치과용 치수줄기세포의 1차 배양

요약

이 논문은 외식물 배양 방법을 사용하여 치수 줄기세포의 1차 배양을 확립하고 ICSCRT 지침에 따라 이러한 세포의 특성을 분석하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 세포는 추가 응용을 위한 중간엽 줄기 세포로 간주될 수 있습니다.

초록

인간 치과 치수는 발치된 치아에서 수확할 수 있는 탁월한 재생 능력을 갖춘 유망한 다능성 줄기 세포 저장소를 나타냅니다. 치과용 치수줄기세포(DPSC)의 신경능선 유래 외중간엽 기원은 조직 복구 및 재생에 대한 다각적인 이점으로 인해 높은 수준의 가소성을 부여합니다. 성체 줄기 세포를 채취, 유지 및 증식시키는 다양한 실용적인 방법이 재생 의학에 사용하기 위해 연구되고 있습니다. 이 연구에서는 외식물 배양법에 의해 치아 조직으로부터 1차 중간엽 줄기세포 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 분리된 세포는 방추체 모양이었고 배양 플레이트의 플라스틱 표면에 부착되었습니다. 이러한 줄기세포의 표현형 특성 분석은 CD90, CD73 및 CD105와 같은 MSC에 대한 ISCT(International Society of Cell Therapy)에서 권장하는 세포 표면 마커의 양성 발현을 보여주었습니다. 또한, 조혈(CD45) 및 내피 마커(CD34)의 발현은 무시할 수 있는 수준이며, HLA-DR 마커의 발현은 2% 미만으로 DPSC 배양의 균질성과 순도를 확인했습니다. 우리는 또한 adipogenic, osteogenic 및 chondrogenic 계통에 대한 분화를 기반으로 한 그들의 다능성을 설명했습니다. 우리는 또한 이러한 세포가 해당 자극 매체를 추가하여 간과 신경 세포로 분화하도록 유도했습니다. 이 최적화된 프로토콜은 실험실 또는 전임상 연구에 활용될 수 있는 고도로 확장 가능한 중간엽 줄기 세포 집단의 배양에 도움이 될 것입니다. DPSC 기반 치료를 시행하기 위한 임상 설정에 유사한 프로토콜을 통합할 수 있습니다.

서문

성체 줄기 세포는 가소성, 파라크린 메커니즘 및 면역 조절 특성으로 인해 세포 유도 치료 및 요법을 위한 강력한 치료 도구로 자리 잡았습니다 ^1,2,3. 줄기 세포 기반 전임상 연구에서 얻은 고무적인 데이터는 연구자들이 벤치에서 병상으로의 번역을 위해 일하도록 영감을 주었습니다. 줄기 세포 치료에 사용되는 줄기 세포의 유형은 성공적인 결과에 중요한 역할을 합니다. 전임상 및 임상 연구에서 중간엽 줄기 세포(MSC)의 가장 널리 보고된 출처는 골수로 남아 있습니다 ^4,5. 그러나 골수 유래 줄기 세포(BMSC) 사용의 주요 단점은 희귀한 개체군, 매우 침습적인 분리 절차 및 제한된 확장 능력이라는 것입니다. 따라서 MSC의 대체 공급원이 모색되고 있습니다. 이와 관련하여, 치과 조직은 접근성의 용이성, 엄청난 가소성, 높은 재생 잠재력 및 높은 증식 능력을 가지고 있으며, 이제 줄기 세포의 풍부하고 잠재적인 대체 공급원으로 간주되어^왔다 6,7,8,9,10.

프로토콜

연구에 설명된 모든 절차는 찬디가르 PGIMER의 연구소 윤리 위원회(IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72)의 승인을 받았습니다. 모든 세포 배양 관련 실험은 무균 기술에 따라 Class II 생물 안전 작업대(BSC)에서 수행해야 합니다. 치수는 교정을 위해 제3대구치 발치를 받은 3명(F/14, M/14, M/20) 환자의 건강한 치아에서 얻었다. 검체를 채취하기 전에 찬디가르 PGIMER의 윤리 위원회에서 제공한 지침에 따라 환자/보호자로부터 서면 동의를 받았습니다.

1. 인체 치아 조직에서 치과용 치수줄기세포(DPSC)의 1차 배양 확립

알림: 충치가 있는 치아는 사용해서는 안 됩니다.

1. 치과용 치수수 시료 채취 및 조직 배양 실험실로 운송
   1. 비외상성 및 무균 상태에서 치아 발치 절차를 수행합니다. 발치한 치아를 멸균 식염수로 철저히 헹구어 혈액 잔여물을 제거합니다.
   2. 발치된 치아를 세로로 두 조각으로 자르고 멸균 생리식염수로 지속적으로 관개하여 치수를 노출시킵니다.
   3. 발치된 치아를 얼음 위에서 유지되는 멸균 α-최소 필수 배지(α-MEM)에 담아 온전한 치수와 함께 세포 및 조직....

토론

줄기 세포는 가소성, 견고성, 면역 조절 특성, 파라크린 메커니즘 및 귀환 효율성으로 인해 수많은 질병을 치료할 수 있는 희망을 품고 있습니다. 치과 치수 조직은 뛰어난 가소성과 재생 능력을 갖춘 줄기 세포의 가장 강력하고 가치 있는 공급원으로 간주됩니다. 여기에서는 세포가 펄프 조직 또는 외식물 조각에서 이동하여 형태학적으로 방추체 모양의 섬유아세포와 유사한 균질한 세포 배양으?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G