АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол представляет собой подробное резюме стратегий прививки корней растений почвенными микробами. На примере грибов Verticillium longisporum и Verticillium dahliae описаны три различные системы корневой инфекции. Выделяются потенциальные области применения и возможные последующие анализы, а также обсуждаются преимущества или недостатки для каждой системы.

Аннотация

Ризосфера содержит очень сложное микробное сообщество, в котором корни растений постоянно оспариваются. Корни находятся в тесном контакте с широким спектром микроорганизмов, но исследования почвенных взаимодействий все еще отстают от тех, которые проводятся на надземных органах. Хотя некоторые стратегии прививки для заражения модельных растений модельными корневыми патогенами описаны в литературе, по-прежнему трудно получить всесторонний методологический обзор. Для решения этой проблемы точно описаны три различные системы корневой инокуляции, которые могут быть применены для получения понимания биологии взаимодействия корней и микробов. Например, виды Verticillium (а именно V . longisporum и V. dahliae) использовались в качестве патогенов модели вторжения корней. Однако методы могут быть легко адаптированы к другим корневым колонизирующим микробам – как патогенным, так и полезным. Колонизируя растение ксилемы, сосудистые почвенные грибы, такие как Verticillium spp., демонстрируют уникальный образ жизни. После корневой инвазии они распространяются через сосуды ксилемы акропетально, достигают побега и вызывают симптомы заболевания. В качестве модельных хозяев были выбраны три репрезентативных вида растений: Arabidopsis thaliana, экономически важный масличный рапс (Brassica napus) и томат (Solanum lycopersicum). Приведены пошаговые протоколы. Показаны репрезентативные результаты анализов патогенности, транскрипционного анализа маркерных генов и независимых подтверждений репортерными конструкциями. Кроме того, подробно обсуждаются преимущества и недостатки каждой системы прививки. Эти проверенные протоколы могут помочь в предоставлении подходов к исследовательским вопросам взаимодействия корневого микроба. Знание того, как растения справляются с микробами в почве, имеет решающее значение для разработки новых стратегий улучшения сельского хозяйства.

Введение

Естественные почвы населены удивительным количеством микробов, которые могут быть нейтральными, вредными или полезными для растений1. Многие патогены растений переносятся через почву, окружают корни и атакуют подземный орган. Эти микроорганизмы относятся к самым разнообразным кладам: грибы, оомицеты, бактерии, нематоды, насекомые и некоторые вирусы 1,2. Как только условия окружающей среды благоприятствуют инфекции, восприимчивые растения станут больными, а урожайность сельскохозяйственных культур снизится. Последствия изменения климата, такие как глобальное потепление и экстремальные погодные условия, увеличат долю почвенных патогенов растений3. Поэтому становится все более важным изучать эти разрушительные микробы и их влияние на производство продуктов питания и кормов, а также на природные экосистемы. Кроме того, в почве есть микробные мутуалисты, которые плотно взаимодействуют с корнями и способствуют росту, развитию и иммунитету растений. При столкновении с патогенами растения могут активно вербовать специфических противников в ризосфере, которые могут поддерживать выживание хозяина, подавляя патогены 4,5,6,7. Тем не менее, механистические детали и пути, участвующие в полезных взаимодействиях корневого микроба, часто все еще неизвестны6.

Поэтому важно расширить общее понимание взаимодействия корневого микроба. Надежные методы инокуляции корней почвенными микроорганизмами необходимы для проведения модельных исследований и передачи полученных результатов сельскохозяйственному применению. Полезные взаимодействия в почве изучаются, например, с Serendipita indica (ранее известной как Piriformospora indica), азотфиксирующим Rhizobium spp. или микоризными грибами, в то время как известные почвенные патогены растений включают Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. и Verticillium spp.1. Последние два являются грибковыми родами, которые распространены глобально и вызывают сосудистые заболевания2. Verticillium spp. (Ascomycota) может заражать сотни видов растений - в основном двудольных, включая травянистых однолетников, древесные многолетники и многие сельскохозяйственные растения 2,8. Гифы Verticillium входят в корень и растут как межклеточными, так и внутриклеточными по направлению к центральному цилиндру для колонизации сосудов ксилемы 2,9. В этих сосудах грибок остается на протяжении большей части своего жизненного цикла. Поскольку сок ксилемы беден питательными веществами и несет защитные соединения растений, гриб должен адаптироваться к этой уникальной среде. Это достигается путем секреции связанных с колонизацией белков, которые позволяют патогену выживать в своем хозяине10,11. Достигнув корневой сосудистой системы, грибок может распространяться внутри сосудов ксилемы акропетально к листве, что приводит к системной колонизации хозяина 9,12. На данный момент на растение негативно влияет рост 9,10,13. Например, происходит задержка роста и желтые листья, а также преждевременное старение 13,14,15,16.

Одним из представителей этого рода является Verticillium longisporum, который хорошо приспособлен к медным хозяевам, таким как агрономически важный рапс, цветная капуста и модельное растение Arabidopsis thaliana12. Несколько исследований объединили V. longisporum и A. thaliana, чтобы получить обширное представление о сосудистых заболеваниях, передаваемых через почву, и результирующих реакциях защиты корней 13,15,16,17. Простое тестирование чувствительности может быть реализовано с использованием модельной системы V. longisporum / A. thaliana, и для обоих организмов доступны хорошо зарекомендовавшие себя генетические ресурсы. С V. longisporum тесно связан возбудитель Verticillium dahliae. Хотя оба вида грибов выполняют сходный сосудистый образ жизни и процесс инвазии, их эффективность размножения от корней до листьев и симптомы заболевания у A. thaliana различны: в то время как V. longisporum обычно вызывает раннее старение, инфекция V. dahliae приводит к увяданию18. Недавно в методологическом резюме были представлены различные стратегии корневой прививки для заражения A. thaliana V. longisporum или V. dahliae, помогающие в планировании экспериментальных установок19. В полевых условиях V. longisporum иногда наносит значительный ущерб производству масличного рапса12, тогда как V. dahliae имеет очень широкий диапазон хозяев, включающий несколько культивируемых видов, таких как виноградная лоза, картофель и помидор8. Это делает оба патогена экономически интересными моделями для изучения.

Таким образом, следующие протоколы используют как V. longisporum , так и V. dahliae в качестве модельных корневых патогенов для иллюстрации возможных подходов к корневым прививкам. Арабидопсис (Arabidopsis thaliana), масличный рапс (Brassica napus) и помидор (Solanum lycopersicum) были выбраны в качестве модельных хозяев. Подробное описание методологий можно найти в тексте ниже и в сопроводительном видео. Обсуждаются преимущества и недостатки для каждой системы инокуляции. Взятый вместе, этот набор протоколов может помочь определить подходящий метод для конкретных исследовательских вопросов в контексте взаимодействия корневого микроба.

протокол

1. Среды для грибковых культур и систем посева растений

  1. Жидкий картофельный бульон из декстрозы (PDB): Приготовьте 21 г / л PDB в сверхчистой воде в термостабильной колбе.
  2. Жидкий бульон из декстрозы Чапек (CDB): Приготовьте 42 г /л CDB в сверхчистой воде в термостабильной колбе.
  3. Среда для системы прививки чашки Петри: Приготовьте термостойкую колбу с 1,5 г / л мурашиге и среды Skoog (MS) и 8 г / л агара в сверхчистой воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сахара в этой среде, так как это приведет к чрезмерному росту грибков после прививки.
  4. Среда для системы инокуляции на основе пластиковых стаканчиков: Подготовьте термостабильную колбу с 4,4 г / л MS, 0,2 г / л MgSO4, 1 г / л KNO3, 0,5 г / л 2-(N-морфолино)этанесульфоновой кислоты (MES) и 6,0 г / л агара в сверхчистой воде и отрегулируйте рН до 5,7 с 5 М КОН.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сахара в этой среде, так как это приведет к чрезмерному росту грибков после прививки.
  5. 1/4 MS среды: Приготовьте 1,2 г/л MS в сверхчистой воде.
  6. Используйте автоклав для стерилизации всех вышеперечисленных растворов. Положите стеклянные колбы в корзину, закройте крышку и стерилизуйте в течение 15 мин при 121 °C и 98,9 кПа.

2. Стерилизация поверхности семян растений

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте приведенный ниже протокол для стерилизации поверхности семян арабидопсиса, масличного рапса и томата перед посевом.

  1. Переложите семена в реакционную трубку объемом 2 мл. Поместите трубку в эксикатор с внутренним объемом 5,8 л.
  2. Генерируйте газообразный хлор в эксикаторе, добавляя 6 мл 33% соляной кислоты (HCl) в 100 мл 12% водного гипохлорита натрия (NaClO).
  3. Немедленно закройте крышку эксикатора и высиживайте семена в течение 3 ч в газе.

3. Приготовление инокулята со спорами Verticillium (бесполыми конидиями)

ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируют V. dahliae (штамм JR2) так же, как V. longisporum (штамм Vl43)17,18,19. Убедитесь, что все оборудование и среды свободны от микробов и что все этапы выполняются в ламинарной вытяжке, чтобы сохранить осечку inoculum.

  1. Заполните 150 мл жидкого PDB (стадия 1.1) в колбу для шиканерии объемом 500 мл и дополните среду 500 мг/л цефотаксима.
  2. Добавьте Verticillium conida из хранилища глицерина в среду PDB. Закройте колбу стерильной пенной пробкой.
  3. Инкубируют культуру в течение 7-10 дней в темном ящике при комнатной температуре (РТ) при непрерывном горизонтальном встряхивании (ротационный шейкер; 60 об/мин). В результате образуются небольшие белые сферы мицелия.
  4. Осторожно удалите и выбросьте супернатант PDB. Большая часть мицелия должна остаться в колбе.
  5. Добавьте 100 мл жидкого CDB (стадия 1.2) на мицелий в колбе для шиканеров и дополните среду 500 мг/л цефотаксима.
  6. Инкубировать еще 4-5 дней в темном ящике при РТ при непрерывном горизонтальном встряхивании (вращательный шейкер, 60 об/мин), чтобы вызвать споруляцию. Супернатант станет желтовато-сероватым по мере высвобождения конидий.
  7. Отфильтруйте часть (5-10 мл) конидиасодержащей жидкости через фильтровальную бумагу (уровень удержания частиц 8-12 мкм) в стерильную 50 мл коллекторную трубку. Это отделяет споры от мицелия.
  8. Определите концентрацию спор с помощью камеры подсчета клеток и микроскопа. Разбавляют безмикробной средой 1/4 MS в сверхчистой воде до получения приведенных ниже концентраций спор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Под микроскопом конидии от V. longisporum в основном длиннотянутые и размером 7,1-8,8 мкм, в то время как V. dahliae conidia короче (3,5-5,5 мкм) и довольно сферические20.
  9. Используйте эти свежесобранные конидии в качестве инокулята. Следите за тем, чтобы эксперименты проводились всегда со свежесобранными конидиями, а не с замороженными запасами, так как замораживание значительно снижает количество жизнеспособных спор19.
  10. Для длительного хранения заморозьте споры в виде высококонцентрированного спорового раствора (приблизительно 1 х 108 спор/мл) в 25% глицерине при -80 °C (хранится до 1 года). Для следующих экспериментов используйте эти запасы глицерина для инокуляции среды PDB на этапе 3.2.

4. Стерильная система инокуляции in vitro на основе чашек Петри

ПРИМЕЧАНИЕ: Для системы чаш Петри17 убедитесь, что все оборудование и среды свободны от микробов и что все этапы выполняются в ламинарной вытяжке.

  1. После автоклавирования перелейте среду (см. шаг 1.3) в чашку Петри.
  2. После затвердевания среды переупакуйте чашки Петри в стерильный полиэтиленовый пакет и храните их вверх ногами на ночь в холодильнике (4-10 °C). Охлажденная среда помогает предотвратить скольжение среды на следующих этапах.
  3. Вырежьте и удалите инфекционный канал и верхнюю треть затвердевшей среды скальпелем (рисунок 1А). Избегайте попадания жидкости или воздуха под агаровую среду во время резки; в противном случае среда соскользнет и закроет инфекционный канал.
  4. Распределите 50-100 поверхностно-стерилизованных семян арабидопсиса стерильным наконечником пипетки по срезанной верхней поверхности. Поместите семена в угол, где поверхность срезанного агара соприкасается со стенкой чашки Петри, чтобы корни могли расти между средой и стенкой чашки Петри. Это облегчит прививку позже.
  5. Закройте чашки Петри и запечатайте их воздухопроницаемой клейкой лентой, чтобы обеспечить газообмен.
  6. После расслоения в течение 2 дней в темноте при 4 °C поместите пластины вертикально в подходящую стойку и выращивайте растения при 22 °C ± 1 °C в условиях длительного дня (16 ч света / 8 ч темноты) в камере роста.
  7. Когда большинство корней достигнет инфекционного канала (около 9-11-дневных саженцев), уложите пластины горизонтально, откройте их и добавьте 500 мкл свежесобранной Verticillium conidia с концентрацией 4 х 105 спор/мл непосредственно в инфекционный канал, убедившись, что жидкость равномерно распределена по каналу.
  8. Аналогично, подготовьте контрольные пластины, добавив 500 мкл макета раствора вместо спор (безмикробная среда 1/4 MS).
  9. Инкубируйте пластины горизонтально в течение нескольких минут, пока жидкость не впитается и не сможет вытечь, когда пластины снова установлены вертикально. Затем закройте крышку и запечатайте пластины воздухопроницаемой скотчем.
  10. Высиживайте пластины вертикально в камере роста. По желанию накройте части корней черными бумажными ящиками, чтобы затемнить корни и почвенный грибок (см.19).
  11. Выполните анализ в предпочтительные моменты времени после прививки в зависимости от исследовательского вопроса (см. условные обозначения фигур для точных временных точек, используемых здесь). Ниже приведены некоторые предложения.
    1. Срежьте листья с корней и соберите оба по отдельности. Выньте полоски агара из чашки Петри, чтобы легко получить доступ к корням, и осторожно вытащите их из агара с помощью щипцов. Заморозьте весь растительный материал немедленно в жидком азоте.
      1. Измельчите образцы в жидком азоте. Извлеките общую ДНК из 100 мг листового материала, чтобы определить с помощью количественной ПЦР (qPCR) количество грибковой ДНК относительно ДНК растений (см.19).
      2. Измельчите образцы в жидком азоте. Возьмите 100 мг растительного материала и извлеките общую РНК. Проводят количественную обратную транскрипцию ПЦР (qRT-PCR) для определения экспрессии генов растений (или грибковых генов) во время заражения (см.19).
    2. Осторожно извлеките корни из агара, избегая травм и осмотрите их под флуоресцентным микроскопом.
      1. Определение индукции маркерных генов в репортерных линиях растений (например, люциферазы, β-глюкуронидазы или флуоресцентных репортеров 17,19,21).
      2. Визуализируйте распространение грибка в корне с помощью грибковых репортерных линий (например, V. longisporum, конститутивно экспрессирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок, Vl-sGFP9) или методами окрашивания (например, через 5-бром-4-хлор-3-индиксил-N-ацетил-бета-d-глюкозаминид (X-beta-D-Glc-Nac)18).

5. Стерильная система инокуляции in vitro , организованная с пластиковыми стаканчиками

ПРИМЕЧАНИЕ: Как отмечалось в первом описании данного метода19, убедитесь, что все оборудование и среды не содержат микробов и что все этапы выполняются в ламинарной вытяжке.

  1. Используйте прозрачные пластиковые стаканчики общим объемом 500 мл и стерилизуйте их в 70%-75% этаноловой ванне в течение не менее 20 мин. Высушите чашки в ламинарной вытяжке.
  2. Вылейте автоклавную среду (см. шаг 1.4) в пластиковые стаканчики. Необязательно добавляют цефотаксим (конечная концентрация 50 мг/л) в автоклавную среду для предотвращения бактериального загрязнения. Используйте 150 мл среды на чашку для экспериментов с арабидопсисом или более средней (250-300 мл на чашку) для экспериментов с более крупными видами растений (рапс, помидор).
  3. Поместите пластиковый слой (стерилизованный ранее путем инкубации в 70%-75% этанола в течение 20 мин) на среду, прежде чем она затвердеет (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пластиковый слой содержит четыре сборных отверстия по углам для размещения поверхностно-стерилизованных семян. Это позволяет семенам получить доступ к среде. Позже этот разделительный слой предотвращает прикосновение листьев к грибосодержащей среде, так что микробы не могут напрямую атаковать листья и должны пройти корневой путь. Еще одно отверстие находится в центре, что позволяет перерезать инфекционный канал.
  4. Когда среда затвердеет, вырежьте агар скальпелем через сборное центральное отверстие на глубину около 1,5 см. Удалите разрезанный агар, чтобы создать инфекционный канал, в который грибковые споры могут быть добавлены позже.
  5. Слегка поцарапайте агаровую среду кончиком пипетки в четырех меньших отверстиях, чтобы прервать затвердевшую кожуру (это позволяет семенам впитывать воду из водянистой среды агара). Поместите семена с помощью наконечника пипетки в меньшие отверстия.
  6. Закройте пластиковый стакан вторым, перевернутым пластиковым стаканчиком и запечатайте воздухопроницаемой клейкой лентой. Лента должна обеспечивать газообмен.
  7. После расслоения в течение 3 дней в темноте при 4 °C инкубируют чашечные системы под 12 ч света / 12 ч темноты (арабидопсис, масличный рапс) или 16 ч при свете / 8 ч в условиях темноты (томат) в камерах роста при постоянной температуре 22 °C и влажности 60%.
  8. Следите за рекомендуемым возрастом растений для прививки: 21 день для арабидопсиса; 5-7 дней для масличного рапса; 12 дней для помидоров.
  9. Инокулируют растения Verticillium путем добавления 1 мл раствора конидий (рекомендуемая концентрация: 4 х 105 спор/мл) в инфекционный канал. Для подготовки контрольных образцов добавьте в канал 1 мл макетного раствора без спор (безмикробная среда 1/4 МС).
  10. Выполните анализ в предпочтительные моменты времени после прививки в зависимости от исследовательского вопроса (см. условные обозначения фигур для точных временных точек, используемых здесь). Ниже приведены некоторые предложения.
    1. Фотографируйте растения с помощью цифровой камеры сверху, сохраняя одинаковое расстояние для каждой фотографии. Количественно оцените площадь листьев (например, с помощью ImageJ22 или BlattFlaeche17,19; используйте длину чашек для установки шкалы) и сравните инфицированные и контрольные группы. Классифицируйте развитие симптомов заболевания (например, более мелкие, более желтоватые или некротические листья).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на Arabidopsis есть какие-либо стебли, удалите их, чтобы получить лучшие фотографии розеток.
    2. Удалите корни и определите биомассу (свежий вес) побегов из зараженных и контрольных образцов путем взвешивания. Определите относительный свежий вес19.
    3. Соберите образцы для молекулярного анализа следующим образом.
    4. Arabidopsis: Удалите стебли, если таковые имеются. Срежьте розетки у основания с корней. Обязательно исключите из образца весь корневой материал и соберите целые розетки. Смешайте 4-5 розеток с разных растений в один образец и заморозьте материал листьев в жидком азоте.
    5. Аккуратно вытащите корни из среды щипцами, прижмите и смажьте их бумажным полотенцем, чтобы удалить остатки агара, и соедините 4-5 корней с разных растений в один образец. Заморозить сразу в жидком азоте.
    6. Масличный рапс / помидор: Срежьте сегменты стебля из гипокотила (например, 1 см в длину; всегда берите одну и ту же область стебля). Смешайте материал из 4-5 растений в каждом образце и заморозьте в жидком азоте.
    7. Измельчите образцы в жидком азоте. Извлеките общую ДНК из 100 мг материала листа или стебля, чтобы определить с помощью qPCR количество грибковой ДНК относительно ДНК растений (см.19).
    8. Измельчите образцы в жидком азоте, возьмите 100 мг растительного материала и извлеките общую РНК. Провести qRT-PCR для определения экспрессии генов растений (или грибковых генов) при заражении (см.19).

6. Почвенная система посева в горшках

  1. Тщательно смешайте почву и песок в объемном соотношении 3:1 (почва:песок), чтобы облегчить смывание субстрата с корней. Перелейте смесь в автоклавный мешок. Если смесь слишком сухая, добавьте соответствующее количество воды и перемешайте ее с субстратом. Пар при 80 °C в течение 20 мин в автоклаве для минимизации микробных загрязнений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нагревания до температуры выше 80 °C, так как это может повлиять на органические питательные вещества почвы.
  2. Наполните горшки почвенно-песчаной смесью и переложите их в лотки. Добавьте воду в лотки примерно на 1/3 высоты горшка, чтобы почвенно-песчаная смесь тщательно пропиталась водой. Кроме того, опрыскивайте субстрат водой баллончиком для обеспечения влажных условий запуска.
  3. Посейте по 3-4 семени в каждом горшке (рисунок 1С), следя за тем, чтобы семена имели достаточное расстояние друг от друга. Держите их в течение 3 дней в темноте при 4 °C для расслоения для синхронизации прорастания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно культивировать избыток растений, что позволяет отбирать растения одинакового размера для экспериментов по прививке и уменьшает отклонения из-за индивидуальных различий.
  4. Пусть рассада растет в условиях долгого дня (16 ч света / 8 ч темноты; постоянная температура 22 °C; влажность 60%) при регулярном поливе.
  5. Следите за рекомендуемым возрастом растений для прививки: 21 день для арабидопсиса, 7 дней для масличного рапса и 10 дней для томата. Собирайте растения аналогичного размера для выполнения «корневой прививки»15,17,23,24. Выньте почву из горшков и аккуратно выкопайте корни.
  6. Осторожно промойте только корни в емкости для воды и держите розетки вне воды. Инкубировать промытые корни в течение 60 мин в чашке Петри, содержащей раствор спор Verticillium (рекомендуемая концентрация: 2 x 106 спор/мл). Для неинфицированной контрольной группы инкубируют корни в течение 60 мин в макете раствора без спор (без микробов 1/4 MS среды).
  7. Подготовьте новые горшки с влажной, стерилизованной паром почвой (80 °C в течение 20 мин) без песка. Используйте наконечник пипетки, чтобы сделать одно отверстие в центре почвы в каждом горшке.
  8. Непосредственно поместите корни в отверстие (перенесите только одно растение на горшок). После вставки корней убедитесь, что отверстия аккуратно засыпаются почвой. Избегайте давления на почву, иначе пересадка может вызвать симптомы стресса, такие как фиолетовые листья.
  9. Культивируют инфицированные и контрольные группы в условиях длительного дня (16 ч при светлой / 8 ч темноты; постоянная температура 22 °C; влажность 60%) при регулярном поливе.
  10. Выполните анализ в предпочтительные моменты времени после прививки в зависимости от исследовательского вопроса (см. условные обозначения фигур для точных временных точек, используемых здесь). Ниже приведены некоторые предложения.
    1. Фотографируйте растения цифровой камерой сверху, сохраняя дистанцию одинаковой для каждой фотографии. Количественно оцените площадь листьев (например, с помощью ImageJ22 или BlattFlaeche17,19; используйте диаметр горшков для установки шкалы) и сравните инфицированные и контрольные группы. Классифицируйте развитие симптомов заболевания (например, более мелкие, более желтоватые или некротические листья)13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление стеблей Arabidopsis облегчает фотографирование розеток.
    2. Удалите корни и определите биомассу (свежий вес) побегов из зараженных и контрольных образцов путем взвешивания. Определите относительный свежий вес19.
    3. В качестве альтернативы можно измерить высоту растения или классифицировать грибковый рост из сегментов стебля для оценки тяжести заболевания13.
    4. Соберите образцы для молекулярного анализа следующим образом.
    5. Арабидопсис: Удалите стебли. Срежьте розетки на корневой кроне. Смешайте 4-5 розеток из разных растений в один образец. Заморозьте материал листа в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае корней трудно очистить их в достаточной степени от почвы без перепрограммирования экспрессии генов путем промывки.
    6. Масличный рапс / помидор: Срежьте сегменты стебля из гипокотила (например, 1 см в длину; всегда берите одну и ту же область стебля). Смешайте материал из 4-5 растений в один образец и заморозьте его в жидком азоте.
    7. Измельчите образцы в жидком азоте. Извлеките общую ДНК из 100 мг листа или стеблевого материала, чтобы определить с помощью qPCR количество грибковой ДНК относительно ДНК растений (см.19).
    8. Измельчите образцы в жидком азоте, возьмите 100 мг растительного материала и извлеките общую РНК. Провести qRT-PCR для определения экспрессии генов растений (или грибковых генов) при заражении (см.19).

7. Анализ данных

  1. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение (± SD) на основе биологических реплик.
  2. Вычислите относительные значения, разделив все результаты из зараженной группы на результат элемента управления. Отображайте среднее значение, например, как «относительно макета» или «относительно дикого типа».
  3. Определение статистической значимости между группами.

figure-protocol-19915
Рисунок 1: Компиляция трех систем инокуляции и отдельных этапов в протоколах. Эти рисунки иллюстрируют системы с моделью растения Arabidopsis thaliana. Для других видов растений сроки должны быть скорректированы. Выделяются оранжевые поля, для которых наиболее рекомендуются последующие анализы с соответствующей системой. (A) Для системы прививки в чашках Петри17 налейте среду и дайте ей затвердеть. Храните тарелки в холодильнике на ночь. Затем скальпелем вырежьте и удалите верхнюю треть, а также инфекционный канал (IC) (белые участки на рисунке были удалены из агара, в то время как голубоватые области представляют агар). Поместите семена на срезанную поверхность и закройте чашку Петри. После расслоения поместите пластины вертикально и дайте растениям расти. Как только большая часть корней достигнет инфекционного канала, добавьте споровый раствор пипеткой непосредственно в канал. Убедитесь, что решение распределено равномерно. Закройте чашки Петри и высиживайте их вертикально в камере роста. Подходы, которые могут последовать, включают экспрессионный анализ с количественной обратной транскрипцией ПЦР (qRT-PCR), микроскопию с репортерными линиями и количественную оценку микробной ДНК. (B) Для системы прививки в пластиковых стаканчиках19 залить среду и перенести разделяющий пластиковый слой с помощью сборных отверстий (четыре небольших отверстия в углах для размещения семян и одно большое отверстие в центре инфекционного канала). Дайте среде затвердеть. Вырежьте и удалите агаровую среду в центральном отверстии скальпелем для получения инфекционного канала (IC). Поцарапайте среду в меньших отверстиях и перенесите семена. Закройте чашку перевернутой чашкой и запечатайте воздухопроницаемой лентой (обозначенной желтым цветом). Дайте растениям расти. Для прививки добавьте споровый раствор пипеткой непосредственно в инфекционный канал. Закройте систему и продолжайте выращивание в камере роста. Подходы, которые могут последовать, включают экспрессионный анализ с помощью qRT-PCR, количественную оценку микробной ДНК и определение свежего веса, площади листьев или других характеристик заболевания. С) "Корневая прививка"15,17,23,24: для почвенной системы посева заполняйте горшки смесью почвы с песком. Перенесите семена и дайте саженцам расти. Выкапывают растения аналогичного размера и вымывают корни в воде. Поместите промытые корни в чашку Петри, держа раствор со спорами. После инкубации вставить одиночные растения в горшки с почвой. Подходы, которые могут последовать, включают экспрессионный анализ листьев с помощью qRT-PCR, количественную оценку микробной ДНК и определение свежего веса, площади листьев или других характеристик заболевания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

В соответствии с протоколом растения культивировали и прививали V. longisporum (штамм Vl4325) или V. dahliae (изолят JR218). Различные сценарии были разработаны, чтобы доказать эффективность и подчеркнуть некоторые возможности данных протоколов. Показаны репрез...

Обсуждение

Из-за огромных потерь урожая, вызванных почвенными фитопатогенами1, требуется улучшение стратегий ведения сельского хозяйства или сортов сельскохозяйственных культур. Ограниченное понимание патогенеза почвенных заболеваний препятствует развитию более устойчивых раст?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность Тиму Ивену и Жаклин Коморек за предыдущую работу над этими методами, группе Вольфганга Дрёге-Лазера (кафедра фармацевтической биологии, Вюрцбургский университет, Германия) за предоставление оборудования и ресурсов, необходимых для этой работы, и Вольфганга Дрёге-Лазера, а также Филиппа Крейса (оба Вюрцбургского университета) за критическую корректуру рукописи. Это исследование было поддержано "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar (Gelrite)Carl RothNr. 0039all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-typeNASC stockCol-0 (N1092)
AutoclaveSystecVE-100
BlattFlaecheDatinf GmbHBlattFlaechesoftware to determine leaf areas
Brassica napus wild-typesee Floerl et al., 2008rapid-cycling rapegenome ACaacc
Cefotaxime sodiumDuchefaC0111
Chicanery flask 500 mLDuran Group / neoLabE-1090Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mLSarstedt62.547.254114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth mediumDuchefaC1714
Digital cameraNikonD3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator )Duran Group200 DN, 5.8 LSeal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence MicroscopeLeicaLeica TCS SP5 II
HClCarl RothP074.3
KNO3Carl RothP021.1≥ 99 %
KOHCarl Roth6751
LeukoporBSN medical GmbH2454-00 APnon-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)Carl Roth4256.2Pufferan ≥ 99 %
MgSO4Carl RothT888.1Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS)DuchefaM0222MS including vitamins
NaClOCarl Roth9062.1
Percival growth chambersCLF Plant Climatics GmbHAR-66L2
Petri-dishesSarstedt82.1473.001size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent)Pro-pac, salad boxx5070size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filterHartensteinFF12particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamberpoly klima GmbHPK 520 WLED
Potato Dextrose Broth mediumSIGMA AldrichP6685for microbiology
PotsPöppelmann GmbHTO 7 D or TO 9,5 DØ 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFPsee Poncini et al., 2017MYB51 reporter lineYFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mLSarstedt72.695.400PCR Performance tested
Rotary (orbital) shakerEdmund BühlerSM 30 C control
Sand (bird sand)Pet Bistro, Müller Holding786157
SoilEinheitserde spezialSP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-typesee Chavarro-Carrero et al., 2021Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamberMarienfeld642710depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water)MERKIQ 7003/7005water obtained after purification
Verticillium dahliaesee Reusche et al., 2014isolate JR2
Verticillium longisporumZeise and von Tiedemann, 2002strain Vl43

Ссылки

  1. Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
  2. Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
  3. Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
  4. Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
  5. Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
  6. Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
  7. Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
  8. Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
  9. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  10. Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
  11. Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
  12. Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
  13. Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
  14. Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
  15. Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
  16. Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
  17. Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
  18. Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
  19. Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
  20. Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
  21. Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
  24. Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
  25. Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
  26. Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
  27. Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
  28. Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
  29. Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
  30. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены