JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, eksplant kültür yöntemini kullanarak dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürünü oluşturmak ve bu hücrelerin ICSCRT yönergelerine dayalı olarak karakterizasyonunu yapmak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokol ile izole edilen hücreler, daha sonraki uygulamalar için mezenkimal kök hücreler olarak kabul edilebilir.

Özet

İnsan diş pulpası, çekilmiş bir dişten elde edilebilen, üstün rejeneratif yetkinliğe sahip, umut verici bir multipotent kök hücre rezervuarını temsil eder. Dental pulpa kök hücrelerinin (DPSC'ler) nöral krestten türetilmiş ekto-mezenkimal kökeni, doku onarımı ve rejenerasyonundaki çok yönlü faydalarına borçlu olan yüksek derecede plastisite sağlar. Rejeneratif tıpta kullanımları için araştırılan yetişkin kök hücreleri toplamanın, sürdürmenin ve çoğaltmanın çeşitli pratik yolları vardır. Bu çalışmada, eksplant kültür yöntemi ile diş dokusundan primer mezenkimal kök hücre kültürünün oluşturulmasını gösteriyoruz. İzole edilen hücreler iğ şeklindeydi ve kültür plakasının plastik yüzeyine yapıştırıldı. Bu kök hücrelerin fenotipik karakterizasyonu, CD90, CD73 ve CD105 gibi MSC için uluslararası hücre tedavisi derneği (ISCT) tarafından önerilen hücre yüzeyi belirteçlerinin pozitif ekspresyonunu gösterdi. Ayrıca, hematopoietik (CD45) ve endotelyal belirteçlerin (CD34) ihmal edilebilir ekspresyonu ve HLA-DR belirteçlerinin% 2'den az ekspresyonu, DPSC kültürlerinin homojenliğini ve saflığını doğruladı. Adipojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara farklılaşmaya dayalı çoklu potansiyellerini daha da gösterdik. Ayrıca, bu hücreleri, karşılık gelen stimülasyon ortamı ekleyerek hepatik benzeri ve nöronal benzeri hücrelere farklılaşmaya teşvik ettik. Bu optimize edilmiş protokol, laboratuvarda veya klinik öncesi çalışmalar için kullanılmak üzere oldukça genişletilebilir bir mezenkimal kök hücre popülasyonunun yetiştirilmesine yardımcı olacaktır. Benzer protokoller, DPSC tabanlı tedavileri uygulamak için klinik kurulumlara dahil edilebilir.

Giriş

Yetişkin kök hücreler, plastisiteleri, parakrin mekanizmaları ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle hücreye yönelik tedaviler ve terapiler için güçlü bir terapötik araç haline gelmiştir 1,2,3. Kök hücre bazlı klinik öncesi çalışmalardan elde edilen cesaret verici veriler, araştırmacılara tezgahtan başucu çevirisi için çalışmaya ilham verdi. Kök hücre tedavisi için kullanılan kök hücre türü, başarılı sonuçlarda önemli bir rol oynar. Preklinik ve klinik çalışmalarda, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) için en yaygın olarak bildirilen kaynak kemik iliği olmaya devam etmektedir 4,5. Bununla birlikte, kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin (BMSC'ler) kullanılmasının en büyük dezavantajları, nadir popülasyonlarını, izolasyon için oldukça invaziv prosedürleri ve sınırlı genişleme yeteneklerini içerir. Bu nedenle, MSC'lerin alternatif kaynakları araştırılmaktadır. Bu bağlamda, diş dokuları, erişilebilirlik kolaylığı, muazzam plastisitesi, yüksek rejeneratif potansiyeli ve yüksek proliferatif yeteneği ile artık zengin ve potansiyel bir alternatif kök hücre kaynağı olarak kabul edilmiştir6,7,8,9,10.

Dental pulpa kök hücreleri (DPSC'ler), 2000 yılında Gronthos tarafından izole edilen ve karakterize edilen ilk dental kök hücre tipiydi11. DPSC'ler, yüksek çoğalma hızları, önemli farklılaşma potansiyelleri, zahmetsiz kültürleme ile erişilebilirlik kolaylıkları ve en önemlisi herhangi bir etik kaygı olmaksızın atılmış bir dişten elde edilebilme yetenekleri nedeniyle doku mühendisliği uygulamalarının dikkatini çekmiştir12. BMSC'ler ve adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler) gibi diğer kök hücre kaynaklarının izolasyonlarında ve yetersiz kendini yenileme kapasitelerinde ortaya çıkan sınırlamalar, DPSC'ler tarafından aşılmaktadır13. İnsan DPSC'leri insan süt dişleri, kalıcı dişler, yirmilik dişler, pul pul dökülmüş süt dişleri (SHED'ler) ve apikal papillalardan elde edilebilir. Ayrıca, DPSC'ler genellikle atılan süpernümerer dişlerden de izole edilebilir14. DPSC'ler nöral krest ile ilişkili belirteçleri eksprese eder ve hem in vitro hem de in vivo olarak nöronal hücrelere farklılaşma potansiyeline sahiptir 15. Nörojenik potansiyellerine ek olarak, DPSC'ler, spesifik farklılaşma koşulları verildiğinde ostojenik, kondrojenik, adipojenik, hepatik ve miyojenik gibi diğer hücre soylarına farklılaşabilir13. Bu nedenle, bu multipotent hücreler hücre bazlı tedavi için büyük bir potansiyele sahiptir ve çeşitli dokuların yenilenmesi için kullanılabilir. Çalışmalar ayrıca DPSC'lerin korneanın16 rekonstrüksiyonunda, miyokard enfarktüsünün17 onarımında potansiyel rolünü ve uzuv iskemisi18, Alzheimer 19, Parkinson 20 ve yaşlanma21 gibi hastalıklarda potansiyel terapötik rolünü bildirmiştir. Bu nedenle, diş dokusu kaynaklı kök hücreler sadece diş rejenerasyonu için değil, aynı zamanda gözler16, kalpler17, karaciğerler22, kemikler23 gibi diş dışı organların onarımı ve yenilenmesi için de kullanılabilir.

Bir MSC popülasyonunun pulpa dokusundan izolasyonu için iki özel yöntem vardır - enzimatik sindirim ve eksplant kültürü24,25. DPSC'lerin miktar ve özelliklerinde önemli bir fark olmaksızın birincil kültürlerin başarılı bir şekilde kurulması, bu yöntemlerin her ikisi de ile bildirilmiştir26. Bu çalışmada, fibroblast kontaminasyonu ile sonuçlanabilen enzimatik sindirime kıyasla, bu yöntem hematopoietik ve endotel hücrelerinin kontaminasyonu olmadan DPSC'ler ürettiğinden, eksplant yöntemi27 ile DPSC'lerin izolasyonuna odaklandık28.

Protokol

Çalışmada açıklanan tüm prosedürler, PGIMER, Chandigarh'daki Enstitü Etik Komitesi (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) tarafından onaylanmıştır. Hücre kültürü ile ilgili tüm deneylerin, aseptik tekniği takip eden bir Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir. Ortodontik nedenlerle üçüncü azı dişi çekimi yapılan üç hastanın (K/14, M/14 ve E/20) sağlıklı dişlerinden pulpa elde edildi. Numune toplamadan önce, PGIMER, Chandigarh etik komitesi tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak hastadan/vasiden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. İnsan diş dokusundan diş pulpası kök hücrelerinin (DPSC'ler) birincil kültürünün oluşturulması

NOT: Çürük dişler kullanılmamalıdır.

  1. Dental pulpa örneğinin alınması ve doku kültürü laboratuvarına taşınması
    1. Travmatik olmayan ve aseptik koşullar altında bir diş çekimi prosedürü gerçekleştirin. Kan kalıntılarını gidermek için çekilen dişi steril bir tuzlu su çözeltisiyle iyice durulayın.
    2. Ekstrakte edilen dişi, posayı açığa çıkarmak için steril normal salin ile sürekli sulama ile bir karbür fissür frezi kullanarak uzunlamasına iki parçaya kesin.
    3. Çekilen dişi, bozulmamış pulpa ile birlikte buz üzerinde tutulan steril α-minimum esansiyel ortamda (α-MEM) hücre ve doku kültürü laboratuvarına taşıyın.
      NOT: İdeal olarak, hücre kültürü için 2 saat içinde alınan tüm numuneleri işleyin. Bununla birlikte, yakın tarihli bir rapor, diş örneğinin 24 saat sonra bile işlenmesinin DPSC'lerin canlılığını ve çoğalmasını etkilemediğini, ancak işlevselliklerini azalttığını öne sürmüştür29.

2. DPSC'lerin dişten ve hücre kültüründen pulpa dokusunun çıkarılması (süre: 60-120 dk)

NOT: Diş nakli sonrası tüm aşamalar hücre ve doku kültürü laboratuvarında seviye 2 biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmiştir.

  1. Diş örneğini steril kültür Petri kaplarına yerleştirin ve 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) solüsyonu ile iyice durulayın (üç veya dört kez).
  2. Keskin bir ekskavatör ve forseps yardımıyla pulpa dokusunu pulpa boşluğundan dikkatlice çıkarın.
  3. Hamur çıkarıldıktan sonra, kan kalıntılarını gidermek için steril PBS ile iyice temizleyin.
  4. Pulpa dokusunu bir Petri kabında cerrahi bıçak yardımıyla yaklaşık 2-3 mm'lik küçük parçalar halinde kesin.
    1. Her alana 1-2 mL steril PBS koyarak yemeğin yüzey alanını dört parçaya bölün. Pulpa doku örneğini PBS ile bir alana koyun ve dokuyu cerrahi bir bıçakla mümkün olan en küçük parçalara kesin (parça ne kadar küçük olursa, kök hücrelerin dokudan dışarı çıkması o kadar kolay olur). Bundan sonra, her bir parçayı PBS ile başka bir alana kaldırarak aktarın ve dördüncü alana kadar bu şekilde devam edin, böylece doku parçaları düzgün bir şekilde yıkanır ve herhangi bir kirletici madde içermez.
  5. Bu arada,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve bir antibiyotik kokteyli (yani penisilin ve streptomisin) ile esansiyel olmayan amino asitler içeren yaklaşık 0.8-1 mL α-MEM dökün 6 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına. Plakayı hareket ettirerek ortamı, kuyu yüzeyine eşit şekilde yayacak şekilde eşit şekilde dağıtın.
  6. Küçük hamur dokusu parçalarını veya eksplantları forseps yardımıyla 6 oyuklu plakanın tek bir oyuğuna (oyuk başına dört ila altı parça) tohumlayın ve plakayı bir biyogüvenlik başlığında 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden tutun.
    NOT: Bu adım, doku/eksplantların kültür plakalarının işlenmiş yüzeylerine yapışmasına izin verir/yardımcı olur.
  7. Kültür plakasını 37 °C sıcaklık ve% 5 CO2 seviyesine sahip nemlendirilmiş bir atmosferde tutun.
  8. Ertesi gün, eksplantları rahatsız etmeden ortamı kuyulardan dikkatlice aspire edin ve üzerine taze ortam ekleyin. Kurumayı önlemek için bu adımda ortamı iki günde bir değiştirin. Kuluçka makinesinin tepside yeterli su olduğundan emin olun, böylece ekstra buharlaşma plaka kuyucuklarındaki ortamın kurumasına neden olmaz.
    NOT: Bu çok önemli bir adımdır ve rahatsızlık, eksplantların konumlarından çıkmasına neden olabilir. Eksplant parçaları medya aktarımı sırasında konumlarından çıkarsa, medyayı tamamen çıkararak ve kuyu yüzeyine yapışmalarına izin vererek bunları yeniden takmayı deneyin. Ortam, eksplantları rahatsız etmeden kuyu duvarı boyunca dikkatlice eklenmelidir, aksi takdirde tekrar ayrılabilirler. Hücre kültürü plakalarını ters çevrilmiş bir mikroskop altında (4x veya 10x büyütme) düzenli olarak gözlemleyin. DPSC'leri plastik yüzeye yapışma yeteneklerine ve mil şeklindeki morfolojilerine göre tanımlayın.
  9. Eksplantlardan yeterli sayıda hücre göç ettikten sonra, dokuları çıkarın ve hücrelerin çoğalmasına ve alt kültürlemeden önce optimum% 70 -% 75 hücre birleşmesine ulaşmasına izin verin. %10 FBS içeren α-MEM hacmi bu adımda 2 mL'ye çıkarılabilir, böylece hücreler daha hızlı bölünebilir. Bu aşamada medyayı her üç günde bir değiştirin.

3. DPSC genişletme

  1. DPSC'lerin birleşik T75 kültür şişesini (birleşme: %70-80) PBS (10 mL) ile iki kez yıkayın.
  2. T75 şişesinin yan tarafına 2,5 mL %0,25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve tripsin-EDTA'nın tüm hücre tabakasını veya DPSC'lerin tek katmanını kaplamasını sağlamak için hafifçe döndürün.
  3. Matarayı davlumbazın içinde 37 °C'de 3-5 dakika tutun. 3 dakika sonra, hücrelerin ayrışmasını sağlamak için şişeye hafifçe vurun.
  4. Tripsin aktivitesini etkisiz hale getirmek için nötralize edici bir ajan olarak 5 mL tam ortam (% 10 FBS ile α-MEM) veya 250 μL FBS (kullanılan tripsin hacminin% 10'u) ekleyin. Ayrışmış DPSC'lerin tüm hücre süspansiyonunu 15 mL'lik yeni bir konik santrifüj tüpüne aktarın.
  5. Hücre peletini elde etmek için ayrışmış hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
  6. Pipeti kullanarak tüm süpernatanları aspire edin, kalan hücreleri toplamak için şişeye 5-10 mL PBS ekleyin, hücreyi PBS'de nazik pipetleme ile yıkayın ve hücreleri 2 dakika boyunca 500 x g'da tekrar santrifüjleyin. Gerekirse tekrarlayın.
  7. Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için nazik pipetleme yaptıktan sonra hücre peletini 1 mL tam ortamda (%10 FBS ile α-MEM) yeniden süspanse edin.
  8. Hücreleri bölün ve (eşit hacimde) her biri 10 mL tam tam ortam içeren iki T75 kültür şişesine tohumlayın. Matarayı davlumbazın içinde 37 °C'de tutun.
  9. Ertesi gün, medyayı aspire edin ve yeni eksiksiz medya ile değiştirin.
    NOT: Uzun süreli tripsin tedavisi, hücre yüzey proteinini ve hücre dışı matris proteinini parçalayarak hücre bütünlüğünü, canlılığını ve hücre fonksiyonunu tehlikeye atabilir.

4. Kök hücre fenotipik belirteçlerinin tanımlanması (süre: 90 - 120 dk)

NOT: Pulpa dokusundan toplanan hücrelerin karakterizasyonu için, üçüncü ve beşinci pasaj arasındaki hücreleri kullanın.

  1. İki% 70 -% 80 (~ 3-4 x 106 hücre; görüntü tabanlı bir sitometre veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın) DPSC'lerin birleşik T75 kültür şişelerini kullanın ve hücreleri 10 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  2. 2,5 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve şişeyi davlumbazın içinde 37 °C'de 3-5 dakika tutun. Tripsin aktivitesini etkisiz hale getirmek için nötralize edici bir ajan olarak 5 mL tam ortam veya 250 μL FBS (kullanılan tripsin hacminin% 10'u) ekleyin.
  3. Hücreleri 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde bir pipet kullanarak toplayın. Hücre peletini elde etmek için ayrışmış hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
  4. Pipeti kullanarak tüm süpernatanları aspire edin, kalan hücreleri toplamak için şişeye 5 mL PBS ekleyin, hücreyi PBS'de nazik pipetleme ile yıkayın ve hücreleri 2 dakika boyunca 500 x g'da tekrar santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan sonra peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hafif pipetleme yapın.
  6. Kullanılabilirliğe bağlı olarak görüntü tabanlı bir sitometre veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve bunları 1 x 104 hücre / tüpte mikrosantrifüj tüplerine dağıtın. Hücreleri 0.5-1 saat boyunca% 0.5 -% 1 sığır serum albümini (BSA) içinde inkübe edin.
  7. Her tüpe, farklılaşma (CD) belirteçleri kümesi için 1-2 μL floresein izotiyosiyanat (FITC) - ve fikoeritrin (PE) konjuge antikorları ekleyin (ör., CD90 [0.4 μg], CD73 [0.8 μg], CD105 [0.4 μg], CD34 [0.8 μg], CD45 [0.4 μg] ve HLA-DR [0.08 μg])6,7,8,9 ve oda sıcaklığında karanlıkta 0.5 saat inkübe edin.
  8. 0,5 saat sonra, 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ederek hücreleri aşağı doğru peletleyin. Süpernatanı aspire edin, hücre peletini PBS ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyin.
  9. Santrifüjlemeden sonra, peleti PBS'de (200 μL / tüp) yeniden süspanse edin, hücre süspansiyonunu akış sitometri tüplerine aktarın ve bunları bir akış sitometresi kullanarak elde edin. Herhangi bir ticari yazılım, çeşitli antikorlar için pozitif hücrelerin yüzdesini daha fazla analiz etmek için kullanılabilir.
    NOT: 4.7 ila 4.9 arasındaki adımlar karanlıkta oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Hücrelerin arka plan floresansını atlamak için uygun izotip kontrolleri ve boyanmamış numuneler kullanılmalıdır.

5. DPSC'nin birden fazla soya farklılaşması

NOT: Çoklu potens değerlendirmesi için üçüncü ila beşinci pasajda DPSC'lerin %75-80 birleşik kültürlerini kullanın. Aşağıda açıklanan tüm türdeki farklılaşmalar için α-MEM içeren bir kontrol hücresi grubu kullanılmalıdır.

  1. DPSC'lerin osteojenik farklılaşması, alizarin kırmızısı boyaması ve miktar tayini
    1. Yukarıda adım 4.2'de açıklandığı gibi% 0.25 tripsin-EDTA kullanarak tek hücreli bir süspansiyon yapın ve hücre peletini tam α-MEM'de yeniden süspanse edin.
    2. Hücreleri sayın ve 37 ° C'de 48 saat boyunca 0.4-0.5 mL tam ortam içeren 2 x 104 hücre / oyuklu hücre yoğunluğunda 24 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş plakalara tohumlayın ve% 5 CO2.
    3. 48 saat sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın ve 0.4-0.5 mL osteojenik indüktif ortam ekleyin (ör., beta gliserofosfat [5 mM], monopotasyum fosfat [1.8 mM] ve deksametazon disodyum fosfat [0.01 mM] gibi osteojenik indüktif faktörlere sahip α-MEM)8. Herhangi bir osteojenik indüktif faktör (kontrol ortamı) olmadan sadece tam α-MEM içeren kontrol kuyuları (indüklenmemiş hücreler) hazırlayın.
      NOT: 50 μM askorbat ilavesinin de osteojenik farklılaşmayı arttırdığı bildirilmiştir 30,31. Her üç günde bir, indüksiyon ortamını ve kontrol ortamını 21 gün (3 hafta) boyunca taze ortam ve kültürle değiştirin. İndüksiyon süresinin sonunda, ortamı kültür plakalarından çıkarın, 0.5 mL PBS ekleyin ve iki kez yıkayın.
    4. PBS yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca 0.5 mL% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) çözeltisine sabitleyin. Çeker ocak/kimyasal davlumbazda sabitleme yapın.
  2. Alizarin kırmızı lekelenme
    1. 1 g alizarin kırmızısı S'yi 50 mL çift distile su (ddH2O) içinde çözerek ve hidroklorik asit (HCL) veya amonyum hidroksit (NH4OH) yardımıyla pH'ı 4.0-4.2'ye ayarlayarak alizarin kırmızısı S boyasını (% 2) hazırlayın. Lekeyi filtre kağıdı ile filtreleyin. Lekeyi karanlıkta (4 °C) saklayın.
    2. Hücreleri iki kez çift damıtılmış su (ddH2O) ile yıkayın, alizarin kırmızı S boyası ekleyin ve oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe edin.
    3. Lekeyi tüm oyuklardan çıkarın ve bağlanmamış lekeleri çıkarmak için hücreleri dört veya beş kez ddH2O ile yıkayın. Parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüleri yakalayın.
  3. Kantitatif analiz için alizarin kırmızı leke ekstraksiyonu
    1. Lekeli kuyucuklara (0.4 mL / oyuk) setil piridinyum klorür (CPC) tamponu (pH 7.0) ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Ek olarak, hücreler, alizarin kırmızı kristallerinin32 uygun şekilde çözünmesi için% 10 asetik asit ile de inkübe edilebilir. Plakaları bir tabak külbütör veya çalkalayıcı üzerinde tutun.
    2. İnkübasyondan sonra, süpernatanı (ekstrakte edilen boya) toplayın, 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve plakayı veya numuneleri 405 nm'de okuyun. Boş bir değer elde etmek için, yalnızca CPC (aynı hacim) arabelleği ekleyin ve 32,33'ü okuyun.

6. DPSC'lerin adipojenik farklılaşması, yağ kırmızısı O boyaması ve miktar tayini

NOT: Tohumlamanın ilk adımları yukarıdakiyle aynıdır (yani, osteojenik farklılaşma adımı 5.1).

  1. 48 saat sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın ve 0.4-0.5 mL adipojenik indüktif ortam ekleyin (ör., izobütil-metilksantin [IBMX; 0.5 mM], deksametazon [1 μM], indometasin [200 μM] ve insülin [10 μM] gibi adipojenik indüktif faktörlere sahip α-MEM)8. İndüklenmemiş hücreler içeren kontrol kuyuları hazırlayın (yani, indüktif faktörler olmadan yalnızca α-MEM'de kültürlenmiş {kontrol ortamı]).
  2. Ortamı her üç günde bir yenileyin ve hücreleri 3 hafta boyunca kültürleyin. 3 hafta sonra, ortamı kültür plakalarından aspire edin ve hücreleri iki kez yıkamak için 0.5 mL PBS ekleyin.
  3. PBS yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca% 10 NBF çözeltisine sabitleyin.
  4. Hücreleri iki kez çift damıtılmış su (ddH2O) ile yıkayın, yağ kırmızısı O lekesi ekleyin ve oda sıcaklığında 30-40 dakika inkübe edin.
  5. Lekeyi tüm oyuklardan çıkarın ve hücre içeren kuyucukları berraklaşana kadar (iki ila dört kez) ddH2O ile tekrar tekrar durulayın. Mikroskop altında gözlemleyin ve görüntüleri yakalayın.
  6. Kantitatif analiz için yağ kırmızısı O ekstraksiyonu
    1. Lekeli kuyucuklara 0.4 mL %100 2-propanol ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca düzgün bir şekilde kaplayarak oda sıcaklığında inkübe edin. Plakayı bir tabak külbütör veya çalkalayıcı üzerinde tutun.
    2. İnkübasyondan sonra, süpernatanı toplayın, 96 oyuklu plakaya aktarın, plakayı veya numuneleri 510 nm'de okuyun. Körleme için %100 2-propanol kullanın.

7. DPSC'lerin kondrojenik farklılaşması, Alcian mavisi boyaması ve miktar tayini

NOT: DPSC'lerin tek katmanlı kültüründe kondrojenik farklılaşma indüklenmiştir. Tohumlamanın ilk adımları yukarıdakiyle aynıdır (yani, osteojenik farklılaşma aşaması 5.1).

  1. 48 saat sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın ve 0.4-0.5 mL kondrojenik indüksiyon ortamı ekleyin (ör., kondrojenik farklılaşmaya özgü indüktif faktörlere sahip α-MEM, askorbik asit [0.2 M], sodyum piruvat [1 mM], büyüme faktörü-beta 3'ü dönüştürmek [TGF-β3; 10 μM], deksametazon [1 mM] ve 1x ITS ön karışımı [insülin, transferrin ve selenöz asit)10. İndüklenmemiş hücreler içeren kontrol kuyucukları hazırlayın (yani, endüktif faktörler olmadan sadece α-MEM'de kültürlenmiştir [kontrol ortamı]).
  2. Ortamı her üç günde bir yenileyin ve hücreleri 3 hafta boyunca kültürleyin. İndüksiyon periyodunun bitiminden sonra, ortamı kültür plakalarından aspire edin ve hücreleri iki kez yıkamak için 0.5 mL PBS ekleyin.
  3. PBS yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca% 10 NBF çözeltisine sabitleyin. Hücreleri iki veya üç kez çift damıtılmış su (ddH2O) ile yıkayın, Alcian mavisi boyası ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
  4. Lekeyi tüm oyuklardan çıkarın, ardından iki veya üç kez 0.1 N HCL ile durulayın. Hücreleri dört yıkayın veya ddH2O ile zaman verin.
  5. Mikroskop altında proteoglikanlar (mavi renk) için hücreleri gözlemleyin ve görüntüleri yakalayın.
  6. Alcian mavisi miktar tayini için, boyayı 6 M guanidin-HCl kullanarak ekstrakte edin ve numuneleri 595 nm'lik bir optik yoğunlukta (OD) okuyun. Bu çalışmada kullanılan Alcian mavisi kiti, kıkırdaktaki asidik proteoglikanları boyar ve kondrositlerin10 matrisinde bulunan sülfatlanmış glikozaminoglikanları (GAG'ler) özel olarak bağlar.

8. DPSC'lerin hepatik benzeri soy ve karakterizasyona doğru farklılaşması

  1. Yukarıda tarif edildiği gibi tripsin muamelesi ile hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunu yapın ve hücre peletini tam α-MEM'de yeniden süspanse edin.
  2. Hücreleri sayın ve 48 saat boyunca 0.4-0.5 mL tam ortam içeren 2 x 104 hücre / kuyucukta 24 iyi muamele edilmiş kültür plakalarına tohumlayın.
  3. 48 saat sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri 14 gün boyunca hepatik indüksiyon ortamı ile inkübe edin. İndüksiyon ortamı, deksametazon (0.5 μM), epidermal büyüme faktörü (EGF; 2 ng/mL), ITS+ premiksi (50 mg/mL) ve hepatosit büyüme faktörü (HGF; 20 ng/mL) içeren düşük glikozlu Dulbecco'nun modifiye kartal ortamından (DMEM) oluşur 6.
  4. 14 gün sonra, ortamı 14 gün daha olgunlaşma ortamıyla değiştirin (Oncostatin M [OSM; 20 ng / mL], ITS ön karışımı [50 mg / mL] ve deksametazon [0.5 μM] ile desteklenmiş α-MEM) 6. Medyayı her üç günde bir yeni medya ile doldurun.
  5. Karaciğer benzeri farklılaşmayı doğrulamak için immünohistokimya analizi ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) testi yapın.
    1. LDL reseptörü için LDL alımı ve immünofloresan boyama
      NOT: Farklılaşma sonrası hepatosit benzeri hücreler, kit talimatlarına göre LDL alım test kiti ile karakterize edildi. Canlı durum altında farklılaşmış hücrelerde LDL alımını değerlendirmek için LDL-550 florokrom kullanıldı ve fiksasyon sonrası farklılaşmış hücrelerde LDL reseptörlerinin tespiti için LDL reseptör antikoru kullanıldı.
      1. Farklılaşmadan sonra, canlı hücreleri LDL-550 (1:100) ile 3-4 saat boyayın. 3-4 saat sonra, boyama solüsyonunu kültür ortamı ile değiştirin ve LDL alımını sırasıyla 537 ve 617 nm'de propidyum iyodür (PI) uyarma ve emisyon dalga boylarında yapabilen bir floresan mikroskop altında gözlemleyin.
      2. Hücreleri 10 dakika boyunca fiksatif solüsyonda sabitleyin. Hücre fiksasyonundan sonra, bloke edici solüsyondaki hücreleri 30 dakika boyunca bloke edin.
      3. Hücreleri bir primer LDL reseptör antikoru ile 1 saat inkübe edin, üç kez 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra karanlıkta 1 saat boyunca 488 ikincil antikor (1:100) ile inkübe edin.
      4. Fazla ikincil antikoru çıkarmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Nükleer leke olarak 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin.
      5. Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin. DAPI, PI ve FITC'nin uyarma/emisyon aralığındaki dalga boylarını ölçebilen bir floresan mikroskobu kullanarak görüntü alın.
        NOT: LDL reseptörü antikor ekspresyonunu ve LDL alımını ölçmek için tek hücreli yoğunluk parametreleri kaydedilebilir. Sadece ikincil antikordan kaynaklanan arka plan floresansını atlamak için immünofloresan boyama için uygun ikincil antikor kontrolleri kullanılmalıdır.

9. DPSC'lerin nöronal benzeri soy ve karakterizasyona doğru nöral farklılaşması

  1. Hücrelerin kaplanmasından sonra, yukarıda tarif edildiği gibi, hücreleri 48 saat boyunca α-MEM'de kültürleyin.
  2. Besiyerini aspire edin ve %0,5 G5 takviyesi, %0,2 N2 takviyesi, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 20 ng/mL bazik fibroblast büyüme faktörü ve B27 takviyesi (%1) gibi büyüme faktörleri içeren nörobazal besiyeri ile değiştirin. Hücreleri bu ortamda 25-41 gün boyunca kültürleyin7.
  3. Hücreler tarafından metabolizmasına bağlı olarak ortamı her iki veya üç günde bir değiştirin. Verimli nöronal olgunlaşma ve daha fazla mikrotübül ile ilişkili protein-2 (MAP-2+) nöron elde etmek için, nöronal indüksiyon aşamasından (14 gün) sonra EGF ve fibroblast büyüme faktörü 2'yi (FGF2) çıkarın.
    NOT: Zamanla ve tekrarlanan ortam değişikliğinden sonra, farklılaşmış nöronlar, düşük aderans nedeniyle plaka kuyularından ayrılma gösterebilir ve bu da uzun süreli kültürde nöron kaybına neden olabilir. Bunu önlemek için, plaka kuyucuklarını laminin veya fibronektin (isteğe bağlı) ile kaplayın.
  4. Nöronal benzeri farklılaşmayı doğrulamak için immünohistokimya analizi yapın.
    1. Diferansiye DPSC'lerin immün boyanması
      NOT: DPSC'lerin nöronal benzeri farklılaşmasını doğrulamak için, nörojenik soya özgü proteinler olan MAP-2 ve nörofilament (NFM) antikorları kullanılarak farklılaşmış hücrelerde immünositokimya gerçekleştirildi7.
      1. Farklılaşma tamamlandıktan sonra kültür ortamını çıkarın. PBS'yi ekleyin, plakayı hafifçe döndürün ve PBS'yi bir pipet yardımıyla çıkarın. Adımı tekrarlayın.
      2. Hücreleri oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca %10 NBF veya %4 paraformaldehit kullanarak sabitleyin.
      3. Fiksatifi çıkarın ve hücreleri iki veya üç kez 1x PBS ile yıkayın. Geçirgenlik çözeltisi (Triton-X-100;% 0.1) ekleyin ve hücreleri 5 dakika inkübe edin.
      4. PBS'yi iki veya üç kez yıkayın ve hücreleri 37 ° C'de 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de% 0.5 -% 1 bloke edici madde (BSA) ile bloke edin. Bloke edici ajanı çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın.
      5. Hücreleri gece boyunca birincil antikor ile inkübe edin (% 0.1 BSA, NFM [1:50] ve MAP-2 [1:200]'de hazırlanır).
      6. Birincil antikoru çıkarın ve bağlanmamış antikorları çıkarmak için hücreleri üç veya dört kez 1x PBS ile yıkayın.
      7. İkincil antikor (tavşan anti-fare 1: 2.000) ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında karanlıkta 1.5-2 saat inkübe edin. Hücreleri PBS ile yıkayın (iki veya üç kez).
      8. Hücreleri DAPI'de 10 dakika inkübe edin ve tekrar PBS ile yıkayın. Numunenin kurumasını önlemek için kalan hacmi koruyun. Floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
        NOT: Ek olarak, hücrelerin saflığı ve işlevselliği hakkında daha iyi bir fikir edinmek için karyotip stabilitesi10 ve yaşlanma karakterizasyonu da yapılabilir.

Sonuçlar

Burada, araştırmacıların eksplant yöntemi 6,7,8,9,10 aracılığıyla saf bir DPSC kültürünü nasıl oluşturabileceklerini ve aşağı akış uygulamaları için kültürün saflığını belirlemek için bunları birden fazla soya doğru nasıl indükleyebileceklerini açıklıyoruz.

Şekil 1A...

Tartışmalar

Kök hücreler, plastisiteleri, sağlamlıkları, immünomodülatör özellikleri, parakrin mekanizmaları ve hedef arama verimlilikleri nedeniyle çok sayıda hastalığı tedavi etme umutlarını bağlamıştır. Diş pulpası dokusu, üstün plastisite ve rejeneratif kabiliyete sahip en güçlü ve değerli kök hücre kaynağı olarak kabul edilir. Burada, hücrelerin pulpa dokusu parçalarından veya eksplantlardan morfolojik olarak iğ şeklindeki fibroblast benzeri hücrelere benzeyen homojen bir hücre kültürü...

Açıklamalar

Yazarlar finansal veya finansal olmayan herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Hindistan Sağlık Araştırmaları Departmanı (DHR), ICMR, Govt.'dan AK'ye sağlanan finansman desteğini kabul ediyoruz (DHR-NRI Hibe # R.12015/01/2022-HR). SR, ICMR, Govt.Hindistan (Hibe # 2020-7593/SCR-BMS) ve PS, CSIR, Govt.'dan burs aldı. Ayrıca akış sitometrisi konusunda yardımları için Bayan Sandhya Tokhi ve Bayan Bhupinder Kaur'a ve altyapı desteği sağladıkları için merkezi sofistike enstrümantasyon çekirdeği (CSIC) ve PGIMER, Chandigarh'a müteşekkiriz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well cell culture plateCostar3516For cell culture
Alcian blue stainEZstain chondrocyte staining kit, HiMediaCCK029
alizarin red S stainSigma-AldrichTMS-008Osteogenic stain
Antibiotic cocktailHimediaA002-5X50MLTo prevent culture contamination
Ascorbic AcidHimediaTC094-25GChondrogenic induction
B27 supplementGibco17504044For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)GibcoPHG0024For neural induction
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)Sigma-Aldrich1104006For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodiumSigma-AldrichD1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineHimediaTS1006-5LFor washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)GibcoPHG0311For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscopeInvitrogenFor  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kitHimediaCCK029-1KTChondro stain Kit
FACS Canto flow cytometerBD BiosciencesFor cell characterization
Fetal Bovine SerumGibco16000044For primary culture
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442For cell culture
G5 supplementGibco17503012For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)Sigma-AldrichH1404For hepatic Induction
HLA-DRBiolegend307605
 Human TGF-β3Peprotech#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premixSigma-AldrichI3146For hepatic Induction
ITS premixCorning354350
LDL Uptake Assay kitAbcamab133127For hepatic characterization
Low glucose DMEMGibco11885-084For hepatic induction
MAP2 antibodySigma-AldrichM4403For neural characterization
N2 supplementGibco17502048For neural induction
Neural Basal MediaGibco21103049For neural induction
NFM antibodySigma-AldrichN4142For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscopeNikonFor  fluorescence imaging
Oil Red OSigma-Aldrich01391-250MlAdipogenic stain
Oncostatin MR&D Systems295-OM-010/CFFor hepatic Induction
PetridishTarson460090-90MMFor tissue cutting
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich15655-100GOsteogenic induction
Propan-2-olThermo FisherQ13827For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solutionSigma life sciencesS8636-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049For cell passaging
Whatman filter papermerckWHA1001325filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)Sigma-AldrichM0643-10X 1LMedia for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422-50G

Referanslar

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulation Research. 124 (6), 837-839 (2019).
  3. Raik, S., Kumar, A., Bhattacharyya, S. Insights into cell-free therapeutic approach: Role of stem cell "soup-ernatant". Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (2), 104-118 (2018).
  4. Rodriguez-Fuentes, D. E., et al. Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review. Archives of Medical Research. 52 (1), 93-101 (2021).
  5. Yamazaki, K., Kawabori, M., Seki, T., Houkin, K. Clinical trials of stem cell treatment for spinal cord injury. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3994 (2020).
  6. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific Reports. 7 (1), 15015 (2017).
  7. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  8. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome proteins regulate comparative osteogenic and adipogenic potential in bone marrow and dental stem cells. Biochimie. 155, 129-139 (2018).
  9. Kumar, A., Bhattacharyya, S., Rattan, V. Effect of uncontrolled freezing on biological characteristics of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Bank. 16 (4), 513-522 (2015).
  10. Raik, S., et al. Assessment of post-thaw quality of dental mesenchymal stromal cells after long-term cryopreservation by uncontrolled freezing. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (2), 728-743 (2020).
  11. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  12. Tsutsui, T. W. Dental pulp stem cells: advances to applications. Stem Cells and Cloning. 13, 33-42 (2020).
  13. Huang, G. T. -. J., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  14. La Noce, M., et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. Journal of Dentistry. 42 (7), 761-768 (2014).
  15. Xiao, L., Tsutsui, T. Characterization of human dental pulp cells-derived spheroids in serum-free medium: stem cells in the core. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2624-2636 (2013).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
  17. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26 (3), 638-645 (2008).
  18. Yong, Z., et al. Comparison of the angiogenic ability between SHED and DPSC in a mice model with critical limb ischemic. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (4), 861-870 (2022).
  19. Zhang, X. M., et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cell transplantation in a rat model of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 16 (5), 893-898 (2021).
  20. Kabir, R., et al. Imperative role of dental pulp stem cells in regenerative therapies: a systematic review. Nigerian Journal of Surgery. 20 (1), 1-8 (2014).
  21. Kumar, A., et al. Dental pulp stem cell secretome ameliorates d-galactose induced accelerated aging in rat model. Cell Biochemistry and Function. 40 (5), 535-545 (2022).
  22. Hirata, M., et al. Multifaceted therapeutic benefits of factors derived from dental pulp stem cells for mouse liver fibrosis. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1416-1424 (2016).
  23. Fujii, Y., et al. regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 24 (2018).
  24. Ferrua, C. P., et al. How has dental pulp stem cells isolation been conducted? A scoping review. Brazilian Oral Research. 31, e87 (2017).
  25. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica. 65 (3), 124-133 (2019).
  26. Tatullo, M., Marrelli, M., Shakesheff, K. M., White, L. J. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 1205-1216 (2015).
  27. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  28. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), e12334 (2017).
  29. Aryal Ac, S., Islam, M. S., Samsudin, A. R. Investigation of the effect of a time delay on the characteristics and survival of dental pulp stem cells from extracted teeth. Archives of Oral Biology. 119, 104896 (2020).
  30. Langenbach, F., Handschel, J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 117 (2013).
  31. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 64 (2), 295-312 (1997).
  32. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the alizarin red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. International Journal of Molecular Sciences. 24 (1), 723 (2022).
  33. Coe, C. L., Lubach, G. R., Schneider, M. L., Dierschke, D. J., Ershler, W. B. Early rearing conditions alter immune responses in the developing infant primate. Pediatrics. 90, 505-509 (1992).
  34. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcified Tissue International. 88 (2), 130-141 (2011).
  35. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 26 (7), 1787-1795 (2008).
  36. Kim, B. C., et al. Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 235-244 (2012).
  37. Ge, J., et al. Distal C terminus of CaV1.2 channels plays a crucial role in the neural differentiation of dental pulp stem cells. PLoS One. 8 (11), e81332 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 195Rejeneratif T pMultipotenscyDiferansiyasyonEksplant K lt rH cre Y zey Belirte leriAdipojenikOsteojenikKondrojenikHepatikN ronal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır