牙髓干细胞的原代培养

摘要

本文提供了逐步指南，以使用外植体培养方法建立牙髓干细胞的原代培养，并根据 ICSCRT 指南对这些细胞进行表征。通过该方案分离的细胞可以被视为间充质干细胞，用于进一步应用。

摘要

人类牙髓代表了一种很有前途的多能干细胞储存库，具有卓越的再生能力，可以从拔出的牙齿中收获。牙髓干细胞 （DPSC） 的神经嵴衍生的外间充质起源赋予了高度的可塑性，这要归功于它在组织修复和再生方面的多方面益处。正在研究收集、维持和增殖成体干细胞的各种实用方法，以用于再生医学。在这项工作中，我们证明了通过外植体培养方法从牙齿组织中建立原代间充质干细胞培养物。分离的细胞呈纺锤形，并粘附在培养板的塑料表面。这些干细胞的表型特征显示国际细胞治疗学会 （ISCT） 推荐的 MSC 细胞表面标志物（如 CD90、CD73 和 CD105）的阳性表达。此外，造血 （CD45） 和内皮标志物 （CD34） 的表达可以忽略不计，而 HLA-DR 标志物的表达低于 2%，证实了 DPSC 培养物的均一性和纯度。我们进一步说明了它们基于分化为成脂、成骨和软骨形成谱系的多能性。我们还通过添加相应的刺激培养基诱导这些细胞分化为肝样和神经元样细胞。这种优化的方案将有助于培养高度可扩增的间充质干细胞群，用于实验室或临床前研究。类似的方案可以纳入临床设置，以实践基于 DPSC 的治疗。

引言

由于其可塑性、旁分泌机制和免疫调节特性，成体干细胞已成为细胞定向治疗和疗法的强大治疗工具 ^1,2,3。基于干细胞的临床前研究的令人鼓舞的数据激发了研究人员致力于从实验室到床边的转化。用于干细胞治疗的干细胞类型在成功结果中起着重要作用。在临床前和临床研究中，间充质干细胞 （MSC） 报道最广泛的来源仍然是骨髓 ^4,5。然而，使用骨髓来源的干细胞 （BMSC） 的主要缺点包括其稀有的群体、高度侵入性的分离程序以及扩增能力有限。因此，正在探索 MSC 的替代来源。在这方面，牙齿组织具有易于获取、巨大的可塑性、高再生潜力和高增殖能力，现在被认为是干细胞丰富且潜在的替代来源 ^6,7,8,9,10。

牙髓干细胞 （DPSC） 是 Gronthos 于 2000 年分离和表征的第一种牙科干细胞¹¹。DPSC 因其高增殖率、显著的分化潜力、易于获得且培养毫不费力，最重要的是，它们能够从丢弃的牙齿中获得而没有任何道德问题，因此在组织工程应用中引起了人们的关注¹²。DPSC 规避了其他干细胞来源（如 BMSC 和脂肪来源干细胞 （ADSC））在分离和自我更新能力不足方面带来的限制¹³。人类 DPSC 可以从人类乳牙、恒牙、智齿、剥落的乳牙 （SHED） 和根尖中获得。此外，DPSC 也可以从多余牙齿中分离出来，这些牙齿通常被丢弃¹⁴。DPSC 表达神经嵴相关标志物，并有可能在体外和体内分化为神经元细胞 ¹⁵。当给予特定的分化条件时，DPSC 除了具有神经源性潜力外，还可以分化为其他细胞谱系，例如成骨、成软骨、成脂、肝脏和肌成¹³。因此，这些多能细胞在基于细胞的治疗中具有巨大潜力，可用于各种组织的再生。研究还报道了 DPSC 在角膜重建¹⁶、心肌梗塞修复¹⁷ 中的潜在作用，以及它们在肢体缺血¹⁸、阿尔茨海默氏症 ¹⁹、帕金森氏症 ²⁰ 和衰老²¹ 等疾病中的潜在治疗作用。因此，牙组织来源的干细胞不仅可以用于牙齿再生，还可以用于非牙齿器官的修复和再生，如眼睛¹⁶、心脏¹⁷、肝脏²²、骨骼²³ 等。

从牙髓组织中分离 MSC 群体有两种特殊方法 - 酶消化和外植体培养^24,25。这两种方法都报道了原代培养物的成功建立，DPSC 的数量和性质没有任何显着差异²⁶。在这项研究中，我们专注于通过外植体法²⁷ 分离 DPSC，因为与可导致成纤维细胞污染的酶消化相比，这种方法产生的 DPSCs 不会污染造血细胞和内皮细胞²⁸。

研究方案

研究中描述的所有程序均已获得昌迪加尔 PGIMER 研究所伦理委员会 （IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72） 的批准。所有与细胞培养相关的实验都需要按照无菌技术在 II 级生物安全柜 （BSC） 中进行。牙髓取自三名因正畸原因接受第三磨牙拔除的患者 （F/14 、 M/14 和 M/20） 的健康牙齿。在样本采集之前，根据昌迪加尔 PGIMER 伦理委员会提供的指南，从患者/监护人那里获得了书面知情同意书。

1. 从人类牙齿组织中建立牙髓干细胞 （DPSC） 的原代培养

注意：不应使用任何蛀牙。

1. 牙髓样本采集并运输至组织培养实验室
   1. 在非创伤和无菌条件下进行拔牙手术。用无菌生理盐水彻底冲洗拔出的牙齿，以去除残留的血液。
   2. 使用碳化物裂隙针将拔出的牙齿纵向切成两块，并用无菌生理盐水不断冲洗以露出牙髓。
   3. 将提取的牙齿与保存在冰上的无菌最低α必需培养基 （α-MEM） 中的完整牙髓一起运输到细胞和组织培养实验室。
      注：理想情况下，处理 2 小时内收到的所有样品以进行细胞培养。然而，最近的一份报告表明，即使在 24 小时后处理牙齿样本也不会影响 DPSC 的活力和增殖，但是，它确实降低了它们的功能²⁹。

2. 从牙齿中去除牙髓组织和 DPSC 细胞培养物（时间：60-120 分钟）

注意：牙齿运输后的所有步骤均在 2 级生物安全柜内的细胞和组织培养实验室中进行。

1. 将牙齿样品放入无菌培养培养皿中，并用 1x 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液彻底冲洗（三到四次）。
2. 在锋利的挖掘机和镊子的帮助下，小心地从牙髓腔中取出牙髓组织。
3. 去除牙髓后，用无菌 PBS 彻底清洁，以去除任何残留的血液。
4. 在培养皿中借助手术刀片将牙髓组织切成约 2-3 毫米的小块。
   1. 将培养皿的表面积分成四部分，在每个区域加入 1-2 mL 无菌 PBS。用 PBS 将牙髓组织样品放在一个区域，然后用手术刀片将组织切成尽可能小的碎片（碎片越小，干细胞就越容易从组织中迁移出来）。在此之后，用 PBS 将其提升到另一个区域，以此类推直到第四个区域，以便组织块得到适当清洗并且没有任何污染物。
5. 同时，将大约 0.8-1 mL 含有非必需氨基酸和 10% 胎牛血清 （FBS） 和抗生素混合物（即青霉素和链霉素）的 α-MEM 倒入 6 孔板的孔中。通过移动板将培养基均匀分布，使其均匀分布在孔面上。
6. 在镊子的帮助下，将小块牙髓组织或外植体播种到 6 孔板的单个孔（每孔 4 到 6 件）中，并在生物安全罩中保持板不受干扰 5 分钟。
   注意：此步骤允许/帮助组织/外植体粘附到培养板的处理表面。
7. 将培养板保持在温度为 37 °C 且 CO₂ 水平为 5% 的潮湿环境中_。
8. 第二天，小心地从孔中吸出培养基，不要打扰外植体，并向其中添加新鲜培养基。在此步骤中每隔一天更换一次介质以防止干燥。确保培养箱托盘中有足够的水，这样额外的蒸发不会导致板孔中的培养基干涸。
   注意：这是一个非常关键的步骤，干扰会导致外植体从其位置脱落。如果外植体碎片在培养基转移过程中从其位置脱落，请尝试通过完全去除培养基并让它们粘附在孔表面来重新连接它们。应沿孔壁小心添加培养基，不要干扰外植体，否则它们可能会再次分离。在倒置显微镜下定期观察细胞培养板（4 倍或 10 倍放大）。通过粘附在塑料表面的能力及其纺锤形形态来识别 DPSC。
9. 一旦有足够的细胞从外植体中迁移出来，去除组织，让细胞增殖并达到最佳的 70%-75% 细胞汇合度，然后再传代培养。在该步骤中，含有 10% FBS 的 α-MEM 的体积可以增加到 2 mL，以便细胞可以更快地分裂。在此阶段，每三天更换一次媒体。

3. DPSC 扩展

1. 用 PBS （10 mL） 洗涤 DPSCs 的汇合 T75 培养瓶（汇合度：70%-80%）两次。
2. 将 2.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA） 添加到 T75 培养瓶的侧面，然后轻轻旋转，以确保胰蛋白酶-EDTA 覆盖整个细胞片或 DPSC 单层。
3. 将烧瓶放在罩内，在 37 °C 下放置 3-5 分钟。3 分钟后，轻轻敲击培养瓶以确保细胞解离。
4. 加入 5 mL 完全培养基（含 10% FBS 的 α-MEM）或 250 μL FBS（所用胰蛋白酶体积的 10%）作为中和剂，以灭活胰蛋白酶活性。将解离的 DPSCs 的全细胞悬液转移到新鲜的 15 mL 锥形离心管中。
5. 在室温下以 500 x g 离心解离的细胞 2 分钟，以获得细胞沉淀。
6. 用移液管吸出所有上清液，向烧瓶中加入 5-10 mL PBS 以收集残留细胞，用 PBS 轻轻移液洗涤细胞，然后再次以 500 x g 离心细胞 2 分钟。如果需要，请重复。
7. 小心去除上清液并轻轻移液以获得单细胞悬液后，将细胞沉淀重悬于 1 mL 完全培养基（含 10% FBS 的 α-MEM）中。
8. 将细胞分开并接种（等体积）到两个 T75 培养瓶中，每个培养瓶含有 10 mL 完全培养基。将烧瓶放在 37 °C 的通风橱内。
9. 第二天，吸出培养基并将其更换为新鲜的完整培养基。
   注：延长胰蛋白酶处理时间会裂解细胞表面蛋白和细胞外基质蛋白，从而损害细胞完整性、活力和细胞功能。

4. 干细胞表型标志物的鉴定（时间：90 - 120 min）

注：为了表征从牙髓组织中收获的细胞，请使用第 3 代和第 5 代之间的细胞。

1. 使用两个 70%-80%（~3-4 x 10⁶ 个细胞;使用基于图像的细胞计数器或血细胞计数器对细胞进行计数）汇合的 DPSC T75 培养瓶，并用 10 mL PBS 洗涤细胞两次。
2. 加入 2.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，并将培养瓶在通风橱内于 37 °C 保持 3-5 分钟。加入 5 mL 完全培养基或 250 μL FBS（所用胰蛋白酶体积的 10%）作为中和剂，以灭活胰蛋白酶活性。
3. 使用移液管在 15 mL 锥形离心管中收集细胞。在室温下以 500 x g 离心解离的细胞 2 分钟，以获得细胞沉淀。
4. 用移液管吸出所有上清液，向烧瓶中加入 5 mL PBS 以收集残留细胞，用 PBS 轻轻移液洗涤细胞，然后再次以 500 x g 离心细胞 2 分钟。
5. 小心去除上清液后，将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并轻轻移液以获得单细胞悬液。
6. 根据可用性，使用基于图像的细胞计数器或血细胞计数器对细胞进行计数，并以 1 x 10⁴ 个细胞/管的比例将它们分布在微量离心管中。将细胞在 0.5%-1% 牛血清白蛋白 （BSA） 中孵育 0.5-1 小时。
7. 向每个试管中加入 1-2 μL 异硫氰酸荧光素 （FITC） 和藻红蛋白 （PE） 偶联抗体，用于分化簇 （CD） 标志物（即 CD90 [0.4 μg]、CD73 [0.8 μg]、CD105 [0.4 μg]、CD34 [0.8 μg]、CD45 [0.4 μg] 和 HLA-DR [0.08 μg]）6,7,8,9，并在室温下避光孵育 0.5 小时。
8. 0.5 小时后，以 500 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸出上清液，用 PBS 洗涤细胞沉淀，然后再次离心。
9. 离心后，将沉淀重悬于 PBS（200 μL/管）中，将细胞悬液转移到流式细胞术管中，并使用流式细胞仪采集。任何商业软件都可用于进一步分析各种抗体的阳性细胞百分比。
   注意：步骤 4.7 至 4.9 应在室温下避光进行。应使用适当的同种型对照和未染色的样品来忽略细胞的背景荧光。

5. DPSC 分化为多个谱系

注意：在第 3 至第 5 次传代时使用 75%-80% 的 DPSC 汇合培养物来评估多能性。含有 α-MEM 的对照细胞组应用于下面描述的所有类型的分化。

1. DPSCs 的成骨分化、茜素红染色和定量
   1. 如上文步骤 4.2 所述，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 制备单细胞悬液，并将细胞沉淀重悬于完整的 α-MEM 中。
   2. 计数细胞并将它们以 2 x 10⁴ 个细胞/孔的细胞密度接种在 24 孔组织培养处理的板中，含有 0.4-0.5 mL 完全培养基，在 37 °C 和 5% CO₂ 下持续 48 小时。
   3. 48 小时后，从孔中取出培养基并加入 0.4-0.5 mL 成骨诱导培养基（即具有成骨诱导因子的 α-MEM，如 β 甘油磷酸酯 [5 mM]、磷酸二氢钾 [1.8 mM] 和地塞米松磷酸二钠 [0.01 mM]）⁸。制备仅含有完全 α-MEM，不含任何成骨诱导因子（对照培养基）的对照孔（未诱导细胞）。
      注意：据报道，添加 50 μM 抗坏血酸可增强成骨分化 ^30,31。每三天后，用新鲜培养基和培养物更换诱导培养基和对照培养基 21 天（3 周）。在诱导期结束时，从培养板中取出培养基，加入 0.5 mL PBS，并洗涤两次。
   4. PBS 洗涤后，在室温下将细胞固定在 0.5 mL 的 10% 中性缓冲福尔马林 （NBF） 溶液中 20-30 分钟。在通风/化学罩中进行固定。
2. 茜素红染色
   1. 通过将 1 g 茜素红 S 溶解在 50 mL 双蒸水 （ddH₂O） 中，并在盐酸 （HCL） 或氢氧化铵 （NH₄OH） 的帮助下将 pH 值调节至 4.0-4.2，制备茜素红 S 染色 （2%）。用滤纸过滤污渍。将污渍存放在黑暗中 （4 °C）。
   2. 用双蒸水 （ddH₂O） 洗涤细胞两次，加入茜素红 S 染色，并在室温下孵育 30-45 分钟。
   3. 从所有孔中去除污渍，并用 ddH₂O 洗涤细胞四到五次，以去除任何未结合的污渍。使用明场显微镜捕获图像。
3. 用于定量分析的茜素红染色萃取
   1. 向染色孔 （0.4 mL/孔） 中加入十六烷基吡啶氯化铵 （CPC） 缓冲液 （pH 7.0），并在 37 °C 下孵育细胞 2 小时。 此外，细胞也可以与 10% 乙酸一起孵育，以适当溶解茜素红晶体³²。将板放在板摇杆或摇床上。
   2. 孵育后，收集上清液（提取的染料），将其转移到 96 孔板中，并在 405 nm 处读取板或样品。要获得空白值，请仅添加 CPC （相同体积）缓冲区并读取 ^32,33 。

6. DPSCs 的成脂分化、油红 O 染色和定量

注意：接种的初始步骤与上述相同（即成骨分化步骤 5.1）。

1. 48 小时后，从孔中取出培养基，加入 0.4-0.5 mL 的成脂诱导培养基（即具有成脂诱导因子的 α-MEM，如异丁基甲基黄嘌呤 [IBMX;0.5 mM]、地塞米松 [1 μM]、吲哚美辛 [200 μM] 和胰岛素 [10 μM]）⁸。准备含有未诱导细胞的对照孔（即，仅在 α-MEM 中培养，无诱导因子 {对照培养基]）。
2. 每三天补充一次培养基，并将细胞培养 3 周。3 周后，从培养板中吸出培养基，加入 0.5 mL PBS 洗涤细胞两次。
3. PBS 洗涤后，在室温下将细胞在 10% NBF 溶液中固定 20-30 分钟。
4. 用双蒸水 （ddH₂O） 洗涤细胞两次，加入油红 O 染色剂，并在室温下孵育 30-40 分钟。
5. 去除所有孔中的污渍，并用 ddH₂O 反复冲洗含有细胞的孔，直至澄清（两到四次）。在显微镜下观察并捕获图像。
6. 用于定量分析的油红 O 萃取
   1. 向染色孔中加入 0.4 mL 100% 2-丙醇，并在室温下适当覆盖板 30 分钟孵育。将板放在板摇杆或摇床上。
   2. 孵育后，收集上清液，将其转移到 96 孔板中，在 510 nm 处读取板或样品。使用 100% 2-丙醇进行冲裁。

7. DPSCs 的软骨形成分化、阿尔新蓝染色和定量

注：在 DPSC 的单层培养中诱导软骨形成分化。接种的初始步骤与上述相同（即，成骨分化步骤 5.1）。

1. 48 小时后，从孔中取出培养基，加入 0.4-0.5 mL 软骨形成诱导培养基（即具有软骨形成分化特异性诱导因子的 α-MEM）、抗坏血酸 [0.2 M]、丙酮酸钠 [1 mM]、转化生长因子-β 3 [TGF-β₃;10 μM]、地塞米松 [1 mM] 和 1x ITS 预混料 [胰岛素、转铁蛋白和硒酸]¹⁰。准备含有未诱导细胞的对照孔（即，仅在 α-MEM 中培养，无诱导因子 [对照培养基]）。
2. 每三天补充一次培养基，并将细胞培养 3 周。诱导期结束后，从培养板中吸出培养基并加入 0.5 mL PBS 洗涤细胞两次。
3. PBS 洗涤后，在室温下将细胞在 10% NBF 溶液中固定 15-20 分钟。用双蒸水 （ddH₂O） 洗涤细胞 2 或 3 次，加入阿尔新蓝染色剂，并在室温下孵育 45 分钟。
4. 去除所有孔中的污渍，然后用 0.1 N HCL 冲洗两到三次。洗涤细胞四次或用 ddH₂O 孵育几次。
5. 在显微镜下观察细胞中的蛋白聚糖（蓝色）并捕获图像。
6. 对于阿尔新蓝定量，使用 6 M 盐酸胍提取染料，并以 595 nm 的光密度 （OD） 读取样品。本研究中使用的 Alcian 蓝色试剂盒可对软骨中的酸性蛋白聚糖进行染色，并特异性结合软骨细胞基质中存在的硫酸化糖胺聚糖 （GAG）¹⁰。

8. DPSCs 向肝样谱系的分化和特征

1. 如上所述，通过胰蛋白酶处理制备细胞的单细胞悬液，并将细胞沉淀重悬于完整的 α-MEM 中。
2. 计数细胞，并以 2 x 10⁴ 个细胞/孔的 24 孔处理的培养板中接种，含有 0.4-0.5 mL 完全培养基 48 小时。
3. 48 小时后，从孔中取出培养基，并将细胞与肝诱导培养基孵育 14 天。诱导培养基由低葡萄糖 Dulbecco 改良 eagle 培养基 （DMEM） 组成，其中含有地塞米松 （0.5 μM）、表皮生长因子 （EGF;2 ng/mL）、ITS+ 预混料 （50 mg/mL） 和肝细胞生长因子 （HGF;20 ng/mL） ⁶。
4. 14 天后，用成熟培养基再更换培养基 14 天（α-MEM 补充有抑瘤素 M [OSM;20 ng/mL]、ITS 预混料 [50 mg/mL] 和地塞米松 [0.5 μM]） ⁶。每三天后用新鲜介质补充介质。
5. 进行免疫组化分析和低密度脂蛋白 （LDL） 测定，以确认肝样分化。
   1. LDL 受体的 LDL 摄取和免疫荧光染色
      注意：根据试剂盒说明，通过 LDL 摄取测定试剂盒表征分化后的肝细胞样细胞。LDL-550 荧光染料用于评估活状态下分化细胞中 LDL 的摄取，LDL 受体抗体用于检测固定后分化细胞中的 LDL 受体。
      1. 分化后，用 LDL-550 （1：100） 对活细胞染色 3-4 小时。3-4 小时后，用培养基替换染色溶液，并在能够分别在 537 和 617 nm 处获得碘化丙啶 （PI） 激发和发射波长的荧光显微镜下观察 LDL 摄取。
      2. 将细胞固定在固定液中 10 分钟。细胞固定后，将细胞封闭在封闭溶液中 30 分钟。
      3. 将细胞与一抗 LDL 受体抗体孵育 1 小时，用 1x PBS 洗涤 3 次，然后与 488 二抗 （1：100） 在黑暗中孵育 1 小时。
      4. 用 PBS 洗涤细胞 3 次以去除多余的二抗。加入 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 作为核染色剂。
      5. 在荧光显微镜下观察细胞。使用能够测量 DAPI、PI 和 FITC 激发/发射范围内波长的荧光显微镜拍摄图像。
         注：可以记录单细胞强度参数以量化 LDL 受体抗体表达和 LDL 摄取。免疫荧光染色应使用适当的二抗对照，以忽略仅由二抗产生的背景荧光。

9. DPSCs 向神经元样谱系的神经分化和表征

1. 如上所述，细胞接种后，在 α-MEM 中培养细胞 48 小时。
2. 吸出培养基，并用含有生长因子的神经基础培养基替换，例如 0.5% G5 补充剂、0.2% N2 补充剂、20 ng/mL 表皮生长因子、20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子和 B27 补充剂 （1%）。在该培养基中培养细胞 25-41 天⁷.
3. 每隔两天或第三天更换一次培养基，具体取决于其细胞的新陈代谢。为了获得有效的神经元成熟和更多的微管相关蛋白 2 （MAP-2+） 神经元，在神经元诱导阶段（14 天）后去除 EGF 和成纤维细胞生长因子 2 （FGF2）。
   注意：随着时间的推移和反复更换培养基后，由于粘附性低，分化的神经元可能会表现出与板孔的分离，从而导致长期培养中的神经元丢失。为避免这种情况，请在板孔中涂上层粘连蛋白或纤连蛋白（可选）。
4. 进行免疫组织化学分析以确认神经元样分化。
   1. 分化 DPSC 的免疫染色
      注：为了确认 DPSC 的神经元样分化，使用 MAP-2 和神经丝 （NFM） 抗体在分化的细胞中进行免疫细胞化学，它们是神经源性谱系特异性蛋白⁷。
      1. 分化完成后去除培养基。加入 PBS，轻轻旋转板，然后用移液管去除 PBS。重复该步骤。
      2. 在室温下使用 10% NBF 或 4% 多聚甲醛固定细胞 20-30 分钟。
      3. 取出固定剂，用 1x PBS 洗涤细胞 2 或 3 次。加入透化溶液 （Triton-X-100;0.1%） 并孵育细胞 5 分钟。
      4. 进行 PBS 洗涤 2 或 3 次，并用 0.5%-1% 封闭剂 （BSA） 在 37 °C 下封闭细胞 1 小时或在 4 °C 下过夜。 去除封闭剂并用 1x PBS 洗涤细胞。
      5. 用一抗（在 0.1% BSA、NFM [1：50] 和 MAP-2 [1：200] 中制备）孵育细胞过夜。
      6. 去除一抗，用 1x PBS 洗涤细胞 3 或 4 次，以去除未结合的抗体。
      7. 加入二抗（兔抗小鼠 1：2,000），并在室温下在黑暗中孵育细胞 1.5-2 小时。用 PBS 洗涤细胞（2 或 3 次）。
      8. 将细胞在 DAPI 中孵育 10 分钟，然后再次用 PBS 洗涤。保持残留体积以避免样品干燥。在荧光显微镜下观察。
         注：此外，还可以进行核型稳定性¹⁰ 和衰老表征，以更好地了解细胞的纯度和功能。

结果

在这里，我们描述了研究人员如何通过外植体方法 6,7,8,9,10 建立 DPSC 的纯培养物，并诱导它们走向多个谱系，以确定用于下游应用的培养物纯度。

我们从患者第三磨牙提取的牙髓小组织中建立了 DPSCs 的原代培养物，如图 1A ?...

讨论

由于其可塑性、稳健性、免疫调节特性、旁分泌机制和归巢效率，干细胞寄予了治愈许多疾病的希望。牙髓组织被认为是最有效和最有价值的干细胞来源，具有卓越的可塑性和再生能力。在这里，我们展示了利用广泛采用的外植体培养方法分离 DPSC，其中细胞从牙髓组织或外植体中迁移，生长成形态学类似于纺锤形成纤维细胞样细胞的均质细胞培养物。外植体方法产生更均匀的 DPSC 培养物，没有?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G