תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן

Summary

מאמר זה מספק מדריך הדרגתי לביסוס תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן באמצעות שיטת תרבית explant ואפיון תאים אלה בהתבסס על הנחיות ICSCRT. התאים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיחשב כתאי גזע מזנכימליים ליישומים נוספים.

Abstract

מוך השן האנושי מייצג מאגר תאי גזע רב-פוטנטי מבטיח עם יכולת התחדשות בולטת שניתן לקצור משן שנעקרה. המקור האקטו-מזנכימלי הנגזר מסמל עצבי של תאי גזע במוך השן (DPSCs) מעניק רמה גבוהה של פלסטיות הנובעת מיתרונותיו הרב-גוניים בתיקון רקמות והתחדשותן. ישנן דרכים מעשיות שונות לקציר, תחזוקה והתרבות של תאי גזע בוגרים הנחקרות לשימוש בהם ברפואה רגנרטיבית. בעבודה זו אנו מדגימים הקמת תרבית תאי גזע מזנכימלית ראשונית מרקמת השן בשיטת תרבית אקספלנט. התאים המבודדים היו בצורת ציר והודבקו למשטח הפלסטיק של צלחת התרבית. האפיון הפנוטיפי של תאי גזע אלה הראה ביטוי חיובי של האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית (ISCT) - סמנים המומלצים על פני התא עבור MSC, כגון CD90, CD73 ו- CD105. יתר על כן, ביטוי זניח של סמני המטופויאט (CD45) ואנדותל (CD34), ופחות מ -2% ביטוי של סמני HLA-DR, אישרו את ההומוגניות והטוהר של תרביות DPSC. הדגמנו עוד יותר את הרב-עוצמה שלהם בהתבסס על התמיינות לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. כמו כן, גרמנו לתאים אלה להתמיין לתאים דמויי כבד ולתאים דמויי תאי עצב על-ידי הוספת אמצעי גירוי תואמים. פרוטוקול אופטימלי זה יסייע בטיפוח אוכלוסייה מתרחבת מאוד של תאי גזע מזנכימליים שישמשו במעבדה או למחקרים פרה-קליניים. פרוטוקולים דומים ניתן לשלב במערכים קליניים לתרגול טיפולים מבוססי DPSC.

Introduction

תאי גזע בוגרים הפכו לכלי טיפולי רב עוצמה לטיפולים וטיפולים מכווני תאים בשל הפלסטיות שלהם, המנגנונים הפרקריניים והתכונות האימונומודולטוריות^{שלהם 1,2,3}. הנתונים המעודדים ממחקרים פרה-קליניים מבוססי תאי גזע נתנו השראה לחוקרים לעבוד עבור תרגום מהספסל למיטה. סוג תאי הגזע המשמשים לטיפול בתאי גזע ממלא תפקיד משמעותי בתוצאות מוצלחות. במחקרים פרה-קליניים וקליניים, המקור המדווח ביותר לתאי גזע מזנכימליים (MSC) נותר מח עצם ^4,5. עם זאת, חסרונות עיקריים לשימוש בתאי גזע שמקורם במח עצם (BMSCs) כוללים את האוכלוסייה הנדירה שלהם, הליכים פו....

Protocol

כל ההליכים המתוארים במחקר אושרו על ידי ועדת האתיקה של המכון (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) של PGIMER, צ'אנדיגאר. כל הניסויים הקשורים לתרביות תאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי Class II (BSC) בעקבות טכניקה אספטית. מוך השן התקבל משיניים בריאות של שלושה מטופלים (F/14, M/14 ו-M/20) שעברו עקירות טוחנות שלישיות מסיבות אורתודונטיות. לפני איסוף הדגימות, התקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופל/אפוטרופוס בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של PGIMER, Chandigarh.

1. הקמת תרבית ראשונית של תאי גזע ממוך השן (DPSCs) מרקמת שיניים אנושית

הערה: אין להשתמש בשיניים רקובות.

1. איסוף דגימות ממוך השן והובלתן למעבדה לתרביות רק....

תוצאות

כאן, אנו מתארים כיצד חוקרים יכולים לבסס תרבות טהורה של DPSCs באמצעות שיטת explant 6,7,8,9,10 ולגרום להם לעבר שושלות מרובות כדי לבסס את טוהר התרבות עבור יישומים במורד הזרם.

ביססנו תרבית ראשונ.......

Discussion

תאי גזע תלו את התקוות לרפא מחלות רבות, בשל הפלסטיות שלהם, חוסנם, תכונותיהם האימונומודולטוריות, המנגנונים הפרקריניים ויעילות הביות שלהם. רקמת מוך השן נחשבת למקור החזק והיקר ביותר של תאי גזע, עם פלסטיות בולטת ויכולת התחדשות. כאן, אנו מדגימים את הבידוד של DPSCs, תוך שימוש בשיטת תרבית explant שאומצה ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G