Dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürü

Özet

Bu makale, eksplant kültür yöntemini kullanarak dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürünü oluşturmak ve bu hücrelerin ICSCRT yönergelerine dayalı olarak karakterizasyonunu yapmak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokol ile izole edilen hücreler, daha sonraki uygulamalar için mezenkimal kök hücreler olarak kabul edilebilir.

Özet

İnsan diş pulpası, çekilmiş bir dişten elde edilebilen, üstün rejeneratif yetkinliğe sahip, umut verici bir multipotent kök hücre rezervuarını temsil eder. Dental pulpa kök hücrelerinin (DPSC'ler) nöral krestten türetilmiş ekto-mezenkimal kökeni, doku onarımı ve rejenerasyonundaki çok yönlü faydalarına borçlu olan yüksek derecede plastisite sağlar. Rejeneratif tıpta kullanımları için araştırılan yetişkin kök hücreleri toplamanın, sürdürmenin ve çoğaltmanın çeşitli pratik yolları vardır. Bu çalışmada, eksplant kültür yöntemi ile diş dokusundan primer mezenkimal kök hücre kültürünün oluşturulmasını gösteriyoruz. İzole edilen hücreler iğ şeklindeydi ve kültür plakasının plastik yüzeyine yapıştırıldı. Bu kök hücrelerin fenotipik karakterizasyonu, CD90, CD73 ve CD105 gibi MSC için uluslararası hücre tedavisi derneği (ISCT) tarafından önerilen hücre yüzeyi belirteçlerinin pozitif ekspresyonunu gösterdi. Ayrıca, hematopoietik (CD45) ve endotelyal belirteçlerin (CD34) ihmal edilebilir ekspresyonu ve HLA-DR belirteçlerinin% 2'den az ekspresyonu, DPSC kültürlerinin homojenliğini ve saflığını doğruladı. Adipojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara farklılaşmaya dayalı çoklu potansiyellerini daha da gösterdik. Ayrıca, bu hücreleri, karşılık gelen stimülasyon ortamı ekleyerek hepatik benzeri ve nöronal benzeri hücrelere farklılaşmaya teşvik ettik. Bu optimize edilmiş protokol, laboratuvarda veya klinik öncesi çalışmalar için kullanılmak üzere oldukça genişletilebilir bir mezenkimal kök hücre popülasyonunun yetiştirilmesine yardımcı olacaktır. Benzer protokoller, DPSC tabanlı tedavileri uygulamak için klinik kurulumlara dahil edilebilir.

Giriş

Yetişkin kök hücreler, plastisiteleri, parakrin mekanizmaları ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle hücreye yönelik tedaviler ve terapiler için güçlü bir terapötik araç haline gelmiştir ^1,2,3. Kök hücre bazlı klinik öncesi çalışmalardan elde edilen cesaret verici veriler, araştırmacılara tezgahtan başucu çevirisi için çalışmaya ilham verdi. Kök hücre tedavisi için kullanılan kök hücre türü, başarılı sonuçlarda önemli bir rol oynar. Preklinik ve klinik çalışmalarda, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) için en yaygın olarak bildirilen kaynak kemik iliği olmaya devam etmektedir....

Protokol

Çalışmada açıklanan tüm prosedürler, PGIMER, Chandigarh'daki Enstitü Etik Komitesi (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) tarafından onaylanmıştır. Hücre kültürü ile ilgili tüm deneylerin, aseptik tekniği takip eden bir Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir. Ortodontik nedenlerle üçüncü azı dişi çekimi yapılan üç hastanın (K/14, M/14 ve E/20) sağlıklı dişlerinden pulpa elde edildi. Numune toplamadan önce, PGIMER, Chandigarh etik komitesi tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak hastadan/vasiden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. İnsan diş dokusundan diş pulpası kök hücrelerinin (DPSC'ler) birincil kül....

Tartışmalar

Kök hücreler, plastisiteleri, sağlamlıkları, immünomodülatör özellikleri, parakrin mekanizmaları ve hedef arama verimlilikleri nedeniyle çok sayıda hastalığı tedavi etme umutlarını bağlamıştır. Diş pulpası dokusu, üstün plastisite ve rejeneratif kabiliyete sahip en güçlü ve değerli kök hücre kaynağı olarak kabul edilir. Burada, hücrelerin pulpa dokusu parçalarından veya eksplantlardan morfolojik olarak iğ şeklindeki fibroblast benzeri hücrelere benzeyen homojen bir hücre kültürü.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G