الثقافة الأولية للخلايا الجذعية لب الأسنان

Summary

تقدم هذه المقالة دليلا متدرجا لإنشاء مزرعة أولية للخلايا الجذعية لب الأسنان باستخدام طريقة زراعة الزرع وتوصيف هذه الخلايا بناء على إرشادات ICSCRT. يمكن اعتبار الخلايا المعزولة بواسطة هذا البروتوكول خلايا جذعية وسيطة لمزيد من التطبيقات.

Abstract

يمثل لب الأسنان البشري خزانا واعدا للخلايا الجذعية متعددة القدرات مع كفاءة تجديد بارزة يمكن حصادها من الأسنان المستخرجة. يمنح أصل اللحمة الخارجية المشتقة من القمة العصبية للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) درجة عالية من اللدونة التي تدين بفوائدها متعددة الأوجه في إصلاح الأنسجة وتجديدها. هناك العديد من الطرق العملية لحصاد الخلايا الجذعية البالغة والحفاظ عليها وتكاثرها والتي يتم التحقيق فيها لاستخدامها في الطب التجديدي. في هذا العمل ، نوضح إنشاء مزرعة الخلايا الجذعية الوسيطة الأولية من أنسجة الأسنان بطريقة زراعة الزرع. كانت الخلايا المعزولة على شكل مغزل والتقت بالسطح البلاستيكي للوحة الاستزراع. أظهر توصيف النمط الظاهري لهذه الخلايا الجذعية تعبيرا إيجابيا عن علامات سطح الخلية الموصى بها من قبل الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) ل MSC ، مثل CD90 و CD73 و CD105. علاوة على ذلك ، أكد التعبير الضئيل عن المكونة للدم (CD45) والعلامات البطانية (CD34) ، وأقل من 2٪ من تعبير علامات HLA-DR ، تجانس ونقاء ثقافات DPSC. لقد أوضحنا كذلك تعدد قدراتها بناء على التمايز إلى السلالات الدهنية والعظمية والغضروفية. كما حثثنا هذه الخلايا على التمايز إلى خلايا كبدية وخلايا شبيهة بالخلايا العصبية عن طريق إضافة وسائط تحفيز مناظرة. سيساعد هذا البروتوكول الأمثل في زراعة مجموعة قابلة للتوسيع بدرجة كبيرة من الخلايا الجذعية الوسيطة لاستخدامها في المختبر أو للدراسات قبل السريرية. يمكن دمج بروتوكولات مماثلة في الإعدادات السريرية لممارسة العلاجات القائمة على DPSC.

Introduction

تحولت الخلايا الجذعية البالغة إلى أداة علاجية قوية للعلاجات والعلاجات الموجهة بالخلايا بسبب اللدونة وآليات الباراكرين والخصائص المناعية^1،2،3. ألهمت البيانات المشجعة من الدراسات قبل السريرية القائمة على الخلايا الجذعية الباحثين للعمل من أجل الترجمة من مقاعد البدلاء إلى السرير. يلعب نوع الخلايا الجذعية المستخدمة في العلاج بالخلايا الجذعية دورا مهما في النتائج الناجحة. في الدراسات قبل السريرية والسريرية ، يظل المصدر الأكثر الإبلاغ عنه على نطاق واسع للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هو نخاع العظم ^4,5. ومع ذلك ، فإن العيوب ال....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات المعهد (IEC # 9195 / PG-12 ITRG / 2571-72) من PGIMER ، شانديغار. يجب إجراء جميع التجارب المتعلقة بزراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية (BSC) باتباع تقنية التعقيم. تم الحصول على لب الأسنان من الأسنان السليمة لثلاثة مرضى (F / 14 و M / 14 و M / 20) يخضعون لخلع الضرس الثالث لأسباب تقويم الأسنان. قبل جمع العينات ، تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المريض / الوصي وفقا للمبادئ التوجيهية المقدمة من لجنة الأخلاقيات في PGIMER ، شانديغار.

1. إنشاء مزرعة أولية للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من أنسجة الأسنان البشرية

النتائج

هنا ، نصف كيف يمكن للباحثين إنشاء ثقافة نقية من DPSCs عبر طريقة الزرع^{6،7،8،9،10} وحثهم على سلالات متعددة لإثبات نقاء الثقافة للتطبيقات النهائية.

أنشأنا مزرعة أولية ل DPSCs من الأنسجة الصغ.......

Discussion

لقد علقت الخلايا الجذعية آمالا في علاج العديد من الأمراض، نظرا لمرونتها، وقوتها، وخصائصها المناعية، وآلياتها الباراكرينية، وكفاءاتها. تعتبر أنسجة لب الأسنان المصدر الأكثر فعالية وقيمة للخلايا الجذعية ، مع اللدونة البارزة والقدرة على التجدد. هنا ، نوضح عزل DPSCs ، باستخدام طريقة الاستزراع.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G