 M KOH.
    ملاحظة: تجنب السكر في هذا الوسط لأنه سيؤدي إلى نمو فطري مفرط بعد التلقيح.
  5. 1/4 مللي ثانية متوسطة: تحضير 1.2 جم/لتر من التصلب المتعدد في ماء فائق النقاء.
  6. استخدم الأوتوكلاف لتعقيم جميع الحلول المذكورة أعلاه. ضع القوارير الزجاجية في السلة ، وأغلق الغطاء وقم بالتعقيم لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 98.9 كيلو باسكال.

2. تعقيم سطح بذور النبات

ملاحظة: استخدم البروتوكول أدناه دائما لتعقيم سطح البذور من أرابيدوبسيس واغتصاب البذور الزيتية والطماطم قبل البذر.

  1. انقل البذور إلى أنبوب تفاعل 2 مل. ضع الأنبوب في جهاز طرد بسعة داخلية تبلغ 5.8 لتر.
  2. توليد غاز الكلور في الإكسيكتور عن طريق إضافة 6 مل من 33٪ من حمض الهيدروكلوريك (HCl) إلى 100 مل من هيبوكلوريت الصوديوم المائي 12٪ (NaClO).
  3. أغلق على الفور غطاء الطارد واحتضن البذور لمدة 3 ساعات في الغاز.

3. تحضير اللقاح مع جراثيم Verticillium (conidia المشتقة اللاجنسية)

ملاحظة: زراعة V. dahliae (سلالة JR2) بنفس الطريقة مثل V. longisporum (سلالة Vl43)17،18،19. تأكد من أن جميع المعدات والوسائط خالية من الجراثيم وأن جميع الخطوات يتم تنفيذها في غطاء تدفق صفائحي للحفاظ على أكسينيك اللقاح.

  1. املأ 150 مل من PDB السائل (الخطوة 1.1) في قارورة شيكانري سعة 500 مل واستكمل الوسط ب 500 مجم / لتر سيفوتاكسيم.
  2. أضف فيرتيسيليوم كونيدا من تخزين مخزون الجلسرين إلى وسط PDB. أغلق القارورة بسدادة رغوة معقمة.
  3. احتضان الثقافة لمدة 7-10 أيام في صندوق مظلم في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت اهتزاز أفقي مستمر (اهتزاز دوار ؛ 60 دورة في الدقيقة). ينتج عن ذلك كرات فطرية بيضاء صغيرة.
  4. قم بإزالة وتجاهل PDB supernatant بعناية. يجب أن تبقى معظم الفطريات في القارورة.
  5. أضف 100 مل من CDB السائل (الخطوة 1.2) على الفطريات في قارورة chicanery واستكمل الوسط ب 500 مجم / لتر سيفوتاكسيم.
  6. احتضان 4-5 أيام أخرى في صندوق مظلم في RT تحت اهتزاز أفقي مستمر (شاكر دوار ، 60 دورة في الدقيقة) للحث على الجراثيم. سوف يتحول السوبرناتانت إلى اللون الرمادي المصفر مع إطلاق الكونيديا.
  7. قم بتصفية جزء (5-10 مل) من السائل المحتوي على الكونيديا من خلال ورقة ترشيح (مستوى الاحتفاظ بالجسيمات من 8-12 ميكرومتر) إلى أنبوب تجميع معقم سعة 50 مل. هذا يفصل الجراثيم عن الميسيليا.
  8. تحديد تركيز البوغ باستخدام غرفة عد الخلايا والمجهر. تمييع مع 1/4 مللي ثانية خالية من الجراثيم المتوسطة في الماء فائق النقاء حتى يتم الحصول على تركيزات بوغ الواردة أدناه.
    ملاحظة: تحت المجهر ، تكون الكونيديا من V. longisporum في الغالب طويلة القطر وحجمها 7.1-8.8 ميكرومتر ، في حين أن V. dahliae conidia أقصر (3.5-5.5 ميكرومتر) وكروية إلى حد ما20.
  9. استخدم هذه الكونيديا التي تم حصادها حديثا كتلقيح. تأكد من إجراء التجارب دائما مع كونيديا طازجة الحصاد وليس مع المخزونات المجمدة ، لأن التجميد يقلل بشكل كبير من عدد الجراثيم القابلة للحياة19.
  10. للتخزين على المدى الطويل ، قم بتجميد الجراثيم كمحلول بوغ عالي التركيز (حوالي 1 × 108 جراثيم / مل) في 25٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية (قابل للتخزين حتى عام واحد). بالنسبة للتجارب التالية ، استخدم مخزون الجلسرين هذا لتلقيح وسط PDB في الخطوة 3.2.

4. نظام تطعيم معقم في المختبر يعتمد على أطباق بتري

ملاحظة: بالنسبة لنظام أطباق بتري17، تأكد من أن جميع المعدات والوسائط خالية من الجراثيم وأن جميع الخطوات يتم تنفيذها في غطاء تدفق صفائحي.

  1. بعد التعقيم ، صب الوسط (انظر الخطوة 1.3) في أطباق بتري.
  2. بعد تصلب الوسط ، أعد تعبئة أطباق بتري في كيس بلاستيكي معقم وتخزينها رأسا على عقب طوال الليل في الثلاجة (4-10 درجة مئوية). يساعد الوسط المبرد على منع انزلاق الوسط في الخطوات التالية.
  3. قم بقطع وإزالة قناة العدوى والثلث العلوي من الوسط الصلب باستخدام مشرط (الشكل 1A). تجنب الحصول على السائل أو الهواء تحت وسط أجار أثناء القطع ؛ خلاف ذلك ، سوف ينزلق الوسط ويغلق قناة العدوى.
  4. توزيع 50-100 بذور أرابيدوبسيس معقمة سطحيا مع طرف ماصة معقمة على السطح العلوي المقطوع. ضع البذور في الزاوية التي يلامس فيها سطح الأجار المقطوع جدار طبق بتري بحيث يمكن أن تنمو الجذور بين الوسط وجدار طبق بتري. هذا سوف يسهل التطعيم في وقت لاحق.
  5. أغلق أطباق بتري وأغلقها بشريط لاصق منفذ للهواء للسماح بتبادل الغازات.
  6. بعد التقسيم الطبقي لمدة يومين في الظلام عند 4 درجات مئوية ، ضع الألواح عموديا في رف مناسب وتنمو النباتات عند 22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات ظلام) في غرفة النمو.
  7. عندما تصل غالبية الجذور إلى قناة العدوى (حوالي 9-11 يوما من الشتلات) ، ضع الألواح أفقيا وافتحها وأضف 500 ميكرولتر من Verticillium conidia التي تم حصادها حديثا بتركيز 4 × 105 جراثيم / مل مباشرة في قناة العدوى ، مع التأكد من توزيع السائل بالتساوي في القناة.
  8. وبالمثل ، قم بإعداد لوحات التحكم عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول وهمي بدلا من الجراثيم (وسط خال من الجراثيم 1/4 MS).
  9. احتضن الألواح أفقيا لبضع دقائق حتى ينقع السائل ولا يمكن أن يتسرب إلى الخارج عند إعداد الألواح عموديا مرة أخرى. ثم أغلق الغطاء وأغلق الألواح بشريط لاصق قابل للنفاذ إلى الهواء.
  10. احتضان الألواح عموديا في غرفة النمو. اختياريا ، قم بتغطية أجزاء الجذر بصناديق ورقية سوداء لتغميق الجذور والفطريات التي تنقلها التربة (انظر19).
  11. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح اعتمادا على سؤال البحث (راجع أساطير الشكل لمعرفة النقاط الزمنية الدقيقة المستخدمة هنا). فيما يلي بعض الاقتراحات.
    1. قطع الأوراق من الجذور والحصاد على حد سواء. أخرج شرائط الأجار من أطباق بتري للوصول بسهولة إلى الجذور واسحبها بعناية من الأجار باستخدام الملقط. تجميد جميع المواد النباتية على الفور في النيتروجين السائل.
      1. طحن العينات في النيتروجين السائل. استخراج الحمض النووي الكلي من 100 ملغ من المواد الورقية لتحديد كمية الحمض النووي الفطري بالنسبة للحمض النووي النباتي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي(qPCR).
      2. طحن العينات في النيتروجين السائل. خذ 100 ملغ من المواد النباتية واستخرج الحمض النووي الريبي الكلي. إجراء النسخ العكسي الكمي PCR (qRT-PCR) لتحديد التعبير عن الجينات النباتية (أو الجينات الفطرية) أثناء الإصابة (انظر19).
    2. قم بإزالة الجذور بعناية من الأجار لتجنب الإصابة وفحصها تحت المجهر الفلوري.
      1. تحديد تحريض جينات العلامات في خطوط مراسلي النباتات (على سبيل المثال ، luciferase ، β-glucuronidase ، أو مراسلي الفلورسنت17،19،21).
      2. تصور الانتشار الفطري في الجذر باستخدام خطوط مراسل فطرية (على سبيل المثال ، V. longisporum التي تعبر بشكل أساسي عن بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن ، Vl-sGFP9) أو عن طريق تقنيات التلطيخ (على سبيل المثال ، من خلال 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glucosaminide (X-beta-D-Glc-Nac)18).

5. نظام تلقيح معقم في المختبر منظم بأكواب بلاستيكية

ملاحظة: كما هو مذكور في الوصف الأول لهذه التقنية19 ، تأكد من أن جميع المعدات والوسائط خالية من الجراثيم وأن جميع الخطوات يتم تنفيذها في غطاء تدفق صفائحي.

  1. استخدم أكواب بلاستيكية شفافة بحجم إجمالي يبلغ 500 مل وقم بتعقيمها في حمام إيثانول بنسبة 70٪ -75٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. جفف الكؤوس في غطاء التدفق الرقائقي.
  2. صب الوسط المعقم (انظر الخطوة 1.4) في الأكواب البلاستيكية. اختياريا، أضف سيفوتاكسيم (التركيز النهائي 50 ملغم/لتر) إلى الوسط المعقم لمنع التلوث البكتيري. استخدم 150 مل من الوسط لكل كوب للتجارب مع أرابيدوبسيس أو أكثر متوسطة (250-300 مل لكل كوب) للتجارب مع الأنواع النباتية الأكبر (اغتصاب البذور الزيتية والطماطم).
  3. ضع طبقة بلاستيكية (معقمة من قبل عن طريق احتضان 70٪ -75٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة) على الوسط قبل أن يتصلب (الشكل 1B).
    ملاحظة: تحتوي هذه الطبقة البلاستيكية على أربعة ثقوب مسبقة الصنع في الزوايا لوضع البذور المعقمة على السطح. هذا يسمح للبذور بالوصول إلى الوسط. في وقت لاحق ، تمنع هذه الطبقة الفاصلة الأوراق من لمس الوسط المحتوي على الفطريات ، بحيث لا تستطيع الميكروبات مهاجمة الأوراق مباشرة ويجب أن تأخذ مسار الجذر. يوجد ثقب آخر في الوسط ، مما يتيح قطع قناة العدوى.
  4. عندما يتصلب الوسط ، اقطع الأجار بمشرط من خلال فتحة المركز الجاهزة إلى عمق حوالي 1.5 سم. قم بإزالة الآجار المقطوع لإنشاء قناة عدوى يمكن إضافة الجراثيم الفطرية إليها لاحقا.
  5. خدش وسط الأجار قليلا بطرف ماصة في الثقوب الأربعة الأصغر لمقاطعة الجلد الصلب (وهذا يسمح للبذور بامتصاص الماء من وسط الأجار المائي). ضع البذور باستخدام طرف ماصة في الثقوب الأصغر.
  6. أغلق الكوب البلاستيكي بكوب بلاستيكي ثان مقلوب وأغلقه بشريط لاصق قابل للنفاذ إلى الهواء. يجب أن يسمح الشريط بتبادل الغازات.
  7. بعد التقسيم الطبقي لمدة 3 أيام في الظلام عند 4 درجات مئوية ، احتضن أنظمة الكأس تحت 12 ساعة ضوء / 12 ساعة ظلام (أرابيدوبسيس ، اغتصاب البذور الزيتية) أو 16 ساعة ضوء / 8 ساعات ظروف الظلام (الطماطم) في غرف النمو عند درجة حرارة ثابتة من 22 درجة مئوية ورطوبة 60 ٪.
  8. اتبع العمر الموصى به للنباتات للتلقيح: 21 يوما ل Arabidopsis ؛ 5-7 أيام لاغتصاب البذور الزيتية. 12 يوما للطماطم.
  9. قم بتلقيح النباتات ب Verticillium عن طريق إضافة 1 مل من محلول conidia (التركيز الموصى به: 4 × 105 جراثيم / مل) في قناة العدوى. لإعداد عينات التحكم، أضف 1 مل من المحلول الوهمي بدون جراثيم (وسط 1/4 MS خال من الجراثيم) إلى القناة.
  10. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح اعتمادا على سؤال البحث (راجع أساطير الشكل لمعرفة النقاط الزمنية الدقيقة المستخدمة هنا). فيما يلي بعض الاقتراحات.
    1. التقط صورا للنباتات باستخدام كاميرا رقمية من الأعلى مع الحفاظ على المسافة نفسها لكل صورة. حدد مساحة الورقة (على سبيل المثال ، باستخدام ImageJ22 أو BlattFlaeche17,19 ؛ استخدم طول الكؤوس لضبط المقياس) وقارن بين المجموعات المصابة والتحكم. تصنيف تطور أعراض المرض (على سبيل المثال ، أوراق أصغر أو أكثر صفراء أو نخرة).
      ملاحظة: إذا كان هناك أي سيقان على Arabidopsis ، فقم بإزالتها للحصول على صور أفضل للوريدات.
    2. إزالة الجذور وتحديد الكتلة الحيوية (الوزن الطازج) للبراعم من العينات المصابة والسيطرة عليها عن طريق الوزن. أوجد الوزن الطازج النسبي19.
    3. جمع العينات للتحليلات الجزيئية على النحو التالي.
    4. Arabidopsis: إزالة السيقان إن وجدت. قطع الورود في القاعدة من الجذور. تأكد من استبعاد جميع المواد الجذرية من العينة وحصاد الورود الكاملة. الجمع بين 4-5 وريدات من النباتات المختلفة في عينة واحدة وتجميد مادة ورقة في النيتروجين السائل.
    5. اسحب الجذور بعناية من الوسط باستخدام ملقط ، واضغط عليها وربت عليها بمنشفة ورقية لإزالة بقايا الأجار ، وادمج 4-5 جذور من نباتات مختلفة في عينة واحدة. تجميد على الفور في النيتروجين السائل.
    6. اغتصاب البذور الزيتية / الطماطم: قطع أجزاء الساق من hypocotyl (على سبيل المثال ، 1 سم في الطول ؛ دائما تأخذ نفس المنطقة الجذعية). الجمع بين المواد من 4-5 نباتات في كل عينة وتجميد في النيتروجين السائل.
    7. طحن العينات في النيتروجين السائل. استخراج الحمض النووي الكلي من 100 ملغ من الورقة أو المادة الجذعية لتحديد كمية الحمض النووي الفطري عبر qPCR بالنسبة للحمض النووي النباتي (انظر19).
    8. طحن العينات في النيتروجين السائل ، واتخاذ 100 ملغ من المواد النباتية واستخراج الحمض النووي الريبي الكلي. إجراء qRT-PCR لتحديد التعبير عن الجينات النباتية (أو الجينات الفطرية) عند الإصابة (انظر19).

6. نظام تلقيح قائم على التربة في الأواني

  1. امزج التربة والرمل جيدا بنسبة حجمية 3: 1 (التربة: الرمل) لتسهيل غسل الركيزة من الجذور. صب الخليط في كيس الأوتوكلاف. إذا كان الخليط جافا جدا ، أضف كمية مناسبة من الماء واخلطه في الركيزة. البخار على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الأوتوكلاف لتقليل التلوث الميكروبي.
    ملاحظة: تجنب التسخين إلى أكثر من 80 درجة مئوية، لأن هذا قد يؤثر على مغذيات التربة العضوية.
  2. املأ الأواني بخليط التربة والرمل وانقلها إلى صواني. أضف الماء إلى الصواني حوالي 1/3 ارتفاع الوعاء ، بحيث ينقع خليط التربة والرمل جيدا بالماء. بالإضافة إلى ذلك ، رش الركيزة بالماء بزجاجة رذاذ لضمان ظروف البدء الرطبة.
  3. زرع 3-4 بذور في كل وعاء (الشكل 1C) لضمان أن البذور لديها مسافة كافية من بعضها البعض. احتفظ بها لمدة 3 أيام في الظلام عند 4 درجات مئوية للتقسيم الطبقي لمزامنة الإنبات.
    ملاحظة: قبل زراعة فائض من النباتات ، مما يتيح مجموعة مختارة من النباتات ذات الحجم المماثل لتجارب التلقيح ويقلل من الانحرافات بسبب الاختلافات الفردية.
  4. دع الشتلات تنمو في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات ظلام ؛ درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 درجة مئوية ؛ رطوبة 60٪) مع سقي منتظم.
  5. اتبع العمر الموصى به للنباتات للتلقيح: 21 يوما ل Arabidopsis ، 7 أيام لاغتصاب البذور الزيتية ، و 10 أيام للطماطم. اختر النباتات ذات الحجم المماثل لإجراء "تطعيم تراجع الجذر"15،17،23،24. أخرج التربة من الأواني وحفر الجذور بعناية.
  6. اغسل الجذور بلطف فقط في وعاء ماء وحافظ على الورود خارج الماء. احتضن الجذور المغسولة لمدة 60 دقيقة في طبق بتري يحتوي على محلول بوغ Verticillium (التركيز الموصى به: 2 × 106 جراثيم / مل). بالنسبة لمجموعة التحكم غير المصابة ، احتضن الجذور لمدة 60 دقيقة في المحلول الوهمي بدون جراثيم (وسط 1/4 MS خال من الجراثيم).
  7. قم بإعداد أواني جديدة بتربة رطبة ومعقمة بالبخار (80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) بدون رمل. استخدم طرف ماصة لعمل ثقب واحد في وسط التربة في كل وعاء.
  8. ضع الجذور مباشرة في الحفرة (انقل نباتا واحدا فقط لكل وعاء). بعد إدخال الجذور ، تأكد من إعادة ملء الثقوب بعناية بالتربة. تجنب الضغط على التربة ، وإلا فإن إعادة الصب يمكن أن تسبب أعراض الإجهاد مثل الأوراق الأرجوانية.
  9. زراعة المجموعات المصابة والسيطرة عليها في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات من الظلام ؛ درجة حرارة ثابتة من 22 درجة مئوية ؛ رطوبة 60 ٪) مع سقي منتظم.
  10. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح اعتمادا على سؤال البحث (راجع أساطير الشكل لمعرفة النقاط الزمنية الدقيقة المستخدمة هنا). فيما يلي بعض الاقتراحات.
    1. التقط صورا للنباتات باستخدام كاميرا رقمية من الأعلى ، مع الحفاظ على المسافة نفسها لكل صورة. حدد مساحة الورقة (على سبيل المثال ، باستخدام ImageJ22 أو BlattFlaeche17,19 ؛ استخدم قطر الأواني لضبط المقياس) وقارن بين المجموعات المصابة والتحكم. تصنيف تطور أعراض المرض (على سبيل المثال، أوراق أصغر أو أكثر صفراء أو نخرة)13.
      ملاحظة: إزالة سيقان أرابيدوبسيس يسهل التقاط صور للوردات.
    2. إزالة الجذور وتحديد الكتلة الحيوية (الوزن الطازج) للبراعم من العينات المصابة والسيطرة عليها عن طريق الوزن. أوجد الوزن الطازج النسبي19.
    3. بدلا من ذلك ، قم بقياس ارتفاع النبات أو تصنيف النمو الفطري من شرائح الساق لتقييم شدة المرض13.
    4. جمع العينات للتحليلات الجزيئية على النحو التالي.
    5. Arabidopsis: إزالة السيقان. قطع الورود في تاج الجذر. الجمع بين 4-5 وريدات من النباتات المختلفة في عينة واحدة. تجميد مادة الأوراق في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: في حالة الجذور ، من الصعب تنظيفها بشكل كاف من التربة دون إعادة برمجة التعبير الجيني من خلال الغسيل.
    6. اغتصاب البذور الزيتية / الطماطم: قطع أجزاء الساق من hypocotyl (على سبيل المثال ، 1 سم في الطول ؛ دائما تأخذ نفس المنطقة الجذعية). الجمع بين المواد من 4-5 نباتات في عينة واحدة وتجميدها في النيتروجين السائل.
    7. طحن العينات في النيتروجين السائل. استخراج الحمض النووي الكلي من أوراق 100 ملغ أو المواد الجذعية لتحديد عن طريق qPCR كمية الحمض النووي الفطري بالنسبة للحمض النووي النباتي (انظر19).
    8. طحن العينات في النيتروجين السائل ، واتخاذ 100 ملغ من المواد النباتية واستخراج الحمض النووي الريبي الكلي. إجراء qRT-PCR لتحديد التعبير عن الجينات النباتية (أو الجينات الفطرية) عند الإصابة (انظر19).

7. تحليل البيانات

  1. احسب متوسط الانحراف والانحراف المعياري (± SD) استنادا إلى النسخ المتماثلة البيولوجية.
  2. احسب القيم النسبية بقسمة جميع النتائج من المجموعة المصابة على نتيجة عنصر التحكم. اعرض المتوسط على أنه ، على سبيل المثال ، "بالنسبة إلى الوهمية" أو "بالنسبة إلى النوع البري".
  3. تحديد الدلالة الإحصائية بين المجموعات.

figure-protocol-17310
الشكل 1: تجميع أنظمة التلقيح الثلاثة والخطوات الفردية في البروتوكولات. توضح هذه الأرقام الأنظمة مع المصنع النموذجي Arabidopsis thaliana. بالنسبة للأنواع النباتية الأخرى ، يجب تعديل التوقيت. تسليط الضوء على الصناديق البرتقالية ، والتي يوصى بإجراء التحليلات اللاحقة لها مع النظام المعني. (أ) بالنسبة لنظام التلقيح في أطباق بتري17 ، صب الوسط واتركه يتصلب. احتفظ بالأطباق في الثلاجة طوال الليل. ثم قم بقص وإزالة الثلث العلوي وكذلك قناة العدوى (IC) باستخدام مشرط (تمت إزالة المناطق البيضاء في الرسم التوضيحي من الأجار ، بينما تمثل المناطق المزرقة الأجار). ضع البذور على السطح المقطوع وأغلق أطباق بتري. بعد التقسيم الطبقي ، ضع الألواح عموديا واترك النباتات تنمو. بمجرد وصول معظم الجذور إلى قناة العدوى ، أضف محلول البوغ باستخدام ماصة مباشرة إلى القناة. تأكد من توزيع الحل بالتساوي. أغلق أطباق بتري واحتضنها عموديا في غرفة النمو. النهج التي قد تتبع هي التحليل التعبيري مع النسخ العكسي الكمي PCR (qRT-PCR) ، والفحص المجهري مع خطوط المراسل ، وتحديد كمية الحمض النووي الميكروبي. (ب) بالنسبة لنظام التلقيح في أكواب بلاستيكية19 ، صب الوسط ونقل الطبقة البلاستيكية الفاصلة مع الثقوب الجاهزة (أربعة ثقوب صغيرة في الزوايا لوضع البذور وثقب كبير واحد في وسط قناة العدوى). دع الوسط يتصلب. قطع وإزالة وسط أجار في الفتحة الوسطى مع مشرط للحصول على قناة العدوى (IC). خدش الوسط في الثقوب الصغيرة ونقل البذور. أغلق الكوب بكوب مقلوب وختم بشريط منفذ للهواء (يرمز إليه باللون الأصفر). دع النباتات تنمو. للتلقيح ، أضف محلول البوغ مع ماصة مباشرة في قناة العدوى. أغلق النظام واستمر في الزراعة في غرفة النمو. النهج التي قد تتبع هي التحليل التعبيري مع qRT-PCR ، وتحديد كمية الحمض النووي الميكروبي ، وتحديد الوزن الطازج ، ومنطقة الورقة ، أو خصائص المرض الأخرى. (ج) "التلقيح بغمس الجذر"15،17،23،24: بالنسبة لنظام التلقيح القائم على التربة، املأ الأواني بخليط من التربة: الرمال. نقل البذور والسماح للشتلات تنمو. حفر النباتات ذات الحجم المماثل وغسل الجذور في الماء. ضع الجذور المغسولة في طبق بتري يحمل المحلول مع الجراثيم. بعد الحضانة ، أدخل نباتات مفردة في الأواني ذات التربة. النهج التي قد تتبع هي التحليل التعبيري في الأوراق مع qRT-PCR ، وتحديد كمية الحمض النووي الميكروبي ، وتحديد الوزن الطازج ، ومنطقة الأوراق ، أو غيرها من خصائص المرض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

بعد البروتوكول ، تم زراعة النباتات وتلقيحها ب V. longisporum (سلالة Vl4325) أو V. dahliae (عزل JR218). تم تصميم سيناريوهات مختلفة لإثبات فعالية وتسليط الضوء على بعض قدرات البروتوكولات المحددة. يتم عرض النتائج التمثيلية.

يعد الحث التعبيري للجينات المش?...

Discussion

نظرا لخسائر الغلة الهائلة التي تسببها مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة1 ، يلزم تحسين استراتيجيات الزراعة أو أصناف المحاصيل. إن البصيرة المحدودة في التسبب في الأمراض التي تنقلها التربة تعيق تطوير نباتات أكثر مقاومة. ويلزم استكشاف الآليات المرضية الأساسية، التي تتط...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يعترف المؤلفان بتيم إيفين وجاكلين كوموريك لعملهما السابق على هذه الأساليب، ومجموعة فولفغانغ دروغ-ليزر (قسم البيولوجيا الصيدلانية، جامعة فورتسبورغ، ألمانيا) لتوفير المعدات والموارد اللازمة لهذا العمل، وفولفغانغ دروغ-ليزر وكذلك فيليب كريز (كلاهما من جامعة فورتسبورغ) للتدقيق اللغوي النقدي للمخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من قبل "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar (Gelrite)Carl RothNr. 0039all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-typeNASC stockCol-0 (N1092)
AutoclaveSystecVE-100
BlattFlaecheDatinf GmbHBlattFlaechesoftware to determine leaf areas
Brassica napus wild-typesee Floerl et al., 2008rapid-cycling rapegenome ACaacc
Cefotaxime sodiumDuchefaC0111
Chicanery flask 500 mLDuran Group / neoLabE-1090Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mLSarstedt62.547.254114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth mediumDuchefaC1714
Digital cameraNikonD3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator )Duran Group200 DN, 5.8 LSeal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence MicroscopeLeicaLeica TCS SP5 II
HClCarl RothP074.3
KNO3Carl RothP021.1≥ 99 %
KOHCarl Roth6751
LeukoporBSN medical GmbH2454-00 APnon-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)Carl Roth4256.2Pufferan ≥ 99 %
MgSO4Carl RothT888.1Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS)DuchefaM0222MS including vitamins
NaClOCarl Roth9062.1
Percival growth chambersCLF Plant Climatics GmbHAR-66L2
Petri-dishesSarstedt82.1473.001size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent)Pro-pac, salad boxx5070size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filterHartensteinFF12particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamberpoly klima GmbHPK 520 WLED
Potato Dextrose Broth mediumSIGMA AldrichP6685for microbiology
PotsPöppelmann GmbHTO 7 D or TO 9,5 DØ 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFPsee Poncini et al., 2017MYB51 reporter lineYFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mLSarstedt72.695.400PCR Performance tested
Rotary (orbital) shakerEdmund BühlerSM 30 C control
Sand (bird sand)Pet Bistro, Müller Holding786157
SoilEinheitserde spezialSP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-typesee Chavarro-Carrero et al., 2021Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamberMarienfeld642710depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water)MERKIQ 7003/7005water obtained after purification
Verticillium dahliaesee Reusche et al., 2014isolate JR2
Verticillium longisporumZeise and von Tiedemann, 2002strain Vl43

References

  1. Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
  2. Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
  3. Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
  4. Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
  5. Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
  6. Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
  7. Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
  8. Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
  9. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  10. Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
  11. Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
  12. Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
  13. Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
  14. Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
  15. Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
  16. Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
  17. Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
  18. Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
  19. Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
  20. Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
  21. Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
  24. Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
  25. Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
  26. Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
  27. Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
  28. Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
  29. Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
  30. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved