Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Zusammenfassung der Strategien zur Beimpfung von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroben. Am Beispiel der Pilze Verticillium longisporum und Verticillium dahliae werden drei verschiedene Wurzelinfektionssysteme beschrieben. Mögliche Anwendungen und mögliche nachgelagerte Analysen werden aufgezeigt und Vor- oder Nachteile für jedes System diskutiert.

Zusammenfassung

Die Rhizosphäre beherbergt eine hochkomplexe mikrobielle Gemeinschaft, in der Pflanzenwurzeln ständig herausgefordert werden. Wurzeln stehen in engem Kontakt mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, aber Studien über bodenbürtige Wechselwirkungen liegen immer noch hinter denen, die an oberirdischen Organen durchgeführt werden. Obwohl in der Literatur einige Impfstrategien zur Infektion von Modellpflanzen mit Modellwurzelpathogenen beschrieben werden, bleibt es schwierig, einen umfassenden methodischen Überblick zu erhalten. Um dieses Problem anzugehen, werden drei verschiedene Wurzelimpfsysteme genau beschrieben, die angewendet werden können, um Einblicke in die Biologie der Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu gewinnen. Zur Veranschaulichung wurden Verticillium-Arten (nämlich V. longisporum und V. dahliae) als wurzeleindringende Modellpathogene verwendet. Die Methoden können jedoch leicht an andere wurzelbesiedelnde Mikroben angepasst werden - sowohl pathogene als auch nützliche. Durch die Besiedlung der Pflanze Xylem zeigen bodengetragene Gefäßpilze wie Verticillium spp. einen einzigartigen Lebensstil. Nach der Wurzelinvasion breiten sie sich über die Xylemgefäße akropetisch aus, erreichen den Spross und lösen Krankheitssymptome aus. Drei repräsentative Pflanzenarten wurden als Modellwirte ausgewählt: Arabidopsis thaliana, wirtschaftlich wichtiger Raps (Brassica napus) und Tomate (Solanum lycopersicum). Es werden Schritt-für-Schritt-Protokolle gegeben. Es werden repräsentative Ergebnisse von Pathogenitätsassays, transkriptionellen Analysen von Markergenen und unabhängigen Bestätigungen durch Reporterkonstrukte gezeigt. Darüber hinaus werden die Vor- und Nachteile jedes Impfsystems gründlich diskutiert. Diese bewährten Protokolle können dabei helfen, Ansätze für Forschungsfragen zu Wurzel-Mikroben-Interaktionen bereitzustellen. Zu wissen, wie Pflanzen mit Mikroben im Boden umgehen, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Strategien zur Verbesserung der Landwirtschaft.

Einleitung

Natürliche Böden werden von einer erstaunlichen Anzahl von Mikroben bewohnt, die neutral, schädlich oder vorteilhaft für Pflanzen sein können¹. Viele Pflanzenpathogene werden durch den Boden übertragen, umgeben die Wurzeln und greifen das unterirdische Organ an. Diese Mikroorganismen gehören zu einer Vielzahl von Kladen: Pilze, Oomyceten, Bakterien, Nematoden, Insekten und einige Viren ^1,2. Sobald die Umweltbedingungen eine Infektion begünstigen, werden anfällige Pflanzen krank und die Ernteerträge sinken. Die Auswirkungen des Klimawandels, wie die globale Erwärmung und Wetterextreme, w

Protokoll

1. Medien für Pilzkulturen und Pflanzenimpfsysteme

1. Flüssige Kartoffeldextrose-Brühe (PDB): 21 g/L PDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zubereiten.
2. Flüssige Czapek Dextrose Brühe (CDB): Bereiten Sie 42 g/L CDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zu.
3. Medium für das Petrischalen-Impfsystem: Bereiten Sie einen hitzestabilen Kolben mit 1,5 g/L Murashige und Skoog-Medium (MS) und 8 g/L Agar in Reinstwasser vor.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Zucker in diesem Medium, da dies nach der Impfung zu übermäßigem Pilzwachstum führt.
4. Medium für das auf Kunststoffbechern basierende Impfsystem: Bereiten Sie ein

Ergebnisse

Nach dem Protokoll wurden die Pflanzen kultiviert und mit V. longisporum (Stamm Vl43²⁵) oder V. dahliae (Isolat JR2¹⁸) beimpft. Verschiedene Szenarien wurden entwickelt, um die Wirksamkeit zu beweisen und einige Fähigkeiten der gegebenen Protokolle hervorzuheben. Repräsentative Ergebnisse werden gezeigt.

Die expressionale Induktion von Genen, die an der antimikrobiellen Indol-Glucosinolat-Biosynthese (IG) beteiligt si...

Diskussion

Aufgrund der enormen Ertragseinbußen durch bodenbürtige^{Phytopathogene 1} ist eine Verbesserung der Anbaustrategien oder Nutzpflanzensorten erforderlich. Der begrenzte Einblick in die Pathogenese bodenbürtigerer Krankheiten behindert die Entwicklung resistenterer Pflanzen. Es müssen die zugrunde liegenden Pathomechanismen erforscht werden, für die eine robuste methodische Plattform erforderlich ist. Berichtete Impfverfahren haben gezeigt, dass multifaktorielle Ereignisse in Wurzel-Mikroben-Inte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar (Gelrite)	Carl Roth	Nr. 0039	all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-type	NASC stock	Col-0 (N1092)
Autoclave	Systec	VE-100
BlattFlaeche	Datinf GmbH	BlattFlaeche	software to determine leaf areas
Brassica napus wild-type	see Floerl et al., 2008	rapid-cycling rape	genome ACaacc
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
Chicanery flask 500 mL	Duran Group / neoLab	E-1090	Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mL	Sarstedt	62.547.254	114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth medium	Duchefa	C1714
Digital camera	Nikon	D3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator )	Duran Group	200 DN, 5.8 L	Seal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence Microscope	Leica	Leica TCS SP5 II
HCl	Carl Roth	P074.3
KNO3	Carl Roth	P021.1	≥ 99 %
KOH	Carl Roth	6751
Leukopor	BSN medical GmbH	2454-00 AP	non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)	Carl Roth	4256.2	Pufferan ≥ 99 %
MgSO4	Carl Roth	T888.1	Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS)	Duchefa	M0222	MS including vitamins
NaClO	Carl Roth	9062.1
Percival growth chambers	CLF Plant Climatics GmbH	AR-66L2
Petri-dishes	Sarstedt	82.1473.001	size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent)	Pro-pac, salad boxx	5070	size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filter	Hartenstein	FF12	particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamber	poly klima GmbH	PK 520 WLED
Potato Dextrose Broth medium	SIGMA Aldrich	P6685	for microbiology
Pots	Pöppelmann GmbH	TO 7 D or TO 9,5 D	Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFP	see Poncini et al., 2017	MYB51 reporter line	YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mL	Sarstedt	72.695.400	PCR Performance tested
Rotary (orbital) shaker	Edmund Bühler	SM 30 C control
Sand (bird sand)	Pet Bistro, Müller Holding	786157
Soil	Einheitserde spezial	SP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-type	see Chavarro-Carrero et al., 2021	Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamber	Marienfeld	642710	depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water)	MERK	IQ 7003/7005	water obtained after purification
Verticillium dahliae	see Reusche et al., 2014	isolate JR2
Verticillium longisporum	Zeise and von Tiedemann, 2002	strain Vl43