Cultura Primária de Células-Tronco da Polpa Dentária

Resumo

Este artigo fornece um guia passo a passo para estabelecer uma cultura primária de células-tronco de polpa dentária usando o método de cultura de explante e caracterização dessas células com base nas diretrizes do ICSCRT. As células isoladas por este protocolo podem ser consideradas como células-tronco mesenquimais para futuras aplicações.

Resumo

A polpa dentária humana representa um reservatório promissor de células-tronco multipotentes com competência regenerativa preeminente que pode ser colhido de um dente extraído. A origem ecto-mesenquimal derivada da crista neural das células-tronco da polpa dentária (DPSCs) confere um alto grau de plasticidade que se deve aos seus benefícios multifacetados no reparo e regeneração de tecidos. Existem várias maneiras práticas de coletar, manter e proliferar células-tronco adultas sendo investigadas para seu uso na medicina regenerativa. Neste trabalho, demonstramos o estabelecimento de uma cultura primária de células-tronco mesenquimais a partir de tecido dentário pelo método de cultura de explante. As células isoladas foram fusiformes e aderidas à superfície plástica da placa de cultura. A caracterização fenotípica dessas células-tronco mostrou expressão positiva de marcadores de superfície celular recomendados pela sociedade internacional de terapia celular (ISCT) para MSC, como CD90, CD73 e CD105. Além disso, a expressão insignificante de marcadores hematopoiéticos (CD45) e endoteliais (CD34) e menos de 2% de expressão de marcadores HLA-DR confirmaram a homogeneidade e pureza das culturas de DPSC. Ilustramos ainda sua multipotência com base na diferenciação para linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. Também induzimos essas células a se diferenciarem em células hepáticas e neuronais, adicionando meios de estimulação correspondentes. Este protocolo otimizado ajudará no cultivo de uma população altamente expansível de células-tronco mesenquimais para serem utilizadas em laboratório ou para estudos pré-clínicos. Protocolos semelhantes podem ser incorporados em configurações clínicas para a prática de tratamentos baseados em DPSC.

Introdução

As células-tronco adultas tornaram-se uma poderosa ferramenta terapêutica para tratamentos e terapias direcionadas a células devido à sua plasticidade, mecanismos parácrinos e propriedades imunomoduladoras ^1,2,3. Os dados encorajadores de estudos pré-clínicos baseados em células-tronco inspiraram os pesquisadores a trabalhar pela tradução da bancada para a beira do leito. O tipo de células-tronco usadas para terapia com células-tronco desempenha um papel significativo nos resultados bem-sucedidos. Em estudos pré-clínicos e clínicos, a fonte mais amplamente relatada de células-tronco mesenquimais (CTMs) continua sendo a medula óssea ^4,5. No entanto, as principais desvantagens do uso de células-tronco derivadas da medula óssea (BMSCs) incluem sua população rara, procedimentos altamente invasivos para isolamento e sua capacidade limitada de expansão. Portanto, fontes alternativas de MSCs estão sendo exploradas. Nesse sentido, os tecidos dentários, com sua facilidade de acessibilidade, enorme plasticidade, alto potencial regenerativo e alta capacidade proliferativa, passaram a ser considerados uma fonte alternativa rica e potencial de células-tronco 6,7,8,9,10.

As células-tronco da polpa dentária (CPEP) foram o primeiro tipo de células-tronco dentárias a serem isoladas e caracterizadas por Gronthos em 2000¹¹. As DPSCs chamaram a atenção para aplicações de engenharia de tecidos devido à sua alta taxa de proliferação, potencial de diferenciação significativo, facilidade de acessibilidade com cultura sem esforço e, o mais importante, sua capacidade de serem obtidas de um dente descartado sem qualquer preocupação ética¹². As limitações impostas por outras fontes de células-tronco, como BMSCs e células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs), em seu isolamento e capacidades inadequadas de autorrenovação são contornadas pelas DPSCs¹³. As DPSCs humanas podem ser obtidas a partir de dentes decíduos humanos, dentes permanentes, dentes do siso, dentes decíduos esfoliados (SHEDs) e papilas apicais. Além disso, as CPDP também podem ser isoladas de dentes supranumerários, que geralmente são descartados¹⁴. As DPSCs expressam marcadores associados à crista neural e têm o potencial de se diferenciar em células neuronais tanto in vitro quanto in vivo¹⁵. Além de seu potencial neurogênico, as DPSCs podem se diferenciar em outras linhagens celulares, como osteogênica, condrogênica, adipogênica, hepática e miogênica, quando submetidas a condições específicas^{de diferenciação 13}. Assim, essas células multipotentes possuem grande potencial para terapia baseada em células e podem ser empregadas para a regeneração de vários tecidos. Estudos também relataram o potencial papel das CPDP na reconstrução da^córnea16, reparo do infarto do miocárdio17, e seu potencial papel terapêutico em doenças como isquemia de^membro18, ^Alzheimer19, ^Parkinson20 e^{envelhecimento21}. Portanto, as células-tronco derivadas do tecido dentário podem ser usadas não apenas para a regeneração dentária, mas também para o reparo e regeneração de órgãos não dentários, como olhos¹⁶, corações¹⁷, fígados²², ossos²³ etc.

Existem dois métodos específicos para o isolamento de uma população de MSC do tecido pulpar - digestão enzimática e cultura de explante^24,25. O estabelecimento bem-sucedido de culturas primárias sem qualquer diferença significativa na quantidade e propriedades das DPSCs foi relatado por ambos os métodos²⁶. Neste estudo, focamos no isolamento de DPSCs pelo método do explante²⁷, uma vez que esse método gera DPSCs sem contaminação das células hematopoiéticas e endoteliais, em comparação com a digestão enzimática que pode resultar em contaminação por fibroblastos²⁸.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos no estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) do PGIMER, Chandigarh. Todas as experiências relacionadas com a cultura de células devem ser realizadas numa cabina de segurança biológica (BSC) de classe II, seguindo uma técnica asséptica. A polpa dentária foi obtida de dentes saudáveis de três pacientes (F/14, M/14 e M/20) submetidos a extrações de terceiros molares por razões ortodônticas. Antes da coleta da amostra, o consentimento informado por escrito foi obtido do paciente/responsável de acordo com as diretrizes fornecidas pelo comitê de ética do PGIMER, Chandigarh.

1. Estabelecimento de cultura primária de células-tronco da polpa dentária (DPSCs) de tecido dentário humano

NOTA: Quaisquer dentes cariados não devem ser usados.

1. Coleta de amostras de polpa dentária e transporte para o laboratório de cultura de tecidos
   1. Realize um procedimento de extração dentária em condições não traumáticas e assépticas. Enxágue bem o dente extraído com uma solução salina estéril para remover restos de sangue.
   2. Corte o dente extraído longitudinalmente em duas partes usando uma broca de fissura de metal duro com irrigação constante com solução salina normal estéril para expor a polpa.
   3. Transporte o dente extraído junto com a polpa intacta em meio estéril α essencial mínimo (α-MEM) mantido em gelo para o laboratório de cultura de células e tecidos.
      NOTA: Idealmente, processe todas as amostras recebidas dentro de 2 h para cultura de células. No entanto, um relatório recente sugeriu que o processamento da amostra de dente mesmo após 24 h não afetou a viabilidade e proliferação de DPSCs, no entanto, reduziu sua funcionalidade²⁹.

2. Remoção de tecido pulpar do dente e cultura celular de DPSCs (tempo: 60-120 min)

NOTA: Todas as etapas após o transporte do dente foram realizadas no laboratório de cultura de células e tecidos dentro de um gabinete de biossegurança nível 2.

1. Coloque a amostra do dente em placas de Petri de cultura estéril e enxágue abundantemente (três ou quatro vezes) com 1x solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
2. Remova cuidadosamente o tecido pulpar da cavidade pulpar com a ajuda de uma escavadeira afiada e pinça.
3. Depois que a polpa for removida, limpe-a completamente com PBS estéril para remover quaisquer restos de sangue.
4. Corte o tecido pulpar em pequenos pedaços de aproximadamente 2-3 mm com a ajuda de uma lâmina cirúrgica em uma placa de Petri.
   1. Divida a área de superfície do prato em quatro partes, colocando 1-2 mL de PBS estéril em cada área. Coloque a amostra de tecido pulpar em uma área com PBS e corte o tecido nos menores pedaços possíveis com uma lâmina cirúrgica (quanto menor o pedaço, mais fácil será para as células-tronco migrarem para fora do tecido). Depois disso, transfira cada peça levantando-a para outra área com PBS, e assim por diante até a quarta área, para que as peças de tecido sejam devidamente lavadas e livres de quaisquer contaminantes.
5. Enquanto isso, despeje aproximadamente 0,8-1 mL de α-MEM contendo aminoácidos não essenciais com 10% de soro fetal bovino (FBS) e um coquetel de antibióticos (ou seja, penicilina e estreptomicina) nos poços de uma placa de 6 poços. Distribua a mídia uniformemente movendo a placa, de modo a espalhá-la uniformemente na superfície do poço.
6. Semeie os pequenos pedaços de tecido pulpar ou explantes com a ajuda de uma pinça em um único poço (quatro a seis pedaços por poço) da placa de 6 poços e mantenha a placa intacta por 5 min em uma capa de biossegurança.
   NOTA: Esta etapa permite/auxilia na aderência do tecido/explante às superfícies tratadas das placas de cultura.
7. Mantenha a placa de cultura em uma atmosfera umidificada com temperatura de 37 ° C e nível de CO₅ % 2_.
8. No dia seguinte, aspire cuidadosamente o meio dos poços sem perturbar os explantes e adicione um novo meio a ele. Troque a mídia a cada dois dias nesta etapa para evitar a secagem. Certifique-se de que a incubadora tenha água suficiente na bandeja para que a evaporação extra não faça com que o meio nos poços da placa seque.
   NOTA: Este é um passo muito crucial, e a perturbação pode fazer com que os explantes se desloquem de sua posição. Se as peças do explante forem desalojadas de sua posição durante a transferência do meio, tente recolocá-las removendo completamente o meio e deixando-os aderir à superfície do poço. O meio deve ser cuidadosamente adicionado ao longo da parede do poço sem perturbar os explantes, caso contrário, eles podem se soltar novamente. Observe as placas de cultura de células regularmente sob um microscópio invertido (ampliação de 4x ou 10x). Identifique as DPSCs por sua capacidade de aderir à superfície plástica e sua morfologia fusiforme.
9. Uma vez que células suficientes migrem dos explantes, remova os tecidos e permita que as células proliferem e atinjam a confluência celular ideal de 70% a 75% antes da subcultura. O volume de α-MEM contendo 10% de FBS pode ser aumentado para 2 mL nesta etapa para que as células possam se dividir mais rapidamente. Mude a mídia a cada três dias nesta fase.

3. Expansão DPSC

1. Lave o frasco de cultura T75 confluente (confluência: 70%-80%) de DPSCs duas vezes com PBS (10 mL).
2. Adicione 2,5 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% na lateral do frasco T75 e agite-o suavemente para garantir que a tripsina-EDTA cubra toda a folha celular ou monocamada de DPSCs.
3. Manter o balão no interior do exaustor a 37 °C durante 3-5 min. Após 3 min, bata suavemente no frasco para garantir a dissociação das células.
4. Adicione 5 mL de meio completo (α-MEM com 10% de FBS) ou 250 μL de FBS (10% do volume de tripsina usado) como agente neutralizante para inativar a atividade da tripsina. Transferir toda a suspensão celular das DPSCs dissociadas para um novo tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
5. Centrifugue as células dissociadas a 500 x g por 2 min em temperatura ambiente para obter o pellet de célula.
6. Aspire todo o sobrenadante usando a pipeta, adicione 5-10 mL de PBS ao frasco para coletar as células remanescentes, lave a célula em PBS com pipetagem suave e centrifugue as células novamente a 500 x g por 2 min. Repita se necessário.
7. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio completo (α-MEM com 10% de FBS) após remover cuidadosamente o sobrenadante e realizar uma pipetagem suave para obter uma suspensão de célula única.
8. Divida as células e semeie-as (volume igual) em dois frascos de cultura T75, cada um contendo 10 mL de meio completo completo. Manter o balão no interior do exaustor a 37 °C.
9. No dia seguinte, aspire a mídia e substitua-a pela mídia completa nova.
   NOTA: Prolongar o tratamento com tripsina pode comprometer a integridade celular, a viabilidade e a função celular, clivando a proteína da superfície celular e a proteína da matriz extracelular.

4. Identificação de marcadores fenotípicos de células-tronco (tempo: 90 - 120 min)

NOTA: Para a caracterização das células colhidas do tecido pulpar, utilizar células entre a terceira e a quinta passagem.

1. Use dois frascos de cultura T75 confluentes de 70% -80% (~ 3-4 x 10⁶ células; conte as células usando um citômetro ou hemocitômetro baseado em imagem) frascos de cultura T75 confluentes de DPSCs e lave as células duas vezes com 10 mL de PBS.
2. Adicione 2,5 ml de tripsina-EDTA a 0,25% e mantenha o frasco dentro do exaustor a 37 °C durante 3-5 min. Adicione 5 mL de meio completo ou 250 μL de FBS (10% do volume de tripsina usado) como agente neutralizante para inativar a atividade da tripsina.
3. Colete as células usando uma pipeta em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Centrifugue as células dissociadas a 500 x g por 2 min em temperatura ambiente para obter o pellet de célula.
4. Aspire todo o sobrenadante usando a pipeta, adicione 5 mL de PBS ao frasco para coletar as células remanescentes, lave a célula em PBS com pipetagem suave e centrifugue as células novamente a 500 x g por 2 min.
5. Ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS após remover cuidadosamente o sobrenadante e execute uma pipetagem suave para obter uma suspensão de célula única.
6. Conte as células usando um citômetro ou hemocitômetro baseado em imagem, dependendo da disponibilidade, e distribua-as em tubos de microcentrífuga a 1 x 10⁴ células / tubo. Incube as células em 0,5%-1% de albumina de soro bovino (BSA) por 0,5-1 h.
7. A cada tubo, adicione 1-2 μL de anticorpos conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e ficoeritrina (PE) para marcadores de agrupamento de diferenciação (CD) (ou seja, CD90 [0,4 μg], CD73 [0,8 μg], CD105 [0,4 μg], CD34 [0,8 μg], CD45 [0,4 μg] e HLA-DR [0,08 μg])6,7,8,9 e incube por 0,5 h no escuro à temperatura ambiente.
8. Após 0,5 h, desça as células centrifugando a 500 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante, lavar o pellet de células com PBS e centrifugar novamente.
9. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em PBS (200 μL / tubo), transfira a suspensão celular para tubos de citometria de fluxo e adquira-os usando um citômetro de fluxo. Qualquer software comercial pode ser usado para analisar ainda mais a porcentagem de células positivas para vários anticorpos.
   NOTA: As etapas 4.7 a 4.9 devem ser executadas no escuro à temperatura ambiente. Controles de isotipo adequados e amostras não coradas devem ser usados para omitir a fluorescência de fundo das células.

5. Diferenciação de DPSC em múltiplas linhagens

NOTA: Use culturas confluentes de 75% a 80% de DPSCs na terceira a quinta passagem para a avaliação da multipotência. Deve ser utilizado um grupo de células de controlo contendo α-MEM para todos os tipos de diferenciações a seguir descritos.

1. Diferenciação osteogênica de DPSCs, coloração com vermelho de alizarina e quantificação
   1. Faça uma suspensão de célula única usando 0,25% de tripsina-EDTA, conforme descrito acima na etapa 4.2, e ressuspenda o pellet celular em α-MEM completo.
   2. Conte as células e semeie-as em placas tratadas com cultura de tecidos de 24 poços a uma densidade de células de 2 x 10⁴ células/poço contendo 0,4-0,5 mL de meio completo por 48 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
   3. Após 48 h, remova o meio dos poços e adicione 0,4-0,5 mL de meio indutivo osteogênico (ou seja, α-MEM com fatores indutivos osteogênicos, como beta glicerofosfato [5 mM], fosfato monopotássico [1,8 mM] e fosfato dissódico de dexametasona [0,01 mM])⁸. Preparar alvéolos de controlo (células não induzidas) contendo apenas α-MEM completo, sem quaisquer factores indutivos osteogénicos (meios de controlo).
      NOTA: A adição de ascorbato de 50 μM também é relatada para aumentar a diferenciação osteogênica ^30,31. A cada três dias, substitua o meio de indução e o meio de controle por meio e cultura novos por 21 dias (3 semanas). No final do período de indução, remova o meio das placas de cultura, adicione 0,5 mL de PBS e lave duas vezes.
   4. Após a lavagem do PBS, fixe as células em 0,5 mL de solução de formalina tamponada neutra a 10% (NBF) por 20-30 min em temperatura ambiente. Realize a fixação em uma capela de exaustão/química.
2. Coloração com vermelho de alizarina
   1. Prepare a coloração S com vermelho de alizarina (2%) dissolvendo 1 g de S com vermelho de alizarina em 50 mL de água bidestilada (ddH₂O) e ajustando o pH para 4,0-4,2 com a ajuda de ácido clorídrico (HCL) ou hidróxido de amônio (NH₄OH). Filtre a mancha com papel de filtro. Conservar a mancha no escuro (4 °C).
   2. Lave as células duas vezes com água bidestilada (ddH₂O), adicione a coloração S vermelha de alizarina e incube em temperatura ambiente por 30-45 min.
   3. Remova a mancha de todos os poços e lave as células quatro ou cinco vezes com ddH₂O para remover qualquer mancha não ligada. Capture as imagens usando um microscópio de campo claro.
3. Extração de corante vermelho de alizarina para análise quantitativa
   1. Adicione tampão de cloreto de cetilpiridínio (CPC) (pH 7,0) aos poços corados (0,4 mL / poço) e incube as células por 2 h a 37 ° C. Além disso, as células também podem ser incubadas com ácido acético a 10% para a dissolução adequada dos cristais vermelhos de alizarina³². Mantenha as placas em um balancim ou agitador de placas.
   2. Após a incubação, colete o sobrenadante (corante extraído), transfira-o para uma placa de 96 poços e leia a placa ou amostras a 405 nm. Para obter um valor em branco, adicione apenas o buffer CPC (mesmo volume) e leia ^32,33 .

6. Diferenciação adipogênica de DPSCs, coloração de O vermelho de óleo e quantificação

NOTA: As etapas iniciais da semeadura são as mesmas acima (ou seja, etapa de diferenciação osteogênica 5.1).

1. Após 48 h, remova o meio dos poços e adicione 0,4-0,5 mL de meio indutivo adipogênico (ou seja, α-MEM com fatores indutivos adipogênicos, como isobutil-metilxantina [IBMX; 0,5 mM], dexametasona [1 μM], indometacina [200 μM] e insulina [10 μM])⁸. Preparar alvéolos de controlo contendo células não induzidas (isto é, cultivadas apenas em α-MEM, sem factores indutivos (meios de controlo).
2. Reabasteça a mídia a cada três dias e cultive as células por 3 semanas. Após 3 semanas, aspire o meio das placas de cultura e adicione 0,5 mL de PBS para lavar as células duas vezes.
3. Após a lavagem do PBS, fixe as células em solução de NBF a 10% por 20-30 min em temperatura ambiente.
4. Lave as células duas vezes com água bidestilada (ddH₂O), adicione o óleo vermelho O e incube em temperatura ambiente por 30-40 min.
5. Remova a mancha de todos os poços e enxágue os poços contendo células repetidamente com ddH₂O até que estejam limpos (duas a quatro vezes). Observe ao microscópio e capture imagens.
6. Extração de óleo vermelho O para análise quantitativa
   1. Adicione 0,4 mL de 2-propanol 100% aos poços corados e incube em temperatura ambiente, cobrindo adequadamente a placa por 30 min. Mantenha a placa em um balancim ou agitador de placas.
   2. Após a incubação, recolher o sobrenadante, transferi-lo para uma placa de 96 poços, ler a placa ou as amostras a 510 nm. Use 100% de 2-propanol para apagamento.

7. Diferenciação condrogênica de DPSCs, coloração com azul de Alcian e quantificação

NOTA: A diferenciação condrogênica foi induzida na cultura em monocamada de DPSCs. As etapas iniciais da semeadura são as mesmas acima (ou seja, etapa de diferenciação osteogênica 5.1).

1. Após 48 h, remover o meio dos poços e adicionar 0,4-0,5 mL de meio de indução condrogênica (ou seja, α-MEM com fatores indutivos específicos para diferenciação condrogênica, ácido ascórbico [0,2 M], piruvato de sódio [1 mM], fator de crescimento transformador-beta 3 [TGF-β₃; 10 μM], dexametasona [1 mM] e 1x pré-mistura de ITS [insulina, transferrina e ácido selênico)¹⁰. Preparar alvéolos de controlo contendo células não induzidas (isto é, cultivadas apenas em α-MEM, sem fatores indutivos [meios de controlo]).
2. Reabasteça a mídia a cada três dias e cultive as células por 3 semanas. Após o término do período de indução, aspirar o meio das placas de cultura e adicionar 0,5 mL de PBS para lavar as células duas vezes.
3. Após a lavagem do PBS, fixe as células em solução de NBF a 10% por 15-20 min em temperatura ambiente. Lave as células duas ou três vezes com água bidestilada (ddH₂O), adicione a coloração azul de Alcian e incube em temperatura ambiente por 45 min.
4. Remova a mancha de todos os poços, seguido de enxágue com HCL 0,1 N duas ou três vezes. Lave as células quatro ou dê tempos com ddH₂O.
5. Observe as células em busca de proteoglicanos (cor azul) ao microscópio e capture as imagens.
6. Para a quantificação do azul de Alcian, extrair o corante com 6 M guanidina-HCl e ler as amostras a uma densidade óptica (DO) de 595 nm. O kit azul de Alcian utilizado neste estudo cora proteoglicanos ácidos na cartilagem e se liga especialmente aos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) presentes na matriz dos condrócitos¹⁰.

8. Diferenciação de DPSCs em direção à linhagem hepática e caracterização

1. Faça uma suspensão de células unicelular por tratamento com tripsina, conforme descrito acima, e ressuspenda o pellet celular em α-MEM completo.
2. Conte as células e semeie-as em 24 placas de cultura bem tratadas a 2 x 10⁴ células/poço contendo 0,4-0,5 mL de meio completo por 48 h.
3. Após 48 h, remover o meio dos alvéolos e incubar as células com meio de indução hepática durante 14 dias. O meio de indução consiste em meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com baixa glicose contendo dexametasona (0,5 μM), fator de crescimento epidérmico (EGF; 2 ng/mL), pré-mistura ITS+ (50 mg/mL) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF; 20 ng/mL) ⁶.
4. Após 14 dias, substituir o meio por meio de maturação por mais 14 dias (α-MEM suplementado com Oncostatina M [OSM; 20 ng/mL], pré-mistura de ITS [50 mg/mL] e dexametasona [0,5 μM]) ⁶. Reabasteça a mídia com novas mídias a cada três dias.
5. Realize análise imuno-histoquímica e um ensaio de lipoproteína de baixa densidade (LDL) para confirmar a diferenciação hepática.
   1. Captação de LDL e coloração imunofluorescente para o receptor de LDL
      NOTA: A pós-diferenciação de células semelhantes a hepatócitos foi caracterizada pelo kit de ensaio de captação de LDL de acordo com as instruções do kit. O fluorocromo LDL-550 foi usado para avaliar a captação de LDL em células diferenciadas sob o estado vivo e o anticorpo receptor de LDL foi usado para a detecção de receptores de LDL em células diferenciadas pós-fixação.
      1. Após a diferenciação, corar as células vivas com LDL-550 (1:100) por 3-4 h. Após 3-4 h, substituir a solução de coloração por meios de cultura e observar a captação de LDL ao microscópio fluorescente capaz de excitar e emitir iodeto de propídio (PI) comprimentos de onda a 537 e 617 nm, respectivamente.
      2. Fixe as células na solução fixadora por 10 min. Após a fixação celular, bloqueie as células na solução de bloqueio por 30 min.
      3. Incube as células com um anticorpo primário do receptor de LDL por 1 h, lave com 1x PBS três vezes e, em seguida, incube com 488 anticorpo secundário (1:100) por 1 h no escuro.
      4. Lave as células com PBS três vezes para remover o excesso de anticorpos secundários. Adicione 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como uma coloração nuclear.
      5. Observe as células sob um microscópio de fluorescência. Tire imagens usando um microscópio fluorescente capaz de medir comprimentos de onda na faixa de excitação/emissão de DAPI, PI e FITC.
         NOTA: Parâmetros de intensidade de célula única podem ser registrados para quantificar a expressão de anticorpos do receptor de LDL e a captação de LDL. Controles adequados de anticorpos secundários devem ser usados para coloração de imunofluorescência para omitir a fluorescência de fundo resultante apenas do anticorpo secundário.

9. Diferenciação neural de DPSCs em direção à linhagem e caracterização neuronal

1. Após o plaqueamento das células, conforme descrito acima, cultive as células em α-MEM por 48 h.
2. Aspire o meio e substitua-o por meio neurobasal contendo fatores de crescimento, como suplemento de G5 a 0,5%, suplemento de N2 a 0,2%, fator de crescimento epidérmico de 20 ng/mL, fator de crescimento básico de fibroblastos de 20 ng/mL e suplemento de B27 (1%). Cultive as células neste meio por 25-41 dias⁷.
3. Troque o meio a cada dois ou três dias, dependendo de seu metabolismo pelas células. Para obter maturação neuronal eficiente e mais neurônios de proteína-2 associados a microtúbulos (MAP-2+), remova EGF e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) após o estágio de indução neuronal (14 dias).
   NOTA: Com o tempo e após repetidas mudanças de meio, neurônios diferenciados podem mostrar descolamento dos poços da placa devido à baixa aderência, resultando em perda de neurônios em cultura de longo prazo. Para evitar isso, cubra os poços da placa com laminina ou fibronectina (opcional).
4. Realize a análise imuno-histoquímica para confirmar a diferenciação semelhante ao neuronal.
   1. Imunomarcação de DPSCs diferenciadas
      NOTA: Para confirmar a diferenciação neuronal das DPSCs, a imunocitoquímica foi realizada nas células diferenciadas usando anticorpos MAP-2 e neurofilamento (NFM), que são proteínas neurogênicas específicas da linhagem⁷.
      1. Remova os meios de cultura após a diferenciação estar completa. Adicione o PBS, gire suavemente a placa e remova o PBS com a ajuda de uma pipeta. Repita a etapa.
      2. Fixe as células usando 10% de NBF ou 4% de paraformaldeído por 20-30 min em temperatura ambiente.
      3. Remova o fixador e lave as células com 1x PBS duas ou três vezes. Adicione a solução de permeabilização (Triton-X-100; 0,1%) e incube as células por 5 min.
      4. Realize a lavagem com PBS duas ou três vezes e bloqueie as células com agente bloqueador (BSA) a 0,5% -1% por 1 h a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C. Remova o agente bloqueador e lave as células com 1x PBS.
      5. Incube as células durante a noite com anticorpo primário (preparado em 0,1% BSA, NFM [1:50] e MAP-2 [1:200]).
      6. Remova o anticorpo primário e lave as células com 1x PBS três ou quatro vezes para remover os anticorpos não ligados.
      7. Adicione anticorpo secundário (coelho anti-rato 1:2.000) e incube as células em temperatura ambiente por 1,5-2 h no escuro. Lave as células com PBS (duas ou três vezes).
      8. Incube as células em DAPI por 10 min e lave novamente com PBS. Manter o volume residual para evitar o ressecamento da amostra. Observe sob o microscópio de fluorescência.
         NOTA: Além disso, a estabilidade do cariótipo¹⁰ e a caracterização da senescência também podem ser realizadas para ter uma ideia melhor da pureza e funcionalidade das células.

Resultados

Aqui, descrevemos como os pesquisadores podem estabelecer uma cultura pura de DPSCs por meio do método de explante 6,7,8,9,10 e induzi-los a várias linhagens para estabelecer a pureza da cultura para aplicações a jusante.

Estabelecemos uma cultura primária de DPSCs a partir do pequeno tecido de polpa extraído do terce...

Discussão

As células-tronco depositaram as esperanças de curar inúmeras doenças, devido à sua plasticidade, robustez, propriedades imunomoduladoras, mecanismos parácrinos e eficiências de homing. O tecido pulpar dentário é considerado a fonte mais potente e valiosa de células-tronco, com plasticidade eminente e capacidade regenerativa. Aqui, demonstramos o isolamento de DPSCs, utilizando o método de cultura de explante amplamente adotado, no qual as células migram de pedaços de tecido pulpar ou explantes para crescer ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G