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Method Article
Este artículo proporciona una guía paso a paso para establecer un cultivo primario de células madre de pulpas dentales utilizando el método de cultivo de explantes y la caracterización de estas células basada en las directrices del ICSCRT. Las células aisladas por este protocolo pueden considerarse como células madre mesenquimales para aplicaciones posteriores.
La pulpa dental humana representa un prometedor reservorio de células madre multipotente con una competencia regenerativa preeminente que se puede extraer de un diente extraído. El origen ectomesenquimal derivado de la cresta neural de las células madre de la pulpa dental (DPSC) otorga un alto grado de plasticidad que se debe a sus beneficios multifacéticos en la reparación y regeneración de tejidos. Existen varias formas prácticas de recolectar, mantener y proliferar células madre adultas que se están investigando para su uso en medicina regenerativa. En este trabajo, demostramos el establecimiento de un cultivo primario de células madre mesenquimales a partir de tejido dental mediante el método de cultivo de explantes. Las células aisladas tenían forma de huso y se adherían a la superficie plástica de la placa de cultivo. La caracterización fenotípica de estas células madre mostró una expresión positiva de los marcadores de superficie celular recomendados por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) para MSC, como CD90, CD73 y CD105. Además, la expresión insignificante de marcadores hematopoyéticos (CD45) y endoteliales (CD34), y menos del 2% de expresión de marcadores HLA-DR, confirmaron la homogeneidad y pureza de los cultivos DPSC. Además, ilustramos su multipotencia basada en la diferenciación a linajes adipogénicos, osteogénicos y cronogénicos. También indujimos a estas células a diferenciarse en células de tipo hepático y neuronales mediante la adición de los medios de estimulación correspondientes. Este protocolo optimizado ayudará en el cultivo de una población altamente expandible de células madre mesenquimales para ser utilizada en el laboratorio o para estudios preclínicos. Se pueden incorporar protocolos similares en las configuraciones clínicas para practicar tratamientos basados en DPSC.
Las células madre adultas se han convertido en una poderosa herramienta terapéutica para tratamientos y terapias dirigidas a células debido a su plasticidad, mecanismos paracrinos y propiedades inmunomoduladoras 1,2,3. Los datos alentadores de los estudios preclínicos basados en células madre han inspirado a los investigadores a trabajar en la traducción del laboratorio a la cabecera del paciente. El tipo de células madre utilizadas para la terapia con células madre desempeña un papel importante en los resultados exitosos. En estudios preclínicos y clínicos, la fuente más ampliamente reportada de células madre mesenquimales (MSC) sigue siendo la médula ósea 4,5. Sin embargo, los principales inconvenientes del uso de células madre derivadas de la médula ósea (BMSC) incluyen su población rara, procedimientos altamente invasivos para el aislamiento y su capacidad limitada para expandirse. Por lo tanto, se están explorando fuentes alternativas de MSC. En este sentido, los tejidos dentales, con su facilidad de accesibilidad, enorme plasticidad, alto potencial regenerativo y alta capacidad proliferativa, han sido considerados como una fuente alternativa rica y potencial de células madre 6,7,8,9,10.
Las células madre de la pulpa dental (DPSC) fueron el primer tipo de células madre dentales en ser aisladas y caracterizadas por Gronthos en el año 200011. Las DPSC han captado la atención de las aplicaciones de ingeniería de tejidos debido a su alta tasa de proliferación, su importante potencial de diferenciación, su facilidad de acceso con un cultivo sin esfuerzo y, lo que es más importante, su capacidad para obtenerse de un diente desechado sin ninguna preocupación ética12. Las limitaciones que plantean otras fuentes de células madre, como las BMSC y las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC), en su aislamiento y en su inadecuada capacidad de autorrenovación, son eludidas por las DPSC13. Las DPSC humanas se pueden obtener de dientes primarios humanos, dientes permanentes, muelas del juicio, dientes deciduos exfoliados (SHED) y papilas apicales. Además, las CPDP también pueden aislarse de dientes supernumerarios, que generalmente se descartan14. Las DPSCs expresan marcadores asociados a la cresta neural y tienen el potencial de diferenciarse en células neuronales tanto in vitro como in vivo15. Además de su potencial neurogénico, las DPSC pueden diferenciarse en otros linajes celulares, como osteogénicos, condrogénicos, adipogénicos, hepáticos y miogénicos, cuando se les dan condiciones de diferenciación específicas13. Por lo tanto, estas células multipotentes tienen un gran potencial para la terapia basada en células y pueden emplearse para la regeneración de varios tejidos. Los estudios también han informado sobre el papel potencial de las DPSC en la reconstrucción de la córnea16, la reparación del infarto de miocardio17 y su posible papel terapéutico en enfermedades como la isquemia de las extremidades18, el Alzheimer 19, el Parkinson 20 y el envejecimiento21. Por lo tanto, las células madre derivadas de tejidos dentales se pueden utilizar no solo para la regeneración dental, sino también para la reparación y regeneración de órganos no dentales como ojos16, corazones17, hígados22, huesos23 , etc.
Existen dos métodos particulares para el aislamiento de una población de MSC a partir de tejido pulposo: la digestión enzimática y el cultivo de explantes24,25. Ambos métodos han reportado el establecimiento exitoso de cultivos primarios sin ninguna diferencia significativa en la cantidad y las propiedades de las DPSC26. En este estudio, nos hemos centrado en el aislamiento de DPSCs por el método del explante27, ya que este método genera DPSCs sin contaminación de las células hematopoyéticas y endoteliales, en comparación con la digestión enzimática que puede resultar en contaminación de fibroblastos28.
Todos los procedimientos descritos en el estudio han sido aprobados por el Comité de Ética del Instituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) de PGIMER, Chandigarh. Todos los experimentos relacionados con el cultivo celular deben realizarse en una cabina de seguridad biológica (BSC) de Clase II siguiendo una técnica aséptica. La pulpa dental se obtuvo de dientes sanos de tres pacientes (F/14, M/14 y M/20) sometidos a extracciones de terceros molares por razones ortodóncicas. Antes de la recolección de la muestra, se obtuvo el consentimiento informado por escrito del paciente/tutor de acuerdo con las directrices proporcionadas por el comité de ética de PGIMER, Chandigarh.
1. Establecimiento de cultivo primario de células madre de pulpa dental (DPSC) a partir de tejido dental humano
NOTA: No se deben utilizar dientes cariados.
2. Extracción de tejido pulpar del diente y cultivo celular de DPSCs (tiempo: 60-120 min)
NOTA: Todos los pasos posteriores al transporte dental se han realizado en el laboratorio de cultivo de células y tejidos dentro de un gabinete de bioseguridad de nivel 2.
3. Expansión de DPSC
4. Identificación de marcadores fenotípicos de células madre (tiempo: 90 - 120 min)
NOTA: Para la caracterización de las células extraídas del tejido de la pulpa, utilice las células entre el tercer y el quinto paso.
5. Diferenciación de DPSC en múltiples linajes
NOTA: Utilice cultivos confluentes de 75%-80% de DPSC en el tercer a quinto paso para la evaluación de la multipotencia. Se debe utilizar un grupo de células de control que contenga α-MEM para todos los tipos de diferenciaciones que se describen a continuación.
6. Diferenciación adipogénica de DPSC, tinción de O rojo aceite y cuantificación
NOTA: Los pasos iniciales de la siembra son los mismos que los anteriores (es decir, el paso de diferenciación osteogénica 5.1).
7. Diferenciación condrogénica de DPSC, tinción con azul alcián y cuantificación
NOTA: La diferenciación condrogénica se indujo en el cultivo monocapa de DPSC. Los pasos iniciales de la siembra son los mismos que los anteriores (es decir, el paso de diferenciación osteogénica 5.1).
8. Diferenciación de las DPSCs hacia un linaje de tipo hepático y caracterización
9. Diferenciación neuronal de las DPSCs hacia un linaje y caracterización de tipo neuronal
Aquí, describimos cómo los investigadores pueden establecer un cultivo puro de DPSC a través del método de explante 6,7,8,9,10 e inducirlos hacia múltiples linajes para establecer la pureza del cultivo para aplicaciones posteriores.
Establecimos un cultivo primario de CPDP a partir del pequeño tejido de pulpa extraíd...
Las células madre han depositado la esperanza de curar numerosas enfermedades, debido a su plasticidad, robustez, propiedades inmunomoduladoras, mecanismos paracrinos y eficiencias de búsqueda. El tejido de la pulpa dental se considera la fuente más potente y valiosa de células madre, con una plasticidad eminente y una capacidad regenerativa. Aquí, demostramos el aislamiento de DPSC, utilizando el método de cultivo de explantes ampliamente adoptado, en el que las células migran de trozos de tejido de pulpa o expla...
Los autores declaran no tener conflicto de intereses financieros o no financieros.
Reconocemos el apoyo financiero a AK por parte del Departamento de Investigación en Salud (DHR), ICMR, Gobierno de la India (Subvención DHR-NRI # R.12015/01/2022-HR). SR ha recibido fondos de ICMR, Gobierno de la India (Subvención # 2020-7593/SCR-BMS) y PS ha recibido una beca del CSIR, Gobierno de la India. También agradecemos a la Sra. Sandhya Tokhi y a la Sra. Bhupinder Kaur por su asistencia en citometría de flujo y núcleo central de instrumentación sofisticada (CSIC) y a PGIMER, Chandigarh por proporcionar apoyo a la infraestructura.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 well cell culture plate | Costar | 3516 | For cell culture |
Alcian blue stain | EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia | CCK029 | |
alizarin red S stain | Sigma-Aldrich | TMS-008 | Osteogenic stain |
Antibiotic cocktail | Himedia | A002-5X50ML | To prevent culture contamination |
Ascorbic Acid | Himedia | TC094-25G | Chondrogenic induction |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | For neural induction |
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor) | Gibco | PHG0024 | For neural induction |
CD 105 | BD-Pharmingen | 560839 | |
CD 35 | Biolegend | 343604 | |
CD 45 | Biolegend | 304006 | |
CD 73 | Biolegend | 344016 | |
CD 90 | Biolegend | 328107 | Characterization |
cetyl pyridinium chloride (CPC) | Sigma-Aldrich | 1104006 | For Alizarin Red extraction |
Dexamethasone 21-phosphate disodium | Sigma-Aldrich | D1159-100MG | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Himedia | TS1006-5L | For washing purpose |
EGF (Epidermal Growth Factor) | Gibco | PHG0311 | For hepatic and neural induction |
EVOS LED microscope | Invitrogen | For fluorescence imaging | |
EZ stain Chondrocyte staining kit | Himedia | CCK029-1KT | Chondro stain Kit |
FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | For cell characterization | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | For primary culture |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | For cell culture |
G5 supplement | Gibco | 17503012 | For neural induction |
HGF( Hepatocyte Growth Factor) | Sigma-Aldrich | H1404 | For hepatic Induction |
HLA-DR | Biolegend | 307605 | |
Human TGF-β3 | Peprotech | #100-36E-10U | |
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix | Sigma-Aldrich | I3146 | For hepatic Induction |
ITS premix | Corning | 354350 | |
LDL Uptake Assay kit | Abcam | ab133127 | For hepatic characterization |
Low glucose DMEM | Gibco | 11885-084 | For hepatic induction |
MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M4403 | For neural characterization |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | For neural induction |
Neural Basal Media | Gibco | 21103049 | For neural induction |
NFM antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | For neural characterization |
Nikon Elipse TS100 microscope | Nikon | For fluorescence imaging | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | 01391-250Ml | Adipogenic stain |
Oncostatin M | R&D Systems | 295-OM-010/CF | For hepatic Induction |
Petridish | Tarson | 460090-90MM | For tissue cutting |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 15655-100G | Osteogenic induction |
Propan-2-ol | Thermo Fisher | Q13827 | For Oil Red O extraction |
Sodium pyruvate solution | Sigma life sciences | S8636-100ML | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | For cell passaging |
Whatman filter paper | merck | WHA1001325 | filter paper |
α- Minimum Essential Media (α-MEM) | Sigma-Aldrich | M0643-10X 1L | Media for primary culture |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
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