JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מספק מדריך הדרגתי לביסוס תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן באמצעות שיטת תרבית explant ואפיון תאים אלה בהתבסס על הנחיות ICSCRT. התאים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיחשב כתאי גזע מזנכימליים ליישומים נוספים.

Abstract

מוך השן האנושי מייצג מאגר תאי גזע רב-פוטנטי מבטיח עם יכולת התחדשות בולטת שניתן לקצור משן שנעקרה. המקור האקטו-מזנכימלי הנגזר מסמל עצבי של תאי גזע במוך השן (DPSCs) מעניק רמה גבוהה של פלסטיות הנובעת מיתרונותיו הרב-גוניים בתיקון רקמות והתחדשותן. ישנן דרכים מעשיות שונות לקציר, תחזוקה והתרבות של תאי גזע בוגרים הנחקרות לשימוש בהם ברפואה רגנרטיבית. בעבודה זו אנו מדגימים הקמת תרבית תאי גזע מזנכימלית ראשונית מרקמת השן בשיטת תרבית אקספלנט. התאים המבודדים היו בצורת ציר והודבקו למשטח הפלסטיק של צלחת התרבית. האפיון הפנוטיפי של תאי גזע אלה הראה ביטוי חיובי של האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית (ISCT) - סמנים המומלצים על פני התא עבור MSC, כגון CD90, CD73 ו- CD105. יתר על כן, ביטוי זניח של סמני המטופויאט (CD45) ואנדותל (CD34), ופחות מ -2% ביטוי של סמני HLA-DR, אישרו את ההומוגניות והטוהר של תרביות DPSC. הדגמנו עוד יותר את הרב-עוצמה שלהם בהתבסס על התמיינות לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. כמו כן, גרמנו לתאים אלה להתמיין לתאים דמויי כבד ולתאים דמויי תאי עצב על-ידי הוספת אמצעי גירוי תואמים. פרוטוקול אופטימלי זה יסייע בטיפוח אוכלוסייה מתרחבת מאוד של תאי גזע מזנכימליים שישמשו במעבדה או למחקרים פרה-קליניים. פרוטוקולים דומים ניתן לשלב במערכים קליניים לתרגול טיפולים מבוססי DPSC.

Introduction

תאי גזע בוגרים הפכו לכלי טיפולי רב עוצמה לטיפולים וטיפולים מכווני תאים בשל הפלסטיות שלהם, המנגנונים הפרקריניים והתכונות האימונומודולטוריותשלהם 1,2,3. הנתונים המעודדים ממחקרים פרה-קליניים מבוססי תאי גזע נתנו השראה לחוקרים לעבוד עבור תרגום מהספסל למיטה. סוג תאי הגזע המשמשים לטיפול בתאי גזע ממלא תפקיד משמעותי בתוצאות מוצלחות. במחקרים פרה-קליניים וקליניים, המקור המדווח ביותר לתאי גזע מזנכימליים (MSC) נותר מח עצם 4,5. עם זאת, חסרונות עיקריים לשימוש בתאי גזע שמקורם במח עצם (BMSCs) כוללים את האוכלוסייה הנדירה שלהם, הליכים פולשניים מאוד לבידוד, ויכולתם המוגבלת להתרחב. לכן, מקורות חלופיים של MSCs נבדקים. בהקשר זה, רקמות שיניים, עם קלות הנגישות שלהן, פלסטיות עצומה, פוטנציאל התחדשות גבוה, ויכולת שגשוג גבוהה, נחשבו כעת כמקור חלופי עשיר ופוטנציאלי של תאי גזע 6,7,8,9,10.

תאי גזע מוך השן (DPSCs) היו הסוג הראשון של תאי גזע דנטליים שבודדו ואופיינו על ידי גרונתוס בשנת 200011. DPSCs משכו את תשומת הלב עבור יישומי הנדסת רקמות בגלל שיעור ההתרבות הגבוה שלהם, פוטנציאל בידול משמעותי, קלות הנגישות עם תרבית ללא מאמץ, והכי חשוב, היכולת שלהם להתקבל משן שהושלכה ללא כל חשש אתי12. המגבלות שמציבים מקורות תאי גזע אחרים, כגון BMSCs ותאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs), בבידודם וביכולות ההתחדשות העצמית הלא מספקות שלהם נעקפות על ידי DPSCs13. ניתן להשיג DPSCs אנושיים משיניים ראשוניות אנושיות, שיניים קבועות, שיני בינה, שיניים נשירות מתקלפות (SHEDs) ופפילות אפיות. יתר על כן, DPSCs ניתן גם לבודד שיניים supernumerary, אשר בדרך כלל מושלכים14. DPSCs מבטאים סמנים הקשורים לסמל עצבי ויש להם פוטנציאל להתמיין לתאים עצביים הן במבחנה והן in vivo15. בנוסף לפוטנציאל הנוירוגני שלהם, DPSCs יכולים להתמיין לשושלות תאים אחרות, כגון אוסטאוגניים, כונדרוגנים, אדיפוגניים, כבדיים ומיוגניים, כאשר ניתנים להם תנאי התמיינות ספציפיים13. לפיכך, תאים רב-פוטנטיים אלה טומנים בחובם פוטנציאל רב לטיפול מבוסס תאים וניתן להשתמש בהם להתחדשות רקמות שונות. מחקרים דיווחו גם על התפקיד הפוטנציאלי של DPSCs בשחזור הקרנית16, תיקון אוטם שריר הלב17, ותפקידם הטיפולי הפוטנציאלי במחלות כמו איסכמיה של הגפיים18, אלצהיימר 19, פרקינסון 20 והזדקנות21. לכן, תאי גזע שמקורם ברקמת שיניים יכולים לשמש לא רק להתחדשות שיניים, אלא גם לתיקון והתחדשות של איברים שאינם דנטליים כמו עיניים16, לבבות17, כבדים22, עצמות23 וכו '.

ישנן שתי שיטות מיוחדות לבידוד אוכלוסיית MSC מרקמת מוך השן - עיכול אנזימטי ותרבית צמחים24,25. ביסוס מוצלח של תרבויות ראשוניות ללא הבדל משמעותי בכמות ובמאפיינים של DPSCs דווח בשתי שיטות אלה26. במחקר זה, התמקדנו בבידוד של DPSCs על ידי שיטת explant27, שכן שיטה זו מייצרת DPSCs ללא זיהום של תאים hematopoietic ואנדותל, לעומת עיכול אנזימטי אשר יכול לגרום זיהום פיברובלסט28.

Protocol

כל ההליכים המתוארים במחקר אושרו על ידי ועדת האתיקה של המכון (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) של PGIMER, צ'אנדיגאר. כל הניסויים הקשורים לתרביות תאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי Class II (BSC) בעקבות טכניקה אספטית. מוך השן התקבל משיניים בריאות של שלושה מטופלים (F/14, M/14 ו-M/20) שעברו עקירות טוחנות שלישיות מסיבות אורתודונטיות. לפני איסוף הדגימות, התקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופל/אפוטרופוס בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של PGIMER, Chandigarh.

1. הקמת תרבית ראשונית של תאי גזע ממוך השן (DPSCs) מרקמת שיניים אנושית

הערה: אין להשתמש בשיניים רקובות.

  1. איסוף דגימות ממוך השן והובלתן למעבדה לתרביות רקמה
    1. לבצע הליך עקירת שן בתנאים לא טראומטיים ואספטיים. שטפו היטב את השן שנעקרה בתמיסת מלח סטרילית כדי להסיר שאריות דם.
    2. חותכים את השן שנעקרה לאורכה לשתי חתיכות באמצעות בור סדק קרביד עם השקיה קבועה במי מלח רגילים סטריליים כדי לחשוף את מוך השן.
    3. העבירו את השן שנעקרה יחד עם מוך השן השלם במדיה חיונית סטרילית α-מינימלית (α-MEM) המתוחזקת על קרח למעבדה לתרביות תאים ורקמות.
      הערה: באופן אידיאלי, לעבד את כל הדגימות שהתקבלו בתוך 2 שעות עבור תרבית תאים. עם זאת, דו"ח שנערך לאחרונה הציע כי עיבוד דגימת השן גם לאחר 24 שעות לא השפיע על הכדאיות וההתרבות של DPSCs, עם זאת, זה הפחית את הפונקציונליות שלהם29.

2. הסרת רקמת מוך השן ותרבית התאים של DPSCs (זמן: 60-120 דקות)

הערה: כל השלבים לאחר הובלת שיניים בוצעו במעבדה לתרביות תאים ורקמות בתוך ארון בטיחות ביולוגית רמה 2.

  1. הניחו את דגימת השן בצלחות פטרי בתרבית סטרילית ושטפו ביסודיות (שלוש או ארבע פעמים) בתמיסת מלח סטרילית אחת (PBS).
  2. בזהירות להסיר את רקמת מוך מוך מחלל מוך בעזרת מחפר חד ומלקחיים.
  3. לאחר הסרת העיסת, נקו אותה ביסודיות עם PBS סטרילי כדי להסיר שאריות דם.
  4. חותכים את רקמת עיסת השן לחתיכות קטנות של כ 2-3 מ"מ בעזרת להב כירורגי בצלחת פטרי.
    1. מחלקים את שטח הפנים של המנה לארבעה חלקים על ידי הצבת 1-2 מ"ל של PBS סטרילי בכל אזור. שים את דגימת רקמת מוך השן באזור אחד עם PBS וחתך את הרקמה לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות עם להב כירורגי (ככל שהחתיכה קטנה יותר, כך יהיה קל יותר לתאי גזע לנדוד החוצה מהרקמה). לאחר מכן, להעביר כל חתיכה על ידי הרמת אותו לאזור אחר עם PBS, וכן הלאה עד האזור הרביעי, כך חתיכות הרקמה נשטפים כראוי וללא מזהמים.
  5. בינתיים, יש לשפוך כ-0.8-1 מ"ל של α-MEM המכיל חומצות אמינו לא חיוניות עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) וקוקטייל אנטיביוטי (כלומר, פניצילין וסטרפטומיצין) בבארות של צלחת בעלת 6 בארות. מפזרים את המדיה באופן אחיד על ידי הזזת הצלחת, כך שהיא מפזרת אותה באופן שווה על פני הבאר.
  6. זרעו את החתיכות הקטנות של רקמת עיסת השן או צמחים בעזרת מלקחיים לבאר אחת (ארבע עד שש חתיכות לכל באר) של צלחת 6 הקידוחים ושמרו את הצלחת ללא הפרעה במשך 5 דקות במכסה מנוע בטיחות ביולוגית.
    הערה: שלב זה מאפשר/מסייע בהידבקות רקמות/צמחים למשטחים המטופלים של לוחות התרבית.
  7. שמרו על צלחת התרבית באווירה לחה עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ורמת CO 2 של 5%.
  8. למחרת, שאפו בזהירות את התקשורת מהבארות מבלי להפריע לצמחים והוסיפו לה מדיה טרייה. החליפו את המדיה כל יומיים בשלב זה כדי למנוע התייבשות. יש לוודא שבאינקובטור יש מספיק מים במגש כדי שתוספת אידוי לא תגרום למדיה בבארות הצלחת להתייבש.
    הערה: זהו צעד חיוני מאוד, והפרעה יכולה לגרום לצמחים לזוז ממקומם. אם חתיכות העציץ נעקרות ממקומן במהלך העברת מדיה, נסו לחבר אותן מחדש על ידי הסרת המדיה לחלוטין ולתת להן להיצמד לפני השטח של הבאר. יש להוסיף בזהירות את המדיה לאורך דופן הבאר מבלי להפריע לעציצים, אחרת הם עלולים להתנתק שוב. התבוננו בלוחות תרבית התאים באופן קבוע תחת מיקרוסקופ הפוך (הגדלה פי 4 או 10). זהה DPSCs לפי יכולתם להיצמד למשטח הפלסטיק ולמורפולוגיה בצורת ציר שלהם.
  9. ברגע שמספיק תאים נודדים מהצמחים, מסירים את הרקמות ומאפשרים לתאים להתרבות ולהגיע למפגש תאים אופטימלי של 70%-75% לפני תרבית. ניתן להגדיל את נפח α-MEM המכיל 10% FBS ל -2 מ"ל בשלב זה, כך שהתאים יוכלו להתחלק מהר יותר. החליפו את התקשורת כל שלושה ימים בשלב זה.

3. הרחבת DPSC

  1. שטפו את בקבוק תרבית T75 (מפגש: 70%-80%) של DPSCs פעמיים עם PBS (10 מ"ל).
  2. הוסף 2.5 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) לצד בקבוק T75 וסובב אותו בעדינות כדי להבטיח שהטריפסין-EDTA מכסה את כל גיליון התא או השכבה החד-שכבתית של DPSCs.
  3. יש לשמור את הבקבוק בתוך מכסה המנוע בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות. לאחר 3 דקות, טפחו בעדינות על הבקבוק כדי להבטיח ניתוק של תאים.
  4. הוסף 5 מ"ל של מדיה מלאה (α-MEM עם 10% FBS) או 250 μL של FBS (10% מנפח הטריפסין בשימוש) כחומר מנטרל כדי להשבית את פעילות הטריפסין. העבר את כל תרחיף התא של DPSCs מנותקים בצינור צנטריפוגה חרוטי טרי של 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה את התאים מנותקים ב 500 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את גלולת התא.
  6. שאפו את כל הסופרנאטנט באמצעות הפיפטה, הוסיפו 5-10 מ"ל PBS לבקבוק כדי לאסוף את שאריות התאים, שטפו את התא ב-PBS בפיפטינג עדין, וצנטריפוגו את התאים שוב ב-500 x גרם למשך 2 דקות. חזור על הפעולה במידת הצורך.
  7. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיה שלמה (α-MEM עם 10% FBS) לאחר הסרה זהירה של הסופרנאטנט וביצוע פיפטינג עדין לקבלת תרחיף חד-תאי.
  8. לפצל את התאים ולזרוע אותם (נפח שווה) לשתי צלוחיות תרבית T75, כל אחת מכילה 10 מ"ל של מדיה מלאה מלאה. שמור את הבקבוק בתוך מכסה המנוע ב 37 ° C.
  9. למחרת, שאפו להתנתק מהתקשורת והחליפו אותה במדיה השלמה והרעננה.
    הערה: הארכת הטיפול בטריפסין עלולה לפגוע בשלמות התא, בכדאיות ובתפקוד התא על-ידי ניתוק חלבון פני התא וחלבון מטריצה חוץ-תאי.

4. זיהוי סמנים פנוטיפיים של תאי גזע (זמן: 90 - 120 דקות)

הערה: לאפיון תאים שנקטפו מרקמת מוך השן, השתמש בתאים בין המעבר השלישי לחמישי.

  1. השתמש בשני תאים של 70%-80% (~ 3-4 x 106 ; ספור את התאים באמצעות ציטומטר מבוסס תמונה או המוציטומטר) בשילוב צלוחיות תרבית T75 של DPSCs ושטוף את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS.
  2. הוסיפו 2.5 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ושמרו את הבקבוק בתוך מכסה המנוע בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות. הוסף 5 מ"ל של מדיה מלאה או 250 מיקרוליטר של FBS (10% מנפח הטריפסין בשימוש) כחומר מנטרל כדי להשבית את פעילות הטריפסין.
  3. לאסוף את התאים באמצעות פיפטה בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים מנותקים ב 500 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את גלולת התא.
  4. לשאוף את כל supernatant באמצעות פיפטה, להוסיף 5 מ"ל של PBS לבקבוק כדי לאסוף תאים שאריות, לשטוף את התא PBS עם pipetting עדין, צנטריפוגה התאים שוב ב 500 x גרם במשך 2 דקות.
  5. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של PBS לאחר הסרה זהירה של הסופרנאטנט ולבצע פיפטינג עדין לקבלת תרחיף חד-תאי.
  6. ספור את התאים באמצעות ציטומטר מבוסס תמונה או המוציטומטר, בהתאם לזמינות, ולהפיץ אותם בצינורות מיקרוצנטריפוגות ב 1 x 104 תאים / צינור. לדגור על התאים באלבומין של 0.5%-1% בסרום בקר (BSA) למשך 0.5-1 שעות.
  7. לכל צינור, הוסף 1-2 μL של נוגדנים מצומדים פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) ופיקואריתרין (PE) עבור סמני אשכול התמיינות (CD) (כלומר, CD90 [0.4 מיקרוגרם], CD73 [0.8 מיקרוגרם], CD105 [0.4 מיקרוגרם], CD34 [0.8 מיקרוגרם], CD45 [0.4 מיקרוגרם] ו- HLA-DR [0.08 מיקרוגרם])6,7,8,9 ודגור במשך 0.5 שעות בחושך בטמפרטורת החדר.
  8. לאחר 0.5 שעות, גלולה למטה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נטנט, שטפו את גלולת התאים עם PBS, ושוב צנטריפוגה.
  9. לאחר הצנטריפוגה, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-PBS (200 מיקרוליטר/צינור), להעביר את תרחיף התא לצינורות ציטומטריית זרימה ולרכוש אותם באמצעות ציטומטר זרימה. כל תוכנה מסחרית יכולה לשמש כדי לנתח את אחוז התאים החיוביים עוד יותר עבור נוגדנים שונים.
    הערה: שלבים 4.7 עד 4.9 יבוצעו בחושך בטמפרטורת החדר. יש להשתמש בבקרות איזוטיפ מתאימות ובדגימות לא מוכתמות כדי להשמיט את פלואורסצנטיות הרקע של התאים.

5. בידול DPSC למספר שושלות

הערה: השתמש בתרביות משולבות של 75%-80% של DPSCs במעבר השלישי עד החמישי להערכת רב-עוצמה. יש להשתמש בקבוצת תאי ביקורת המכילה α-MEM עבור כל סוגי ההתמיינות המתוארים להלן.

  1. התמיינות אוסטאוגנית של DPSCs, צביעה אדומה אליזרין וכימות
    1. בצע תרחיף חד-תאי באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA, כמתואר לעיל בשלב 4.2, והשהה מחדש את גלולת התא ב-α-MEM מלא.
    2. ספרו את התאים וזרעו אותם בצלחות 24 בארות שטופלו בתרבית רקמה בצפיפות תאים של 2 x 104 תאים / באר המכילה 0.4-0.5 מ"ל של מדיה מלאה למשך 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
    3. לאחר 48 שעות, הסר את המדיה מהבארות והוסף 0.4-0.5 מ"ל של מדיה השראתית אוסטאוגנית (כלומר, α-MEM עם גורמים אינדוקטיביים אוסטאוגניים כגון בטא גליצרופוספט [5 mM], פוספט monopotassium [1.8 mM], ו dexamethasone דיסודיום פוספט [0.01 mM])8. הכינו בארות בקרה (תאים לא מושרים) המכילות α-MEM מלא בלבד ללא גורמים אינדוקטיביים אוסטאוגניים (אמצעי בקרה).
      הערה: תוספת של 50 מיקרומטר אסקורבט מדווחת גם כדי לשפר את התמיינות אוסטאוגנית 30,31. לאחר כל יום שלישי, החלף את מדיית האינדוקציה ואמצעי הבקרה במדיה ותרבות רעננה למשך 21 יום (3 שבועות). בתום תקופת האינדוקציה, הסר את המדיה מלוחות התרבית, הוסף 0.5 מ"ל PBS ושטוף פעמיים.
    4. לאחר שטיפת PBS, יש לקבע את התאים ב-0.5 מ"ל של תמיסת פורמלין חוצץ 10% נייטרלי (NBF) למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר. יש לבצע קיבוע במנדף/מכסה מנוע כימי.
  2. כתם אדום אליזרין
    1. הכינו את כתם ה-S האדום של אליזרין (2%) על ידי המסת 1 גרם של S אדום אליזרין ב-50 מ"ל מים מזוקקים כפול (ddH2O) והתאמת ה-pH ל-4.0-4.2 בעזרת חומצה הידרוכלורית (HCL) או אמוניום הידרוקסיד (NH4OH). סנן את הכתם עם נייר סינון. יש לאחסן את הכתם בחושך (4°C).
    2. שטפו את התאים פעמיים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O), הוסיפו כתם S אדום אליזרין ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות.
    3. הסר את הכתם מכל הבארות ושטוף את התאים ארבע או חמש פעמים עם ddH2O כדי להסיר כל כתם לא קשור. צלם את התמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
  3. מיצוי כתם אדום אליזרין לניתוח כמותי
    1. הוסף חיץ צטיל פירידיניום כלוריד (CPC) (pH 7.0) לבארות המוכתמות (0.4 מ"ל / באר) ודגר על התאים במשך 2 שעות ב 37 ° C. בנוסף, התאים יכולים גם להיות מודגרים עם 10% חומצה אצטית להמסה נכונה של גבישים אדומים alizarin32. שומרים את הצלחות על נדנדה או שייקר לצלחות.
    2. לאחר הדגירה, אספו את הסופרנאטנט (צבע שחולץ), העבירו אותו לצלחת בת 96 בארות, וקראו את הצלחת או הדגימות ב-405 ננומטר. כדי לקבל ערך ריק, הוסף מאגר CPC (אותו אמצעי אחסון) בלבד וקראאת 32,33 .

6. בידול אדיפוגני של DPSCs, צביעת O אדום שמן וכימות

הערה: השלבים הראשונים של הזריעה זהים לאלה שלעיל (כלומר, שלב התמיינות אוסטאוגנית 5.1).

  1. לאחר 48 שעות, הסר את המדיה מהבארות והוסף 0.4-0.5 מ"ל של מדיה השראתית אדיפוגנית (כלומר, α-MEM עם גורמים אינדוקטיביים אדיפוגניים כגון איזובוטיל-מתילקסנטין [IBMX; 0.5 מילימול], דקסמתזון [1 מיקרומטר], אינדומתצין [200 מיקרומטר], ואינסולין [10 מיקרומטר])8. הכינו בארות בקרה המכילות תאים בלתי מושרים (כלומר, תרבית ב-α-MEM בלבד ללא גורמים אינדוקטיביים {אמצעי בקרה]).
  2. לחדש את התקשורת כל יום שלישי תרבית את התאים במשך 3 שבועות. לאחר 3 שבועות, שאפו את המדיה מצלחות התרבית והוסיפו 0.5 מ"ל PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.
  3. לאחר שטיפת PBS, תקנו את התאים בתמיסת NBF 10% למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו את התאים פעמיים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O), הוסיפו כתם O אדום שמן ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30-40 דקות.
  5. הסירו את הכתם מכל הבארות ושטפו את הבארות המכילות תאים שוב ושוב עם ddH2O עד לניקוי (פעמיים עד ארבע פעמים). התבונן מתחת למיקרוסקופ וצלם תמונות.
  6. שמן אדום O מיצוי לניתוח כמותי
    1. מוסיפים 0.4 מ"ל של 100% 2-פרופנול לבארות המוכתמות ודגרים בטמפרטורת החדר על ידי כיסוי נכון של הצלחת למשך 30 דקות. שמור את הצלחת על נדנדה צלחת או שייקר.
    2. לאחר הדגירה, לאסוף את supernatant, להעביר אותו צלחת 96 באר, לקרוא את הצלחת או דגימות ב 510 ננומטר. יש להשתמש ב-100% 2-פרופנול לכיסוי.

7. התמיינות כונדרוגנית של DPSCs, צביעה כחולה אלקיאנית וכימות

הערה: התמיינות כונדרוגנית נגרמה בתרבית החד-שכבתית של DPSCs. השלבים הראשונים של הזריעה זהים לעיל (כלומר, שלב התמיינות אוסטאוגנית 5.1).

  1. לאחר 48 שעות, הסר את המדיה מהבארות והוסף 0.4-0.5 מ"ל של מדיה אינדוקציה כונדרוגנית (כלומר, α-MEM עם גורמים אינדוקטיביים ספציפיים להתמיינות כונדרוגנית, חומצה אסקורבית [0.2 M], נתרן פירובט [1 mM], הפיכת גורם גדילה-בטא 3 [TGF-β3; 10 μM], dexamethasone [1 mM], ו 1x ITS premix [אינסולין, טרנספרין, וחומצה סלנוס)10. הכינו בארות בקרה המכילות תאים בלתי מושרים (כלומר, תרבית ב-α-MEM בלבד ללא גורמים אינדוקטיביים [אמצעי בקרה]).
  2. לחדש את התקשורת כל יום שלישי תרבית את התאים במשך 3 שבועות. לאחר תום תקופת האינדוקציה, שאפו את המדיה מצלחות התרבית והוסיפו 0.5 מ"ל PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.
  3. לאחר שטיפת PBS, יש לקבע את התאים בתמיסת NBF 10% למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים פעמיים או שלוש במים מזוקקים פעמיים (ddH2O), הוסיפו כתם כחול אלקיאני ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
  4. הסירו את הכתם מכל הבארות, ולאחר מכן שטפו עם 0.1 N HCL פעמיים או שלוש. לשטוף את התאים ארבע או לתת פעמים עם ddH2O.
  5. התבונן בתאים עבור פרוטאוגליקנים (צבע כחול) מתחת למיקרוסקופ וללכוד את התמונות.
  6. לכימות כחול אלקיאני, חלצו את הצבע באמצעות 6M guanidine-HCl וקראו את הדגימות בצפיפות אופטית (OD) של 595 ננומטר. הערכה הכחולה Alcian המשמשת במחקר זה מכתימה פרוטאוגליקנים חומציים בסחוס ונקשרת במיוחד גליקוזאמינוגליקנים סולפטים (GAGs) הנמצאים במטריצה של כונדרוציטים10.

8. הבחנה של DPSCs לכיוון שושלת דמוית כבד ואפיון

  1. בצע השעיה חד-תאית של תאים על ידי טיפול בטריפסין, כמתואר לעיל, והשהה מחדש את גלולת התא ב-α-MEM מלא.
  2. לספור את התאים ולזרוע אותם 24 צלחות תרבית מטופלות היטב ב 2 x 104 תאים / באר המכילים 0.4-0.5 מ"ל של מדיה שלמה במשך 48 שעות.
  3. לאחר 48 שעות, להסיר את התקשורת מן הבארות לדגור את התאים עם תווך אינדוקציה בכבד במשך 14 ימים. מדיית האינדוקציה מורכבת ממדיום עיט מעובד דל גלוקוז (DMEM) המכיל דקסמתזון (0.5 מיקרומטר), גורם גדילה אפידרמיס (EGF; 2 נ"ג/מ"ל), פרמיקס ITS+ (50 מ"ג/מ"ל) וגורם גדילה הפטוציטים (HGF; 20 ננוגרם/מ"ל) 6.
  4. לאחר 14 יום, החלף את המדיה במדיום הבשלה למשך 14 יום נוספים (α-MEM בתוספת Oncostatin M [OSM; 20 ng/mL], ITS premix [50 מ"ג/מ"ל] ודקסמתזון [0.5 מיקרומטר]) 6. לחדש את התקשורת עם מדיה רעננה לאחר כל יום שלישי.
  5. בצע ניתוח אימונוהיסטוכימיה ובדיקת ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) לאישור התמיינות דמוית כבד.
    1. ספיגה של LDL וצביעה אימונופלואורסצנטית עבור קולטן LDL
      הערה: תאים דמויי הפטוציטים לאחר התמיינות התאפיינו בערכת בדיקת ספיגת LDL בהתאם להוראות הערכה. פלואורוכרום LDL-550 שימש להערכת ספיגת LDL בתאים ממוינים במצב החי ונוגדן קולטן LDL שימש לזיהוי קולטני LDL בתאים ממוינים לאחר קיבוע.
      1. לאחר ההתמיינות, מכתימים את התאים החיים עם LDL-550 (1:100) למשך 3-4 שעות. לאחר 3-4 שעות, החליפו את תמיסת הצביעה במדיה תרבותית וצפו בספיגת LDL תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל לעירור ואורכי גל של פרופידיום יודיד (PI) ב-537 ו-617 ננומטר, בהתאמה.
      2. תקן את התאים בתמיסת הקיבוע למשך 10 דקות. לאחר קיבוע התא, חסום את התאים בתמיסת החסימה למשך 30 דקות.
      3. לדגור על התאים עם נוגדן קולטן LDL ראשוני במשך 1 שעות, לשטוף עם 1x PBS שלוש פעמים, ולאחר מכן לדגור עם 488 נוגדנים משניים (1:100) במשך 1 שעה בחושך.
      4. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר נוגדן משני עודף. הוסף 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ככתם גרעיני.
      5. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל למדוד אורכי גל בטווח עירור/פליטה של DAPI, PI ו-FITC.
        הערה: ניתן להקליט פרמטרים של עוצמת תא בודד כדי לכמת את ביטוי הנוגדנים של קולטן LDL ואת ספיגת ה- LDL. יש להשתמש בבקרות נוגדנים משניות נאותות עבור צביעת אימונופלואורסצנטיות כדי להשמיט פלואורסצנטיות רקע הנובעת מהנוגדן המשני בלבד.

9. התמיינות עצבית של DPSCs לקראת שושלת ואפיון דמויי נוירונים

  1. לאחר ציפוי התאים, כמתואר לעיל, תרבית את התאים ב- α-MEM למשך 48 שעות.
  2. שאפו את המדיה והחליפו אותה במדיה נוירובזאלית המכילה גורמי גדילה כגון תוסף G5 0.5%, תוסף N2 0.2%, גורם גדילה אפידרמיס 20 ng/mL, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי 20 ng/mL ותוסף B27 (1%). תרבית את התאים במדיה זו במשך 25-41 ימים7.
  3. שנה את התקשורת כל יום שני או שלישי, בהתאם חילוף החומרים שלה על ידי התאים. כדי להשיג הבשלה עצבית יעילה ויותר נוירונים הקשורים לחלבון-2 (MAP-2+), הסר EGF וגורם גדילה פיברובלסטי 2 (FGF2) לאחר שלב האינדוקציה העצבית (14 יום).
    הערה: עם הזמן ולאחר שינויי מדיה חוזרים ונשנים, תאי עצב ממוינים עשויים להראות ניתוק מבארות הצלחת עקב היצמדות נמוכה, וכתוצאה מכך אובדן נוירונים בתרבית לטווח ארוך. כדי למנוע זאת, מעילים את בארות הצלחת עם laminin או fibronectin (אופציונלי).
  4. בצע ניתוח אימונוהיסטוכימיה לאישור התמיינות דמוית עצב.
    1. Immunostaining של DPSCs מובחנים
      הערה: כדי לאשר את ההתמיינות העצבית של DPSCs, אימונוציטוכימיה בוצעה בתאים ממוינים באמצעות נוגדנים MAP-2 ונוירופילמנט (NFM), שהם חלבונים ספציפיים לשושלת נוירוגנית7.
      1. הסר את מדיית התרבות לאחר השלמת הבידול. מוסיפים PBS, מערבלים בעדינות את הצלחת ומסירים את PBS בעזרת פיפטה. חזור על השלב.
      2. תקן את התאים באמצעות 10% NBF או 4% paraformaldehyde במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. הסר את הקיבוע ולשטוף את התאים עם 1x PBS פעמיים או שלוש. מוסיפים תמיסת חדירה (Triton-X-100; 0.1%) ודגרים על התאים למשך 5 דקות.
      4. בצע שטיפת PBS פעמיים או שלוש וחסום את התאים עם סוכן חוסם 0.5%-1% (BSA) למשך שעה אחת ב 37 ° C או לילה ב 4 ° C. הסר את הסוכן החוסם ושטוף את התאים עם PBS 1x.
      5. לדגור על התאים במשך הלילה עם נוגדן ראשוני (מוכן 0.1% BSA, NFM [1:50], ו MAP-2 [1:200]).
      6. הסר את הנוגדן הראשוני ושטוף את התאים עם PBS 1x שלוש או ארבע פעמים כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
      7. מוסיפים נוגדן משני (ארנב נגד עכבר 1:2,000) ודגרים על התאים בטמפרטורת החדר למשך 1.5-2 שעות בחושך. לשטוף את התאים עם PBS (פעמיים או שלוש).
      8. יש לדגור על התאים ב-DAPI למשך 10 דקות ולשטוף שוב עם PBS. שמור על הנפח השיורי כדי למנוע התייבשות של הדגימה. התבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
        הערה: בנוסף, ניתן לבצע גם יציבות קריוטיפ10 ואפיון הזדקנות כדי לקבל מושג טוב יותר על הטוהר והפונקציונליות של התאים.

תוצאות

כאן, אנו מתארים כיצד חוקרים יכולים לבסס תרבות טהורה של DPSCs באמצעות שיטת explant 6,7,8,9,10 ולגרום להם לעבר שושלות מרובות כדי לבסס את טוהר התרבות עבור יישומים במורד הזרם.

ביססנו תרבית ראשונ...

Discussion

תאי גזע תלו את התקוות לרפא מחלות רבות, בשל הפלסטיות שלהם, חוסנם, תכונותיהם האימונומודולטוריות, המנגנונים הפרקריניים ויעילות הביות שלהם. רקמת מוך השן נחשבת למקור החזק והיקר ביותר של תאי גזע, עם פלסטיות בולטת ויכולת התחדשות. כאן, אנו מדגימים את הבידוד של DPSCs, תוך שימוש בשיטת תרבית explant שאומצה ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים כספי או לא כספי.

Acknowledgements

אנו מכירים בתמיכת המימון ל- AK מהמחלקה למחקר בריאות (DHR), ICMR, ממשלת הודו (מענק DHR-NRI # R.12015/01/2022-HR). SR קיבלה מימון מ- ICMR, ממשלת הודו (מענק # 2020-7593 / SCR-BMS) ו- PS קיבלה מלגה מ- CSIR, ממשלת הודו. אנו מודים גם לגב' סנדיה טוקי ולגב' בהופינדר קאור על הסיוע בציטומטריית זרימה, וליבת מכשור מתוחכמת מרכזית (CSIC) ו-PGIMER, צ'אנדיגאר על מתן תמיכה תשתיתית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well cell culture plateCostar3516For cell culture
Alcian blue stainEZstain chondrocyte staining kit, HiMediaCCK029
alizarin red S stainSigma-AldrichTMS-008Osteogenic stain
Antibiotic cocktailHimediaA002-5X50MLTo prevent culture contamination
Ascorbic AcidHimediaTC094-25GChondrogenic induction
B27 supplementGibco17504044For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)GibcoPHG0024For neural induction
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)Sigma-Aldrich1104006For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodiumSigma-AldrichD1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineHimediaTS1006-5LFor washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)GibcoPHG0311For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscopeInvitrogenFor  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kitHimediaCCK029-1KTChondro stain Kit
FACS Canto flow cytometerBD BiosciencesFor cell characterization
Fetal Bovine SerumGibco16000044For primary culture
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442For cell culture
G5 supplementGibco17503012For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)Sigma-AldrichH1404For hepatic Induction
HLA-DRBiolegend307605
 Human TGF-β3Peprotech#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premixSigma-AldrichI3146For hepatic Induction
ITS premixCorning354350
LDL Uptake Assay kitAbcamab133127For hepatic characterization
Low glucose DMEMGibco11885-084For hepatic induction
MAP2 antibodySigma-AldrichM4403For neural characterization
N2 supplementGibco17502048For neural induction
Neural Basal MediaGibco21103049For neural induction
NFM antibodySigma-AldrichN4142For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscopeNikonFor  fluorescence imaging
Oil Red OSigma-Aldrich01391-250MlAdipogenic stain
Oncostatin MR&D Systems295-OM-010/CFFor hepatic Induction
PetridishTarson460090-90MMFor tissue cutting
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich15655-100GOsteogenic induction
Propan-2-olThermo FisherQ13827For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solutionSigma life sciencesS8636-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049For cell passaging
Whatman filter papermerckWHA1001325filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)Sigma-AldrichM0643-10X 1LMedia for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422-50G

References

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulation Research. 124 (6), 837-839 (2019).
  3. Raik, S., Kumar, A., Bhattacharyya, S. Insights into cell-free therapeutic approach: Role of stem cell "soup-ernatant". Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (2), 104-118 (2018).
  4. Rodriguez-Fuentes, D. E., et al. Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review. Archives of Medical Research. 52 (1), 93-101 (2021).
  5. Yamazaki, K., Kawabori, M., Seki, T., Houkin, K. Clinical trials of stem cell treatment for spinal cord injury. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3994 (2020).
  6. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific Reports. 7 (1), 15015 (2017).
  7. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  8. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome proteins regulate comparative osteogenic and adipogenic potential in bone marrow and dental stem cells. Biochimie. 155, 129-139 (2018).
  9. Kumar, A., Bhattacharyya, S., Rattan, V. Effect of uncontrolled freezing on biological characteristics of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Bank. 16 (4), 513-522 (2015).
  10. Raik, S., et al. Assessment of post-thaw quality of dental mesenchymal stromal cells after long-term cryopreservation by uncontrolled freezing. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (2), 728-743 (2020).
  11. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  12. Tsutsui, T. W. Dental pulp stem cells: advances to applications. Stem Cells and Cloning. 13, 33-42 (2020).
  13. Huang, G. T. -. J., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  14. La Noce, M., et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. Journal of Dentistry. 42 (7), 761-768 (2014).
  15. Xiao, L., Tsutsui, T. Characterization of human dental pulp cells-derived spheroids in serum-free medium: stem cells in the core. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2624-2636 (2013).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
  17. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26 (3), 638-645 (2008).
  18. Yong, Z., et al. Comparison of the angiogenic ability between SHED and DPSC in a mice model with critical limb ischemic. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (4), 861-870 (2022).
  19. Zhang, X. M., et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cell transplantation in a rat model of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 16 (5), 893-898 (2021).
  20. Kabir, R., et al. Imperative role of dental pulp stem cells in regenerative therapies: a systematic review. Nigerian Journal of Surgery. 20 (1), 1-8 (2014).
  21. Kumar, A., et al. Dental pulp stem cell secretome ameliorates d-galactose induced accelerated aging in rat model. Cell Biochemistry and Function. 40 (5), 535-545 (2022).
  22. Hirata, M., et al. Multifaceted therapeutic benefits of factors derived from dental pulp stem cells for mouse liver fibrosis. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1416-1424 (2016).
  23. Fujii, Y., et al. regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 24 (2018).
  24. Ferrua, C. P., et al. How has dental pulp stem cells isolation been conducted? A scoping review. Brazilian Oral Research. 31, e87 (2017).
  25. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica. 65 (3), 124-133 (2019).
  26. Tatullo, M., Marrelli, M., Shakesheff, K. M., White, L. J. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 1205-1216 (2015).
  27. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  28. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), e12334 (2017).
  29. Aryal Ac, S., Islam, M. S., Samsudin, A. R. Investigation of the effect of a time delay on the characteristics and survival of dental pulp stem cells from extracted teeth. Archives of Oral Biology. 119, 104896 (2020).
  30. Langenbach, F., Handschel, J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 117 (2013).
  31. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 64 (2), 295-312 (1997).
  32. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the alizarin red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. International Journal of Molecular Sciences. 24 (1), 723 (2022).
  33. Coe, C. L., Lubach, G. R., Schneider, M. L., Dierschke, D. J., Ershler, W. B. Early rearing conditions alter immune responses in the developing infant primate. Pediatrics. 90, 505-509 (1992).
  34. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcified Tissue International. 88 (2), 130-141 (2011).
  35. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 26 (7), 1787-1795 (2008).
  36. Kim, B. C., et al. Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 235-244 (2012).
  37. Ge, J., et al. Distal C terminus of CaV1.2 channels plays a crucial role in the neural differentiation of dental pulp stem cells. PLoS One. 8 (11), e81332 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved