A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מספק מדריך הדרגתי לביסוס תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן באמצעות שיטת תרבית explant ואפיון תאים אלה בהתבסס על הנחיות ICSCRT. התאים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיחשב כתאי גזע מזנכימליים ליישומים נוספים.

Abstract

מוך השן האנושי מייצג מאגר תאי גזע רב-פוטנטי מבטיח עם יכולת התחדשות בולטת שניתן לקצור משן שנעקרה. המקור האקטו-מזנכימלי הנגזר מסמל עצבי של תאי גזע במוך השן (DPSCs) מעניק רמה גבוהה של פלסטיות הנובעת מיתרונותיו הרב-גוניים בתיקון רקמות והתחדשותן. ישנן דרכים מעשיות שונות לקציר, תחזוקה והתרבות של תאי גזע בוגרים הנחקרות לשימוש בהם ברפואה רגנרטיבית. בעבודה זו אנו מדגימים הקמת תרבית תאי גזע מזנכימלית ראשונית מרקמת השן בשיטת תרבית אקספלנט. התאים המבודדים היו בצורת ציר והודבקו למשטח הפלסטיק של צלחת התרבית. האפיון הפנוטיפי של תאי גזע אלה הראה ביטוי חיובי של האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית (ISCT) - סמנים המומלצים על פני התא עבור MSC, כגון CD90, CD73 ו- CD105. יתר על כן, ביטוי זניח של סמני המטופויאט (CD45) ואנדותל (CD34), ופחות מ -2% ביטוי של סמני HLA-DR, אישרו את ההומוגניות והטוהר של תרביות DPSC. הדגמנו עוד יותר את הרב-עוצמה שלהם בהתבסס על התמיינות לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. כמו כן, גרמנו לתאים אלה להתמיין לתאים דמויי כבד ולתאים דמויי תאי עצב על-ידי הוספת אמצעי גירוי תואמים. פרוטוקול אופטימלי זה יסייע בטיפוח אוכלוסייה מתרחבת מאוד של תאי גזע מזנכימליים שישמשו במעבדה או למחקרים פרה-קליניים. פרוטוקולים דומים ניתן לשלב במערכים קליניים לתרגול טיפולים מבוססי DPSC.

Introduction

תאי גזע בוגרים הפכו לכלי טיפולי רב עוצמה לטיפולים וטיפולים מכווני תאים בשל הפלסטיות שלהם, המנגנונים הפרקריניים והתכונות האימונומודולטוריותשלהם 1,2,3. הנתונים המעודדים ממחקרים פרה-קליניים מבוססי תאי גזע נתנו השראה לחוקרים לעבוד עבור תרגום מהספסל למיטה. סוג תאי הגזע המשמשים לטיפול בתאי גזע ממלא תפקיד משמעותי בתוצאות מוצלחות. במחקרים פרה-קליניים וקליניים, המקור המדווח ביותר לתאי גזע מזנכימליים (MSC) נותר מח עצם 4,5. עם זאת, חסרונות עיקריים לשימוש בתאי גזע שמקורם במח עצם (BMSCs) כוללים את האוכלוסייה הנדירה שלהם, הליכים פו....

Protocol

כל ההליכים המתוארים במחקר אושרו על ידי ועדת האתיקה של המכון (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) של PGIMER, צ'אנדיגאר. כל הניסויים הקשורים לתרביות תאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי Class II (BSC) בעקבות טכניקה אספטית. מוך השן התקבל משיניים בריאות של שלושה מטופלים (F/14, M/14 ו-M/20) שעברו עקירות טוחנות שלישיות מסיבות אורתודונטיות. לפני איסוף הדגימות, התקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופל/אפוטרופוס בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של PGIMER, Chandigarh.

1. הקמת תרבית ראשונית של תאי גזע ממוך השן (DPSCs) מרקמת שיניים אנושית

הערה: אין להשתמש בשיניים רקובות.

  1. איסוף דגימות ממוך השן והובלתן למעבדה לתרביות רק....

תוצאות

כאן, אנו מתארים כיצד חוקרים יכולים לבסס תרבות טהורה של DPSCs באמצעות שיטת explant 6,7,8,9,10 ולגרום להם לעבר שושלות מרובות כדי לבסס את טוהר התרבות עבור יישומים במורד הזרם.

ביססנו תרבית ראשונ.......

Discussion

תאי גזע תלו את התקוות לרפא מחלות רבות, בשל הפלסטיות שלהם, חוסנם, תכונותיהם האימונומודולטוריות, המנגנונים הפרקריניים ויעילות הביות שלהם. רקמת מוך השן נחשבת למקור החזק והיקר ביותר של תאי גזע, עם פלסטיות בולטת ויכולת התחדשות. כאן, אנו מדגימים את הבידוד של DPSCs, תוך שימוש בשיטת תרבית explant שאומצה ?.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים כספי או לא כספי.

Acknowledgements

אנו מכירים בתמיכת המימון ל- AK מהמחלקה למחקר בריאות (DHR), ICMR, ממשלת הודו (מענק DHR-NRI # R.12015/01/2022-HR). SR קיבלה מימון מ- ICMR, ממשלת הודו (מענק # 2020-7593 / SCR-BMS) ו- PS קיבלה מלגה מ- CSIR, ממשלת הודו. אנו מודים גם לגב' סנדיה טוקי ולגב' בהופינדר קאור על הסיוע בציטומטריית זרימה, וליבת מכשור מתוחכמת מרכזית (CSIC) ו-PGIMER, צ'אנדיגאר על מתן תמיכה תשתיתית.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well cell culture plateCostar3516For cell culture
Alcian blue stainEZstain chondrocyte staining kit, HiMediaCCK029
alizarin red S stainSigma-AldrichTMS-008Osteogenic stain
Antibiotic cocktailHimediaA002-5X50MLTo prevent culture contamination
Ascorbic AcidHimediaTC094-25GChondrogenic induction
B27 supplementGibco17504044For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)GibcoPHG0024For neural induction
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)Sigma-Aldrich1104006For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodiumSigma-AldrichD1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineHimediaTS1006-5LFor washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)GibcoPHG0311For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscopeInvitrogenFor  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kitHimediaCCK029-1KTChondro stain Kit
FACS Canto flow cytometerBD BiosciencesFor cell characterization
Fetal Bovine SerumGibco16000044For primary culture
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442For cell culture
G5 supplementGibco17503012For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)Sigma-AldrichH1404For hepatic Induction
HLA-DRBiolegend307605
 Human TGF-β3Peprotech#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premixSigma-AldrichI3146For hepatic Induction
ITS premixCorning354350
LDL Uptake Assay kitAbcamab133127For hepatic characterization
Low glucose DMEMGibco11885-084For hepatic induction
MAP2 antibodySigma-AldrichM4403For neural characterization
N2 supplementGibco17502048For neural induction
Neural Basal MediaGibco21103049For neural induction
NFM antibodySigma-AldrichN4142For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscopeNikonFor  fluorescence imaging
Oil Red OSigma-Aldrich01391-250MlAdipogenic stain
Oncostatin MR&D Systems295-OM-010/CFFor hepatic Induction
PetridishTarson460090-90MMFor tissue cutting
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich15655-100GOsteogenic induction
Propan-2-olThermo FisherQ13827For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solutionSigma life sciencesS8636-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049For cell passaging
Whatman filter papermerckWHA1001325filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)Sigma-AldrichM0643-10X 1LMedia for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422-50G

References

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulati....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved