A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מאמר זה מספק מדריך הדרגתי לביסוס תרבית ראשונית של תאי גזע במוך השן באמצעות שיטת תרבית explant ואפיון תאים אלה בהתבסס על הנחיות ICSCRT. התאים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיחשב כתאי גזע מזנכימליים ליישומים נוספים.
מוך השן האנושי מייצג מאגר תאי גזע רב-פוטנטי מבטיח עם יכולת התחדשות בולטת שניתן לקצור משן שנעקרה. המקור האקטו-מזנכימלי הנגזר מסמל עצבי של תאי גזע במוך השן (DPSCs) מעניק רמה גבוהה של פלסטיות הנובעת מיתרונותיו הרב-גוניים בתיקון רקמות והתחדשותן. ישנן דרכים מעשיות שונות לקציר, תחזוקה והתרבות של תאי גזע בוגרים הנחקרות לשימוש בהם ברפואה רגנרטיבית. בעבודה זו אנו מדגימים הקמת תרבית תאי גזע מזנכימלית ראשונית מרקמת השן בשיטת תרבית אקספלנט. התאים המבודדים היו בצורת ציר והודבקו למשטח הפלסטיק של צלחת התרבית. האפיון הפנוטיפי של תאי גזע אלה הראה ביטוי חיובי של האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית (ISCT) - סמנים המומלצים על פני התא עבור MSC, כגון CD90, CD73 ו- CD105. יתר על כן, ביטוי זניח של סמני המטופויאט (CD45) ואנדותל (CD34), ופחות מ -2% ביטוי של סמני HLA-DR, אישרו את ההומוגניות והטוהר של תרביות DPSC. הדגמנו עוד יותר את הרב-עוצמה שלהם בהתבסס על התמיינות לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. כמו כן, גרמנו לתאים אלה להתמיין לתאים דמויי כבד ולתאים דמויי תאי עצב על-ידי הוספת אמצעי גירוי תואמים. פרוטוקול אופטימלי זה יסייע בטיפוח אוכלוסייה מתרחבת מאוד של תאי גזע מזנכימליים שישמשו במעבדה או למחקרים פרה-קליניים. פרוטוקולים דומים ניתן לשלב במערכים קליניים לתרגול טיפולים מבוססי DPSC.
תאי גזע בוגרים הפכו לכלי טיפולי רב עוצמה לטיפולים וטיפולים מכווני תאים בשל הפלסטיות שלהם, המנגנונים הפרקריניים והתכונות האימונומודולטוריותשלהם 1,2,3. הנתונים המעודדים ממחקרים פרה-קליניים מבוססי תאי גזע נתנו השראה לחוקרים לעבוד עבור תרגום מהספסל למיטה. סוג תאי הגזע המשמשים לטיפול בתאי גזע ממלא תפקיד משמעותי בתוצאות מוצלחות. במחקרים פרה-קליניים וקליניים, המקור המדווח ביותר לתאי גזע מזנכימליים (MSC) נותר מח עצם 4,5. עם זאת, חסרונות עיקריים לשימוש בתאי גזע שמקורם במח עצם (BMSCs) כוללים את האוכלוסייה הנדירה שלהם, הליכים פו....
כל ההליכים המתוארים במחקר אושרו על ידי ועדת האתיקה של המכון (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) של PGIMER, צ'אנדיגאר. כל הניסויים הקשורים לתרביות תאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי Class II (BSC) בעקבות טכניקה אספטית. מוך השן התקבל משיניים בריאות של שלושה מטופלים (F/14, M/14 ו-M/20) שעברו עקירות טוחנות שלישיות מסיבות אורתודונטיות. לפני איסוף הדגימות, התקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופל/אפוטרופוס בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של PGIMER, Chandigarh.
1. הקמת תרבית ראשונית של תאי גזע ממוך השן (DPSCs) מרקמת שיניים אנושית
הערה: אין להשתמש בשיניים רקובות.
כאן, אנו מתארים כיצד חוקרים יכולים לבסס תרבות טהורה של DPSCs באמצעות שיטת explant 6,7,8,9,10 ולגרום להם לעבר שושלות מרובות כדי לבסס את טוהר התרבות עבור יישומים במורד הזרם.
ביססנו תרבית ראשונ.......
תאי גזע תלו את התקוות לרפא מחלות רבות, בשל הפלסטיות שלהם, חוסנם, תכונותיהם האימונומודולטוריות, המנגנונים הפרקריניים ויעילות הביות שלהם. רקמת מוך השן נחשבת למקור החזק והיקר ביותר של תאי גזע, עם פלסטיות בולטת ויכולת התחדשות. כאן, אנו מדגימים את הבידוד של DPSCs, תוך שימוש בשיטת תרבית explant שאומצה ?.......
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים כספי או לא כספי.
אנו מכירים בתמיכת המימון ל- AK מהמחלקה למחקר בריאות (DHR), ICMR, ממשלת הודו (מענק DHR-NRI # R.12015/01/2022-HR). SR קיבלה מימון מ- ICMR, ממשלת הודו (מענק # 2020-7593 / SCR-BMS) ו- PS קיבלה מלגה מ- CSIR, ממשלת הודו. אנו מודים גם לגב' סנדיה טוקי ולגב' בהופינדר קאור על הסיוע בציטומטריית זרימה, וליבת מכשור מתוחכמת מרכזית (CSIC) ו-PGIMER, צ'אנדיגאר על מתן תמיכה תשתיתית.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 well cell culture plate | Costar | 3516 | For cell culture |
Alcian blue stain | EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia | CCK029 | |
alizarin red S stain | Sigma-Aldrich | TMS-008 | Osteogenic stain |
Antibiotic cocktail | Himedia | A002-5X50ML | To prevent culture contamination |
Ascorbic Acid | Himedia | TC094-25G | Chondrogenic induction |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | For neural induction |
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor) | Gibco | PHG0024 | For neural induction |
CD 105 | BD-Pharmingen | 560839 | |
CD 35 | Biolegend | 343604 | |
CD 45 | Biolegend | 304006 | |
CD 73 | Biolegend | 344016 | |
CD 90 | Biolegend | 328107 | Characterization |
cetyl pyridinium chloride (CPC) | Sigma-Aldrich | 1104006 | For Alizarin Red extraction |
Dexamethasone 21-phosphate disodium | Sigma-Aldrich | D1159-100MG | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Himedia | TS1006-5L | For washing purpose |
EGF (Epidermal Growth Factor) | Gibco | PHG0311 | For hepatic and neural induction |
EVOS LED microscope | Invitrogen | For fluorescence imaging | |
EZ stain Chondrocyte staining kit | Himedia | CCK029-1KT | Chondro stain Kit |
FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | For cell characterization | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | For primary culture |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | For cell culture |
G5 supplement | Gibco | 17503012 | For neural induction |
HGF( Hepatocyte Growth Factor) | Sigma-Aldrich | H1404 | For hepatic Induction |
HLA-DR | Biolegend | 307605 | |
Human TGF-β3 | Peprotech | #100-36E-10U | |
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix | Sigma-Aldrich | I3146 | For hepatic Induction |
ITS premix | Corning | 354350 | |
LDL Uptake Assay kit | Abcam | ab133127 | For hepatic characterization |
Low glucose DMEM | Gibco | 11885-084 | For hepatic induction |
MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M4403 | For neural characterization |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | For neural induction |
Neural Basal Media | Gibco | 21103049 | For neural induction |
NFM antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | For neural characterization |
Nikon Elipse TS100 microscope | Nikon | For fluorescence imaging | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | 01391-250Ml | Adipogenic stain |
Oncostatin M | R&D Systems | 295-OM-010/CF | For hepatic Induction |
Petridish | Tarson | 460090-90MM | For tissue cutting |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 15655-100G | Osteogenic induction |
Propan-2-ol | Thermo Fisher | Q13827 | For Oil Red O extraction |
Sodium pyruvate solution | Sigma life sciences | S8636-100ML | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | For cell passaging |
Whatman filter paper | merck | WHA1001325 | filter paper |
α- Minimum Essential Media (α-MEM) | Sigma-Aldrich | M0643-10X 1L | Media for primary culture |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved