JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة دليلا متدرجا لإنشاء مزرعة أولية للخلايا الجذعية لب الأسنان باستخدام طريقة زراعة الزرع وتوصيف هذه الخلايا بناء على إرشادات ICSCRT. يمكن اعتبار الخلايا المعزولة بواسطة هذا البروتوكول خلايا جذعية وسيطة لمزيد من التطبيقات.

Abstract

يمثل لب الأسنان البشري خزانا واعدا للخلايا الجذعية متعددة القدرات مع كفاءة تجديد بارزة يمكن حصادها من الأسنان المستخرجة. يمنح أصل اللحمة الخارجية المشتقة من القمة العصبية للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) درجة عالية من اللدونة التي تدين بفوائدها متعددة الأوجه في إصلاح الأنسجة وتجديدها. هناك العديد من الطرق العملية لحصاد الخلايا الجذعية البالغة والحفاظ عليها وتكاثرها والتي يتم التحقيق فيها لاستخدامها في الطب التجديدي. في هذا العمل ، نوضح إنشاء مزرعة الخلايا الجذعية الوسيطة الأولية من أنسجة الأسنان بطريقة زراعة الزرع. كانت الخلايا المعزولة على شكل مغزل والتقت بالسطح البلاستيكي للوحة الاستزراع. أظهر توصيف النمط الظاهري لهذه الخلايا الجذعية تعبيرا إيجابيا عن علامات سطح الخلية الموصى بها من قبل الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) ل MSC ، مثل CD90 و CD73 و CD105. علاوة على ذلك ، أكد التعبير الضئيل عن المكونة للدم (CD45) والعلامات البطانية (CD34) ، وأقل من 2٪ من تعبير علامات HLA-DR ، تجانس ونقاء ثقافات DPSC. لقد أوضحنا كذلك تعدد قدراتها بناء على التمايز إلى السلالات الدهنية والعظمية والغضروفية. كما حثثنا هذه الخلايا على التمايز إلى خلايا كبدية وخلايا شبيهة بالخلايا العصبية عن طريق إضافة وسائط تحفيز مناظرة. سيساعد هذا البروتوكول الأمثل في زراعة مجموعة قابلة للتوسيع بدرجة كبيرة من الخلايا الجذعية الوسيطة لاستخدامها في المختبر أو للدراسات قبل السريرية. يمكن دمج بروتوكولات مماثلة في الإعدادات السريرية لممارسة العلاجات القائمة على DPSC.

Introduction

تحولت الخلايا الجذعية البالغة إلى أداة علاجية قوية للعلاجات والعلاجات الموجهة بالخلايا بسبب اللدونة وآليات الباراكرين والخصائص المناعية1،2،3. ألهمت البيانات المشجعة من الدراسات قبل السريرية القائمة على الخلايا الجذعية الباحثين للعمل من أجل الترجمة من مقاعد البدلاء إلى السرير. يلعب نوع الخلايا الجذعية المستخدمة في العلاج بالخلايا الجذعية دورا مهما في النتائج الناجحة. في الدراسات قبل السريرية والسريرية ، يظل المصدر الأكثر الإبلاغ عنه على نطاق واسع للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هو نخاع العظم 4,5. ومع ذلك ، فإن العيوب الرئيسية لاستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام (BMSCs) تشمل سكانها النادرة ، والإجراءات الغازية للغاية للعزل ، وقدرتها المحدودة على التوسع. ولذلك، يجري استكشاف مصادر بديلة للالتزامات البحرية المتوسطة. في هذا الصدد ، تعتبر أنسجة الأسنان ، مع سهولة الوصول إليها ، واللدونة الهائلة ، وإمكانات التجدد العالية ، والقدرة التكاثرية العالية ، مصدرا بديلا غنيا ومحتملا للخلايا الجذعية6،7،8،9،10.

كانت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) أول نوع من الخلايا الجذعية السنية التي تم عزلها وتميزها بواسطة Gronthos في 200011. استحوذت DPSCs على الاهتمام لتطبيقات هندسة الأنسجة بسبب معدل انتشارها المرتفع ، وإمكانية التمايز الكبيرة ، وسهولة الوصول إليها من خلال الزراعة السهلة ، والأهم من ذلك ، قدرتها على الحصول عليها من الأسنان المهملة دون أي قلق أخلاقي12. يتم التحايل على القيود التي تفرضها مصادر الخلايا الجذعية الأخرى ، مثل BMSCs والخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) ، في عزلتها وقدراتها غير الكافية على التجديد الذاتي من قبل DPSCs13. يمكن الحصول على DPSCs البشرية من الأسنان الأولية البشرية ، والأسنان الدائمة ، وأسنان الحكمة ، والأسنان اللبنية المقشرة (SHEDs) ، والحليمات القمية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا عزل DPSCs عن الأسنان الزائدة ، والتي يتم التخلص منها بشكل عام14. تعبر DPSCs عن العلامات المرتبطة بالقمة العصبية ولديها القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية في كل من المختبر وفي الجسم الحي15. بالإضافة إلى إمكاناتها العصبية ، يمكن أن تتمايز DPSCs إلى سلالات خلايا أخرى ، مثل العظمية ، والغضروفية ، والدهنية ، والكبدية ، والعضلية ، عند إعطائها ظروف تمايز محددة13. وبالتالي ، فإن هذه الخلايا متعددة القدرات تحمل إمكانات كبيرة للعلاج القائم على الخلايا ويمكن استخدامها لتجديد الأنسجة المختلفة. أفادت الدراسات أيضا بالدور المحتمل ل DPSCs في إعادة بناء القرنية16 ، وإصلاح احتشاء عضلة القلب17 ، ودورها العلاجي المحتمل في أمراض مثل نقص تروية الأطراف18 ، ومرض الزهايمر 19 ، وباركنسون 20 ، والشيخوخة21. لذلك ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أنسجة الأسنان ليس فقط لتجديد الأسنان ، ولكن أيضا لإصلاح وتجديد الأعضاء غير السنية مثل العيون16 والقلوب17 والكبد22 والعظام23 وما إلى ذلك.

هناك طريقتان خاصتان لعزل سكان MSC عن أنسجة اللب - الهضم الأنزيمي وثقافة الزرع24,25. تم الإبلاغ عن نجاح إنشاء مزارع أولية دون أي اختلاف كبير في كمية وخصائص DPSCs بكلتا الطريقتين26. في هذه الدراسة ، ركزنا على عزل DPSCs بطريقة الزرع27 ، لأن هذه الطريقة تولد DPSCs دون تلوث الخلايا المكونة للدم والخلايا البطانية ، مقارنة بالهضم الأنزيمي الذي يمكن أن يؤدي إلى تلوث الخلايا الليفية28.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات المعهد (IEC # 9195 / PG-12 ITRG / 2571-72) من PGIMER ، شانديغار. يجب إجراء جميع التجارب المتعلقة بزراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية (BSC) باتباع تقنية التعقيم. تم الحصول على لب الأسنان من الأسنان السليمة لثلاثة مرضى (F / 14 و M / 14 و M / 20) يخضعون لخلع الضرس الثالث لأسباب تقويم الأسنان. قبل جمع العينات ، تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المريض / الوصي وفقا للمبادئ التوجيهية المقدمة من لجنة الأخلاقيات في PGIMER ، شانديغار.

1. إنشاء مزرعة أولية للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من أنسجة الأسنان البشرية

ملاحظة: لا ينبغي استخدام أي أسنان متسوسة.

  1. جمع عينات لب الأسنان ونقلها إلى مختبر زراعة الأنسجة
    1. إجراء عملية قلع الأسنان في ظل ظروف غير مؤلمة ومعقمة. شطف السن المستخرج جيدا بمحلول ملحي معقم لإزالة بقايا الدم.
    2. قطع السن المستخرج طوليا إلى قطعتين باستخدام شق كربيد مع الري المستمر مع محلول ملحي طبيعي معقم لفضح اللب.
    3. انقل السن المستخرج مع اللب السليم في وسائط أساسية معقمة α الحد الأدنى (α-MEM) محفوظة على الجليد إلى مختبر زراعة الخلايا والأنسجة.
      ملاحظة: من الناحية المثالية ، قم بمعالجة جميع العينات المستلمة في غضون 2 ساعة لزراعة الخلايا. ومع ذلك ، فقد اقترح تقرير حديث أن معالجة عينة الأسنان حتى بعد 24 ساعة لم تؤثر على صلاحية وانتشار DPSCs ، ومع ذلك ، فقد قللت من وظائفها29.

2. إزالة أنسجة اللب من زراعة الأسنان والخلايا في DPSCs (الوقت: 60-120 دقيقة)

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات بعد نقل الأسنان في مختبر زراعة الخلايا والأنسجة داخل خزانة السلامة الحيوية المستوى 2.

  1. ضع عينة الأسنان في أطباق بتري معقمة واشطفها جيدا (ثلاث أو أربع مرات) بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) 1x.
  2. قم بإزالة أنسجة اللب بعناية من تجويف اللب بمساعدة حفارة وملقط حاد.
  3. بمجرد إزالة اللب ، قم بتنظيفه جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني معقم لإزالة أي بقايا دم.
  4. قطع أنسجة اللب إلى قطع صغيرة من حوالي 2-3 ملم بمساعدة شفرة جراحية في طبق بتري.
    1. قسم مساحة سطح الطبق إلى أربعة أجزاء عن طريق وضع 1-2 مل من برنامج تلفزيوني معقم في كل منطقة. ضع عينة أنسجة اللب في منطقة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني وقطع الأنسجة إلى أصغر قطع ممكنة بشفرة جراحية (كلما كانت القطعة أصغر ، كان من الأسهل على الخلايا الجذعية الهجرة خارج الأنسجة). بعد ذلك ، قم بنقل كل قطعة عن طريق رفعها إلى منطقة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني ، وهكذا حتى المنطقة الرابعة ، بحيث يتم غسل قطع الأنسجة بشكل صحيح وخالية من أي ملوثات.
  5. وفي الوقت نفسه ، صب ما يقرب من 0.8-1 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية التي تحتوي على α-MEM مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وكوكتيل مضاد حيوي (مثل البنسلين والستربتومايسين) في آبار صفيحة من 6 آبار. قم بتوزيع الوسائط بشكل موحد عن طريق تحريك اللوحة ، وذلك لنشرها بالتساوي على سطح البئر.
  6. قم بزرع القطع الصغيرة من أنسجة اللب أو النباتات بمساعدة ملقط في بئر واحد (أربع إلى ست قطع لكل بئر) من اللوحة المكونة من 6 آبار واحتفظ باللوحة دون إزعاج لمدة 5 دقائق في غطاء السلامة البيولوجية.
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة / تساعد في التصاق الأنسجة / النباتات بالأسطح المعالجة لألواح الاستزراع.
  7. حافظ على لوحة الاستزراع في جو مرطب بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ومستوى 5٪ CO2.
  8. في اليوم التالي ، استنشق الوسائط بعناية من الآبار دون إزعاج النباتات وإضافة وسائط جديدة إليها. قم بتغيير الوسائط كل يوم في هذه الخطوة لمنع الجفاف. تأكد من أن الحاضنة تحتوي على كمية كافية من الماء في الدرج حتى لا يتسبب التبخر الإضافي في جفاف الوسائط الموجودة في آبار الصفيحة.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة للغاية ، ويمكن أن يتسبب الاضطراب في إزاحة النباتات من موضعها. إذا تم إزاحة قطع الزرع من موضعها أثناء نقل الوسائط ، فحاول إعادة توصيلها عن طريق إزالة الوسائط تماما وتركها تلتصق بسطح البئر. يجب إضافة الوسائط بعناية على طول جدار البئر دون إزعاج النباتات ، وإلا فقد تنفصل مرة أخرى. راقب لوحات زراعة الخلايا بانتظام تحت المجهر المقلوب (تكبير 4x أو 10x). تحديد DPSCs من خلال قدرتها على الالتصاق بالسطح البلاستيكي ومورفولوجيتها على شكل مغزل.
  9. بمجرد أن تهاجر خلايا كافية من النباتات ، قم بإزالة الأنسجة والسماح للخلايا بالتكاثر والوصول إلى التقاء الخلايا الأمثل بنسبة 70٪ -75٪ قبل الزراعة الفرعية. يمكن زيادة حجم α-MEM الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى 2 مل في هذه الخطوة بحيث يمكن للخلايا الانقسام بشكل أسرع. تغيير وسائل الإعلام كل يوم ثالث في هذه المرحلة.

3. توسيع DPSC

  1. اغسل قارورة الثقافة T75 المتقاربة (التقارب: 70٪ -80٪) من DPSCs مرتين باستخدام PBS (10 مل).
  2. أضف 2.5 مل من 0.25٪ حمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) إلى جانب دورق T75 وقم بتدويره برفق للتأكد من أن التربسين-EDTA يغطي ورقة الخلية بأكملها أو الطبقة الأحادية من DPSCs.
  3. احتفظ بالقارورة داخل الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. بعد 3 دقائق ، اضغط برفق على القارورة لضمان تفكك الخلايا.
  4. أضف 5 مل من الوسائط الكاملة (α-MEM مع 10٪ FBS) أو 250 ميكرولتر من FBS (10٪ من حجم التربسين المستخدم) كعامل معادلة لتعطيل نشاط التربسين. انقل تعليق الخلية بالكامل ل DPSCs المنفصلة في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 15 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المنفصلة في 500 × غرام لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحصول على بيليه الخلية.
  6. نضح كل طاف باستخدام ماصة ، إضافة 5-10 مل من PBS إلى القارورة لجمع الخلايا المتبقية ، وغسل الخلية في PBS مع ماصة لطيفة ، والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 500 × غرام لمدة 2 دقيقة. كرر إذا لزم الأمر.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسائط الكاملة (α-MEM مع 10٪ FBS) بعد إزالة المادة الطافية بعناية وإجراء ماصة لطيفة للحصول على تعليق أحادي الخلية.
  8. قسم الخلايا وزرعها (حجم متساو) إلى قارورة ثقافة T75 ، تحتوي كل منها على 10 مل من الوسائط الكاملة الكاملة. احتفظ بالقارورة داخل غطاء المحرك عند 37 درجة مئوية.
  9. في اليوم التالي ، استنشق الوسائط واستبدلها بالوسائط الكاملة الجديدة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي إطالة علاج التربسين إلى الإضرار بسلامة الخلية وقدرتها على البقاء ووظيفة الخلية عن طريق شق بروتين سطح الخلية وبروتين المصفوفة خارج الخلية.

4. تحديد علامات النمط الظاهري للخلايا الجذعية (الوقت: 90 - 120 دقيقة)

ملاحظة: لتوصيف الخلايا التي يتم حصادها من أنسجة اللب ، استخدم الخلايا بين الممر الثالث والخامس.

  1. استخدم اثنين من 70٪ -80٪ (~ 3-4 × 106 خلايا ؛ عد الخلايا باستخدام مقياس خلوي قائم على الصورة أو مقياس دموية) قوارير ثقافة T75 متقاربة من DPSCs واغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 مل من PBS.
  2. أضف 2.5 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA واحتفظ بالقارورة داخل الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. أضف 5 مل من الوسائط الكاملة أو 250 ميكرولتر من FBS (10٪ من حجم التربسين المستخدم) كعامل معادل لتعطيل نشاط التربسين.
  3. اجمع الخلايا باستخدام ماصة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المنفصلة في 500 × غرام لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحصول على بيليه الخلية.
  4. نضح كل طافات باستخدام ماصة ، إضافة 5 مل من PBS إلى القارورة لجمع الخلايا المتبقية ، وغسل الخلية في PBS مع ماصة لطيفة ، والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 500 × غرام لمدة 2 دقيقة.
  5. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS بعد إزالة المادة الطافية بعناية وقم بإجراء ماصة لطيفة للحصول على تعليق أحادي الخلية.
  6. عد الخلايا باستخدام مقياس خلوي قائم على الصور أو مقياس الدم ، اعتمادا على التوافر ، وقم بتوزيعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في 1 × 104 خلايا / أنبوب. احتضان الخلايا في 0.5٪ -1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 0.5-1 ساعة.
  7. أضف إلى كل أنبوب 1-2 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة من الفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) و phycoerythrin (PE) لمجموعة علامات التمايز (CD) (أي CD90 [0.4 ميكروغرام] ، CD73 [0.8 ميكروغرام] ، CD105 [0.4 ميكروغرام] ، CD34 [0.8 ميكروغرام] ، CD45 [0.4 ميكروغرام] ، و HLA-DR [0.08 ميكروغرام]) 6،7،8،9 واحتضانها لمدة 0.5 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  8. بعد 0.5 ساعة ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. نضح الطافد ، وغسل بيليه الخلايا مع برنامج تلفزيوني ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
  9. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في PBS (200 ميكرولتر / أنبوب) ، وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي ، واحصل عليها باستخدام مقياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام أي برنامج تجاري لتحليل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية بشكل أكبر للأجسام المضادة المختلفة.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات من 4.7 إلى 4.9 في الظلام في درجة حرارة الغرفة. يجب استخدام ضوابط النمط المتماثل المناسبة والعينات غير الملوثة لحذف مضان الخلفية للخلايا.

5. تمايز DPSC إلى سلالات متعددة

ملاحظة: استخدم 75٪ -80٪ ثقافات متقاربة من DPSCs في المقطع الثالث إلى الخامس لتقييم تعدد القدرات. يجب استخدام مجموعة خلايا تحكم تحتوي على α-MEM لجميع أنواع التمايز الموضحة أدناه.

  1. التمايز العظمي ل DPSCs ، تلطيخ أحمر أليزارين ، والقياس الكمي
    1. قم بعمل تعليق أحادي الخلية باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 4.2 ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في α-MEM كاملة.
    2. عد الخلايا وزرعها في 24 صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة بشكل جيد عند كثافة خلايا 2 × 104 / خلية بئر تحتوي على 0.4-0.5 مل من الوسائط الكاملة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    3. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الوسائط من الآبار وأضف 0.4-0.5 مل من الوسائط الاستقرائية العظمية (أي α-MEM مع عوامل حثية عظمية المنشأ مثل بيتا جليسيروفوسفات [5 مللي مول] ، فوسفات أحادي البوتاسيوم [1.8 مللي مول] ، وفوسفات ديكساميثازون ثنائي الصوديوم [0.01 مللي مول])8. تحضير آبار التحكم (الخلايا غير المستحثة) التي تحتوي على α-MEM كاملة فقط بدون أي عوامل حثية عظمية (وسائط التحكم).
      ملاحظة: تم الإبلاغ أيضا عن إضافة أسكوربات 50 ميكرومتر لتعزيز التمايز العظمي 30,31. بعد كل يوم ثالث ، استبدل الوسائط التعريفية ووسائط التحكم بوسائط وثقافة جديدة لمدة 21 يوما (3 أسابيع). في نهاية فترة الحث ، قم بإزالة الوسائط من ألواح الثقافة ، وأضف 0.5 مل من PBS ، واغسلها مرتين.
    4. بعد غسل PBS ، ثبت الخلايا في 0.5 مل من محلول الفورمالين المخزن المحايد (NBF) بنسبة 10٪ لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء التثبيت في غطاء دخان / كيميائي.
  2. تلطيخ أحمر أليزارين
    1. تحضير صبغة الأليزارين الحمراء S (2٪) عن طريق إذابة 1 غرام من الأليزارين الأحمر S في 50 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.0-4.2 بمساعدة حمض الهيدروكلوريك (HCL) أو هيدروكسيد الأمونيوم (NH4OH). قم بتصفية البقعة باستخدام ورق الترشيح. قم بتخزين البقعة في الظلام (4 درجات مئوية).
    2. اغسل الخلايا مرتين بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) ، وأضف صبغة S الحمراء الأليزارين ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة.
    3. قم بإزالة البقعة من جميع الآبار واغسل الخلايا أربع أو خمس مرات باستخدام ddH2O لإزالة أي بقعة غير منضمة. التقط الصور باستخدام مجهر المجال الساطع.
  3. استخراج البقع الحمراء Alizarin للتحليل الكمي
    1. أضف محلول كلوريد سيتيل بيريدينيوم (CPC) (درجة الحموضة 7.0) إلى الآبار الملطخة (0.4 مل / بئر) واحتضان الخلايا لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تحضين الخلايا بحمض الأسيتيك بنسبة 10٪ من أجل الذوبان السليم لبلورات أليزارين الحمراء32. الحفاظ على لوحات على لوحة الروك أو شاكر.
    2. بعد الحضانة ، اجمع المادة الطافية (الصبغة المستخرجة) ، وانقلها إلى صفيحة 96 بئرا ، واقرأ اللوحة أو العينات عند 405 نانومتر. للحصول على قيمة فارغة ، أضف المخزن المؤقت CPC (نفس وحدة التخزين) فقط واقرأ32,33 .

6. التمايز الأديبوجيني ل DPSCs ، تلطيخ O الأحمر الزيتي ، والقياس الكمي

ملاحظة: الخطوات الأولية للبذر هي نفسها المذكورة أعلاه (أي خطوة التمايز العظمي 5.1).

  1. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الوسائط من الآبار وأضف 0.4-0.5 مل من الوسائط الحثية الشحمية (أي α-MEM مع عوامل حثية دهنية مثل إيزوبوتيل ميثيل زانثين [IBMX ؛ 0.5 mM] ، ديكساميثازون [1 ميكرومتر] ، إندوميتاسين [200 ميكرومتر] ، والأنسولين [10 ميكرومتر])8. تحضير آبار التحكم التي تحتوي على خلايا غير مستحثة (أي مستزرعة في α-MEM فقط بدون عوامل حثية {وسائط التحكم]).
  2. تجديد وسائل الإعلام كل يوم ثالث وثقافة الخلايا لمدة 3 أسابيع. بعد 3 أسابيع ، استنشق الوسائط من لوحات الثقافة وأضف 0.5 مل من PBS لغسل الخلايا مرتين.
  3. بعد غسل PBS ، ثبت الخلايا في محلول NBF بنسبة 10٪ لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. اغسل الخلايا مرتين بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) ، وأضف صبغة O الحمراء الزيتية ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-40 دقيقة.
  5. قم بإزالة البقعة من جميع الآبار وشطف الآبار التي تحتوي على الخلايا بشكل متكرر باستخدام ddH2O حتى تصبح صافية (مرتين إلى أربع مرات). مراقبة تحت المجهر والتقاط الصور.
  6. استخراج النفط الأحمر O للتحليل الكمي
    1. أضف 0.4 مل من 100٪ 2-بروبانول إلى الآبار الملطخة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة عن طريق تغطية اللوحة بشكل صحيح لمدة 30 دقيقة. الحفاظ على لوحة الروك أو شاكر.
    2. بعد الحضانة ، اجمع المادة الطافية ، وانقلها إلى لوحة 96 بئرا ، واقرأ اللوحة أو العينات عند 510 نانومتر. استخدم 100٪ 2-بروبانول للطمس.

7. التمايز الغضروفي ل DPSCs ، تلطيخ ألسيان الأزرق ، والقياس الكمي

ملاحظة: تم إحداث تمايز غضروفي في الثقافة أحادية الطبقة ل DPSCs. الخطوات الأولية للبذر هي نفسها المذكورة أعلاه (أي خطوة التمايز العظمي 5.1).

  1. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الوسائط من الآبار وأضف 0.4-0.5 مل من وسائط الحث الغضروفي (أي α-MEM مع عوامل حثية محددة للتمايز الغضروفي ، وحمض الأسكوربيك [0.2 M] ، وبيروفات الصوديوم [1 mM] ، وتحويل عامل النمو بيتا 3 [TGF-β3 ؛ 10 μM] ، ديكساميثازون [1 mM] ، و 1x ITS بريمكس [الأنسولين ، الترانسفيرين ، وحمض السيلينوس)10. تحضير آبار التحكم التي تحتوي على خلايا غير مستحثة (أي مستزرعة في α-MEM فقط بدون عوامل حثية [وسائط التحكم]).
  2. تجديد وسائل الإعلام كل يوم ثالث وثقافة الخلايا لمدة 3 أسابيع. بعد نهاية فترة الحث ، استنشق الوسائط من لوحات الثقافة وأضف 0.5 مل من PBS لغسل الخلايا مرتين.
  3. بعد غسل PBS ، ثبت الخلايا في محلول NBF بنسبة 10٪ لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا مرتين أو ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) ، وأضف صبغة Alcian الزرقاء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  4. قم بإزالة البقعة من جميع الآبار ، متبوعا بالشطف ب 0.1 N HCL مرتين أو ثلاث مرات. اغسل الخلايا أربعة أو أعط أوقاتا باستخدام ddH2O.
  5. مراقبة خلايا البروتيوغليكان (اللون الأزرق) تحت المجهر والتقاط الصور.
  6. بالنسبة للقياس الكمي الأزرق Alcian ، استخرج الصبغة باستخدام 6 M guanidine-HCl واقرأ العينات بكثافة بصرية (OD) تبلغ 595 نانومتر. تقوم مجموعة Alcian blue المستخدمة في هذه الدراسة بصبغ البروتيوغليكان الحمضي في الغضروف وتربط بشكل خاص الجليكوزامينوجليكان الكبريتي (GAGs) الموجود في مصفوفة الخلايا الغضروفية10.

8. تمايز DPSCs نحو النسب والتوصيف الشبيه بالكبد

  1. قم بعمل تعليق أحادي الخلية للخلايا عن طريق علاج التربسين ، كما هو موضح أعلاه ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في α-MEM كاملة.
  2. عد الخلايا وزرعها في 24 لوحة استزراع معالجة جيدا عند 2 × 104 خلايا / بئر تحتوي على 0.4-0.5 مل من الوسائط الكاملة لمدة 48 ساعة.
  3. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الوسائط من الآبار واحتضان الخلايا بوسط تحريض كبدي لمدة 14 يوما. تتكون وسائط الحث من وسط النسر المعدل منخفض الجلوكوز من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على ديكساميثازون (0.5 ميكرومتر) ، وعامل نمو البشرة (EGF ؛ 2 نانوغرام / مل) ، و ITS + بريمكس (50 مجم / مل) ، وعامل نمو خلايا الكبد (HGF ؛ 20 نانوغرام / مل) 6.
  4. بعد 14 يوما ، استبدل الوسائط بوسط النضج لمدة 14 يوما أخرى (α-MEM المكمل ب Oncostatin M [OSM ؛ 20 نانوغرام / مل] ، ITS premix [50 مجم / مل] ، وديكساميثازون [0.5 ميكرومتر]) 6. تجديد وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الجديدة بعد كل يوم ثالث.
  5. إجراء تحليل الكيمياء الهيستولوجية المناعية ومقايسة البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) لتأكيد التمايز الشبيه بالكبد.
    1. امتصاص LDL وتلطيخ المناعي لمستقبلات LDL
      ملاحظة: تميزت الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد بعد التمايز بمجموعة مقايسة امتصاص LDL وفقا لتعليمات المجموعة. تم استخدام فلوروكروم LDL-550 لتقييم امتصاص LDL في الخلايا المتمايزة تحت الحالة الحية وتم استخدام الجسم المضاد لمستقبلات LDL للكشف عن مستقبلات LDL في الخلايا المتمايزة بعد التثبيت.
      1. بعد التمايز ، وصمة عار الخلايا الحية مع LDL-550 (1: 100) لمدة 3-4 ساعات. بعد 3-4 ساعات ، استبدل محلول التلوين بوسائط الاستزراع ولاحظ امتصاص LDL تحت مجهر فلوري قادر على إثارة يوديد البروبيديوم (PI) والأطوال الموجية للانبعاث عند 537 و 617 نانومتر ، على التوالي.
      2. إصلاح الخلايا في الحل المثبت لمدة 10 دقائق. بعد تثبيت الخلية ، قم بحظر الخلايا في محلول الحظر لمدة 30 دقيقة.
      3. احتضان الخلايا بجسم مضاد لمستقبلات LDL الأولية لمدة ساعة واحدة ، واغسلها باستخدام 1x PBS ثلاث مرات ، ثم احتضانها ب 488 جسما مضادا ثانويا (1: 100) لمدة ساعة واحدة في الظلام.
      4. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. أضف 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) كصبغة نووية.
      5. مراقبة الخلايا تحت المجهر مضان. التقط صورا باستخدام مجهر الفلورسنت القادر على قياس الأطوال الموجية في نطاق الإثارة / الانبعاث ل DAPI و PI و FITC.
        ملاحظة: يمكن تسجيل معلمات شدة الخلية الواحدة لتحديد تعبير الجسم المضاد لمستقبلات LDL وامتصاص LDL. يجب استخدام عناصر التحكم المناسبة في الأجسام المضادة الثانوية لتلطيخ التألق المناعي لحذف مضان الخلفية الناتج عن الجسم المضاد الثانوي فقط.

9. التمايز العصبي ل DPSCs نحو النسب والتوصيف الشبيه بالخلايا العصبية

  1. بعد طلاء الخلايا ، كما هو موضح أعلاه ، قم بزراعة الخلايا في α-MEM لمدة 48 ساعة.
  2. نضح الوسائط واستبدلها بوسائط عصبية قاعدية تحتوي على عوامل نمو مثل 0.5٪ مكمل G5 ، 0.2٪ مكمل N2 ، عامل نمو البشرة 20 نانوغرام / مل ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية 20 نانوغرام / مل ، ومكمل B27 (1٪). ثقافة الخلايا في هذا الإعلام لمدة 25-41 يوما7.
  3. قم بتغيير الوسائط كل يومين أو ثلاثة أيام ، اعتمادا على عملية التمثيل الغذائي بواسطة الخلايا. لتحقيق نضوج عصبي فعال والمزيد من الخلايا العصبية المرتبطة بالبروتين 2 (MAP-2+) المرتبط بالأنابيب الدقيقة ، قم بإزالة EGF وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2) بعد مرحلة تحريض الخلايا العصبية (14 يوما).
    ملاحظة: بمرور الوقت وبعد تغيير الوسائط المتكرر ، قد تظهر الخلايا العصبية المتمايزة انفصالا عن آبار الألواح بسبب انخفاض الالتصاق ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية في الثقافة طويلة الأجل. لتجنب ذلك ، قم بتغطية آبار الألواح باللامينين أو الفبرونيكتين (اختياري).
  4. إجراء تحليل الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتأكيد التمايز الشبيه بالخلايا العصبية.
    1. تلطيخ مناعي ل DPSCs المتمايزة
      ملاحظة: لتأكيد التمايز الشبيه بالخلايا العصبية ل DPSCs ، تم إجراء الكيمياء الخلوية المناعية في الخلايا المتمايزة باستخدام الأجسام المضادة MAP-2 والخيوط العصبية (NFM) ، وهي بروتينات خاصة بالنسب العصبي7.
      1. قم بإزالة الوسائط الثقافية بعد اكتمال التمايز. أضف PBS ، وقم بتدوير اللوحة برفق ، وقم بإزالة PBS بمساعدة ماصة. كرر الخطوة.
      2. ثبت الخلايا باستخدام 10٪ NBF أو 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      3. قم بإزالة المثبت وغسل الخلايا باستخدام 1x PBS مرتين أو ثلاث مرات. أضف محلول النفاذية (Triton-X-100 ؛ 0.1٪) واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق.
      4. قم بإجراء غسل PBS مرتين أو ثلاث مرات وقم بسد الخلايا بعامل مانع 0.5٪ -1٪ (BSA) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة عامل الحظر وغسل الخلايا باستخدام 1x PBS.
      5. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية (أعدت في 0.1٪ BSA ، NFM [1:50] ، و MAP-2 [1: 200]).
      6. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واغسل الخلايا باستخدام 1x PBS ثلاث أو أربع مرات لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة.
      7. أضف أجساما مضادة ثانوية (أرنب مضاد للفأر 1: 2000) واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5-2 ساعة في الظلام. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني (مرتين أو ثلاث مرات).
      8. احتضان الخلايا في DAPI لمدة 10 دقائق واغسلها مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني. احتفظ بالحجم المتبقي لتجنب جفاف العينة. مراقبة تحت المجهر مضان.
        ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا إجراء استقرار النمط النووي10 وتوصيف الشيخوخة للحصول على فكرة أفضل عن نقاء الخلايا ووظائفها.

النتائج

هنا ، نصف كيف يمكن للباحثين إنشاء ثقافة نقية من DPSCs عبر طريقة الزرع6،7،8،9،10 وحثهم على سلالات متعددة لإثبات نقاء الثقافة للتطبيقات النهائية.

أنشأنا مزرعة أولية ل DPSCs من الأنسجة الصغ...

Discussion

لقد علقت الخلايا الجذعية آمالا في علاج العديد من الأمراض، نظرا لمرونتها، وقوتها، وخصائصها المناعية، وآلياتها الباراكرينية، وكفاءاتها. تعتبر أنسجة لب الأسنان المصدر الأكثر فعالية وقيمة للخلايا الجذعية ، مع اللدونة البارزة والقدرة على التجدد. هنا ، نوضح عزل DPSCs ، باستخدام طريقة الاستزراع...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح المالية أو غير المالية.

Acknowledgements

نحن نقر بالدعم التمويلي ل AK من إدارة البحوث الصحية (DHR) ، ICMR ، حكومة الهند (DHR-NRI Grant # R.12015/01/2022-HR). تلقت SR تمويلا من ICMR ، حكومة الهند (Grant # 2020-7593 / SCR-BMS) وحصلت PS على زمالة من CSIR ، حكومة الهند. نحن ممتنون أيضا للسيدة سانديا توخي والسيدة بوبيندر كور للمساعدة في قياس التدفق الخلوي ، ونواة الأجهزة المركزية المتطورة (CSIC) و PGIMER ، شانديغار لتوفير دعم البنية التحتية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well cell culture plateCostar3516For cell culture
Alcian blue stainEZstain chondrocyte staining kit, HiMediaCCK029
alizarin red S stainSigma-AldrichTMS-008Osteogenic stain
Antibiotic cocktailHimediaA002-5X50MLTo prevent culture contamination
Ascorbic AcidHimediaTC094-25GChondrogenic induction
B27 supplementGibco17504044For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)GibcoPHG0024For neural induction
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)Sigma-Aldrich1104006For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodiumSigma-AldrichD1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineHimediaTS1006-5LFor washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)GibcoPHG0311For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscopeInvitrogenFor  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kitHimediaCCK029-1KTChondro stain Kit
FACS Canto flow cytometerBD BiosciencesFor cell characterization
Fetal Bovine SerumGibco16000044For primary culture
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442For cell culture
G5 supplementGibco17503012For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)Sigma-AldrichH1404For hepatic Induction
HLA-DRBiolegend307605
 Human TGF-β3Peprotech#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premixSigma-AldrichI3146For hepatic Induction
ITS premixCorning354350
LDL Uptake Assay kitAbcamab133127For hepatic characterization
Low glucose DMEMGibco11885-084For hepatic induction
MAP2 antibodySigma-AldrichM4403For neural characterization
N2 supplementGibco17502048For neural induction
Neural Basal MediaGibco21103049For neural induction
NFM antibodySigma-AldrichN4142For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscopeNikonFor  fluorescence imaging
Oil Red OSigma-Aldrich01391-250MlAdipogenic stain
Oncostatin MR&D Systems295-OM-010/CFFor hepatic Induction
PetridishTarson460090-90MMFor tissue cutting
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich15655-100GOsteogenic induction
Propan-2-olThermo FisherQ13827For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solutionSigma life sciencesS8636-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049For cell passaging
Whatman filter papermerckWHA1001325filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)Sigma-AldrichM0643-10X 1LMedia for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422-50G

References

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulation Research. 124 (6), 837-839 (2019).
  3. Raik, S., Kumar, A., Bhattacharyya, S. Insights into cell-free therapeutic approach: Role of stem cell "soup-ernatant". Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (2), 104-118 (2018).
  4. Rodriguez-Fuentes, D. E., et al. Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review. Archives of Medical Research. 52 (1), 93-101 (2021).
  5. Yamazaki, K., Kawabori, M., Seki, T., Houkin, K. Clinical trials of stem cell treatment for spinal cord injury. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3994 (2020).
  6. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific Reports. 7 (1), 15015 (2017).
  7. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  8. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome proteins regulate comparative osteogenic and adipogenic potential in bone marrow and dental stem cells. Biochimie. 155, 129-139 (2018).
  9. Kumar, A., Bhattacharyya, S., Rattan, V. Effect of uncontrolled freezing on biological characteristics of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Bank. 16 (4), 513-522 (2015).
  10. Raik, S., et al. Assessment of post-thaw quality of dental mesenchymal stromal cells after long-term cryopreservation by uncontrolled freezing. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (2), 728-743 (2020).
  11. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  12. Tsutsui, T. W. Dental pulp stem cells: advances to applications. Stem Cells and Cloning. 13, 33-42 (2020).
  13. Huang, G. T. -. J., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  14. La Noce, M., et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. Journal of Dentistry. 42 (7), 761-768 (2014).
  15. Xiao, L., Tsutsui, T. Characterization of human dental pulp cells-derived spheroids in serum-free medium: stem cells in the core. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2624-2636 (2013).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
  17. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26 (3), 638-645 (2008).
  18. Yong, Z., et al. Comparison of the angiogenic ability between SHED and DPSC in a mice model with critical limb ischemic. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (4), 861-870 (2022).
  19. Zhang, X. M., et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cell transplantation in a rat model of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 16 (5), 893-898 (2021).
  20. Kabir, R., et al. Imperative role of dental pulp stem cells in regenerative therapies: a systematic review. Nigerian Journal of Surgery. 20 (1), 1-8 (2014).
  21. Kumar, A., et al. Dental pulp stem cell secretome ameliorates d-galactose induced accelerated aging in rat model. Cell Biochemistry and Function. 40 (5), 535-545 (2022).
  22. Hirata, M., et al. Multifaceted therapeutic benefits of factors derived from dental pulp stem cells for mouse liver fibrosis. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1416-1424 (2016).
  23. Fujii, Y., et al. regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 24 (2018).
  24. Ferrua, C. P., et al. How has dental pulp stem cells isolation been conducted? A scoping review. Brazilian Oral Research. 31, e87 (2017).
  25. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica. 65 (3), 124-133 (2019).
  26. Tatullo, M., Marrelli, M., Shakesheff, K. M., White, L. J. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 1205-1216 (2015).
  27. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  28. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), e12334 (2017).
  29. Aryal Ac, S., Islam, M. S., Samsudin, A. R. Investigation of the effect of a time delay on the characteristics and survival of dental pulp stem cells from extracted teeth. Archives of Oral Biology. 119, 104896 (2020).
  30. Langenbach, F., Handschel, J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 117 (2013).
  31. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 64 (2), 295-312 (1997).
  32. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the alizarin red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. International Journal of Molecular Sciences. 24 (1), 723 (2022).
  33. Coe, C. L., Lubach, G. R., Schneider, M. L., Dierschke, D. J., Ershler, W. B. Early rearing conditions alter immune responses in the developing infant primate. Pediatrics. 90, 505-509 (1992).
  34. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcified Tissue International. 88 (2), 130-141 (2011).
  35. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 26 (7), 1787-1795 (2008).
  36. Kim, B. C., et al. Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 235-244 (2012).
  37. Ge, J., et al. Distal C terminus of CaV1.2 channels plays a crucial role in the neural differentiation of dental pulp stem cells. PLoS One. 8 (11), e81332 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved