牙髓干细胞的原代培养

摘要

本文提供了逐步指南，以使用外植体培养方法建立牙髓干细胞的原代培养，并根据 ICSCRT 指南对这些细胞进行表征。通过该方案分离的细胞可以被视为间充质干细胞，用于进一步应用。

摘要

人类牙髓代表了一种很有前途的多能干细胞储存库，具有卓越的再生能力，可以从拔出的牙齿中收获。牙髓干细胞 （DPSC） 的神经嵴衍生的外间充质起源赋予了高度的可塑性，这要归功于它在组织修复和再生方面的多方面益处。正在研究收集、维持和增殖成体干细胞的各种实用方法，以用于再生医学。在这项工作中，我们证明了通过外植体培养方法从牙齿组织中建立原代间充质干细胞培养物。分离的细胞呈纺锤形，并粘附在培养板的塑料表面。这些干细胞的表型特征显示国际细胞治疗学会 （ISCT） 推荐的 MSC 细胞表面标志物（如 CD90、CD73 和 CD105）的阳性表达。此外，造血 （CD45） 和内皮标志物 （CD34） 的表达可以忽略不计，而 HLA-DR 标志物的表达低于 2%，证实了 DPSC 培养物的均一性和纯度。我们进一步说明了它们基于分化为成脂、成骨和软骨形成谱系的多能性。我们还通过添加相应的刺激培养基诱导这些细胞分化为肝样和神经元样细胞。这种优化的方案将有助于培养高度可扩增的间充质干细胞群，用于实验室或临床前研究。类似的方案可以纳入临床设置，以实践基于 DPSC 的治疗。

引言

由于其可塑性、旁分泌机制和免疫调节特性，成体干细胞已成为细胞定向治疗和疗法的强大治疗工具 ^1,2,3。基于干细胞的临床前研究的令人鼓舞的数据激发了研究人员致力于从实验室到床边的转化。用于干细胞治疗的干细胞类型在成功结果中起着重要作用。在临床前和临床研究中，间充质干细胞 （MSC） 报道最广泛的来源仍然是骨髓 ^4,5。然而，使用骨髓来源的干细胞 （BMSC） 的主要缺点包括其稀有的群体、高度侵入性的分离程序以及扩增能力有限。因此，正在探索 MSC 的替代来源。在这方面，牙齿组织具有易于获取、巨大的可塑性、高再生潜力和高增殖能力，现在被认为是干细胞丰富且潜在的替代来源 ^6,7,8,9,10。

牙髓干细胞 （DPSC） 是 Gronthos 于 2000 年分....

研究方案

研究中描述的所有程序均已获得昌迪加尔 PGIMER 研究所伦理委员会 （IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72） 的批准。所有与细胞培养相关的实验都需要按照无菌技术在 II 级生物安全柜 （BSC） 中进行。牙髓取自三名因正畸原因接受第三磨牙拔除的患者 （F/14 、 M/14 和 M/20） 的健康牙齿。在样本采集之前，根据昌迪加尔 PGIMER 伦理委员会提供的指南，从患者/监护人那里获得了书面知情同意书。

1. 从人类牙齿组织中建立牙髓干细胞 （DPSC） 的原代培养

注意：不应使用任何蛀牙。

1. 牙髓样本采集并运输至组织培养实验室
   1. 在非创伤和无菌条件下进行拔牙手术。用无菌生理盐水彻底冲洗拔出的牙齿，以去除残留的血液。
   2. 使用碳化物裂隙针将拔出的牙齿纵向切成两块，并用无菌生理盐水不断冲洗以露出牙髓。
   3. 将提取的牙齿与保存在冰上的无菌最低α必需培养基 （α-MEM） 中的完整牙髓一起运输到细胞和组织培养实验室。
      注：理想情况下，处理 2 小时内收到的所有样品以进行细胞培养。然而，最近的一份报告表明，即使在 24 小时后处理牙齿样本也不会影响 DPSC 的活力和增殖，但是，它确实降低了它们的功能²⁹。

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讨论

由于其可塑性、稳健性、免疫调节特性、旁分泌机制和归巢效率，干细胞寄予了治愈许多疾病的希望。牙髓组织被认为是最有效和最有价值的干细胞来源，具有卓越的可塑性和再生能力。在这里，我们展示了利用广泛采用的外植体培养方法分离 DPSC，其中细胞从牙髓组织或外植体中迁移，生长成形态学类似于纺锤形成纤维细胞样细胞的均质细胞培养物。外植体方法产生更均匀的 DPSC 培养物，没有?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G