치과용 치수줄기세포의 1차 배양

요약

이 논문은 외식물 배양 방법을 사용하여 치수 줄기세포의 1차 배양을 확립하고 ICSCRT 지침에 따라 이러한 세포의 특성을 분석하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 세포는 추가 응용을 위한 중간엽 줄기 세포로 간주될 수 있습니다.

초록

인간 치과 치수는 발치된 치아에서 수확할 수 있는 탁월한 재생 능력을 갖춘 유망한 다능성 줄기 세포 저장소를 나타냅니다. 치과용 치수줄기세포(DPSC)의 신경능선 유래 외중간엽 기원은 조직 복구 및 재생에 대한 다각적인 이점으로 인해 높은 수준의 가소성을 부여합니다. 성체 줄기 세포를 채취, 유지 및 증식시키는 다양한 실용적인 방법이 재생 의학에 사용하기 위해 연구되고 있습니다. 이 연구에서는 외식물 배양법에 의해 치아 조직으로부터 1차 중간엽 줄기세포 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 분리된 세포는 방추체 모양이었고 배양 플레이트의 플라스틱 표면에 부착되었습니다. 이러한 줄기세포의 표현형 특성 분석은 CD90, CD73 및 CD105와 같은 MSC에 대한 ISCT(International Society of Cell Therapy)에서 권장하는 세포 표면 마커의 양성 발현을 보여주었습니다. 또한, 조혈(CD45) 및 내피 마커(CD34)의 발현은 무시할 수 있는 수준이며, HLA-DR 마커의 발현은 2% 미만으로 DPSC 배양의 균질성과 순도를 확인했습니다. 우리는 또한 adipogenic, osteogenic 및 chondrogenic 계통에 대한 분화를 기반으로 한 그들의 다능성을 설명했습니다. 우리는 또한 이러한 세포가 해당 자극 매체를 추가하여 간과 신경 세포로 분화하도록 유도했습니다. 이 최적화된 프로토콜은 실험실 또는 전임상 연구에 활용될 수 있는 고도로 확장 가능한 중간엽 줄기 세포 집단의 배양에 도움이 될 것입니다. DPSC 기반 치료를 시행하기 위한 임상 설정에 유사한 프로토콜을 통합할 수 있습니다.

서문

성체 줄기 세포는 가소성, 파라크린 메커니즘 및 면역 조절 특성으로 인해 세포 유도 치료 및 요법을 위한 강력한 치료 도구로 자리 잡았습니다 ^1,2,3. 줄기 세포 기반 전임상 연구에서 얻은 고무적인 데이터는 연구자들이 벤치에서 병상으로의 번역을 위해 일하도록 영감을 주었습니다. 줄기 세포 치료에 사용되는 줄기 세포의 유형은 성공적인 결과에 중요한 역할을 합니다. 전임상 및 임상 연구에서 중간엽 줄기 세포(MSC)의 가장 널리 보고된 출처는 골수로 남아 있습니다 ^4,5. 그러나 골수 유래 줄기 세포(BMSC) 사용의 주요 단점은 희귀한 개체군, 매우 침습적인 분리 절차 및 제한된 확장 능력이라는 것입니다. 따라서 MSC의 대체 공급원이 모색되고 있습니다. 이와 관련하여, 치과 조직은 접근성의 용이성, 엄청난 가소성, 높은 재생 잠재력 및 높은 증식 능력을 가지고 있으며, 이제 줄기 세포의 풍부하고 잠재적인 대체 공급원으로 간주되어^왔다 6,7,8,9,10.

치과용 치수줄기세포(DPSC)는 2000년 Gronthos에 의해 분리되어 특성화된 최초의 치아 줄기세포였다¹¹. DPSC는 높은 증식률, 상당한 차별화 가능성, 손쉬운 배양을 통한 접근성 용이성, 그리고 가장 중요한 것은 윤리적 우려 없이 버려진 치아에서 얻을 수 있는 능력 때문에 조직 공학 응용 분야에서 주목을 받고 있습니다¹². BMSC 및 지방 유래 줄기 세포(ADSC)와 같은 다른 줄기 세포 소스가 갖는 고립 및 부적절한 자가 재생 능력의 한계는 DPSC에 의해 우회된다¹³. 인간 DPSC는 인간의 기본 치아, 영구치, 사랑니, 박리 낙엽 치아(SHED) 및 치근단 유두에서 얻을 수 있습니다. 더욱이, DPSC는 일반적으로 폐기되는 상부 치아로부터 분리될 수도 있다¹⁴. DPSC는 신경능선 관련 마커를 발현하며 in vitro 및 in vivo 모두에서 신경 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다 ¹⁵. 신경원성 잠재력 외에도 DPSC는 특정 분화 조건이 주어질 때 골형성, 연골형성, 지방형성, 간형성 및 근형성과 같은 다른 세포계통으로 분화할 수 있다¹³. 따라서 이러한 다능성 세포는 세포 기반 치료에 대한 큰 잠재력을 가지고 있으며 다양한 조직의 재생에 사용될 수 있습니다. 연구는 또한 각막 재건¹⁶, 심근 경색¹⁷ 복구에서 DPSC의 잠재적 역할과 사지 허혈¹⁸, 알츠하이머 ¹⁹, 파킨슨병 ²⁰ 및 노화²¹와 같은 질병에 대한 잠재적 치료 역할을보고했습니다. 따라서, 치아 조직 유래 줄기세포는 치아 재생뿐만 아니라 눈⁽¹⁶), 심장(¹⁷), 간(²²), 뼈(²³) 등과 같은 비치아 장기의 복구 및 재생에도 사용될 수 있다.

펄프 조직에서 MSC 집단을 분리하는 두 가지 특정 방법이 있습니다 - 효소 소화 및 이식 배양^24,25. DPSC의 양과 특성에 큰 차이가 없는 1차 배양물의 성공적인 확립은 이 두 가지 방법 모두에 의해 보고되었다²⁶. 이 연구에서는 섬유아세포 오염을 초래할 수 있는 효소 소화에 비해 조혈 세포 및 내피 세포의 오염 없이 DPSC를 생성하기 때문에 이식 방법(²⁷)에 의한 DPSC의 분리에 초점을 맞췄습니다²⁸.

프로토콜

연구에 설명된 모든 절차는 찬디가르 PGIMER의 연구소 윤리 위원회(IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72)의 승인을 받았습니다. 모든 세포 배양 관련 실험은 무균 기술에 따라 Class II 생물 안전 작업대(BSC)에서 수행해야 합니다. 치수는 교정을 위해 제3대구치 발치를 받은 3명(F/14, M/14, M/20) 환자의 건강한 치아에서 얻었다. 검체를 채취하기 전에 찬디가르 PGIMER의 윤리 위원회에서 제공한 지침에 따라 환자/보호자로부터 서면 동의를 받았습니다.

1. 인체 치아 조직에서 치과용 치수줄기세포(DPSC)의 1차 배양 확립

알림: 충치가 있는 치아는 사용해서는 안 됩니다.

1. 치과용 치수수 시료 채취 및 조직 배양 실험실로 운송
   1. 비외상성 및 무균 상태에서 치아 발치 절차를 수행합니다. 발치한 치아를 멸균 식염수로 철저히 헹구어 혈액 잔여물을 제거합니다.
   2. 발치된 치아를 세로로 두 조각으로 자르고 멸균 생리식염수로 지속적으로 관개하여 치수를 노출시킵니다.
   3. 발치된 치아를 얼음 위에서 유지되는 멸균 α-최소 필수 배지(α-MEM)에 담아 온전한 치수와 함께 세포 및 조직 배양 실험실로 운반합니다.
      참고: 이상적으로는 세포 배양을 위해 2시간 이내에 받은 모든 샘플을 처리하십시오. 그러나 최근 보고서에 따르면 24시간 후에도 치아 샘플을 처리하는 것이 DPSC의 생존 가능성과 증식에 영향을 미치지 않았지만 기능을 감소시켰다²⁹.

2. 치아에서 치수조직 제거 및 DPSC의 세포 배양(시간: 60-120분)

참고: 치아 이송 후 모든 단계는 생물 안전 캐비닛 레벨 2 내부의 세포 및 조직 배양 실험실에서 수행되었습니다.

1. 치아 샘플을 멸균 배양 페트리 접시에 넣고 1x 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 용액으로 철저히 헹굽니다(3회 또는 4회).
2. 날카로운 굴삭기와 집게를 사용하여 치수 구멍에서 치수 조직을 조심스럽게 제거합니다.
3. 과육이 제거되면 멸균 PBS로 철저히 세척하여 혈액 잔여물을 제거합니다.
4. 페트리 접시에 수술용 칼날을 사용하여 치수 조직을 약 2-3mm의 작은 조각으로 자릅니다.
   1. 각 영역에 1-2mL의 멸균 PBS를 넣어 접시의 표면적을 네 부분으로 나눕니다. PBS로 치수 조직 샘플을 한 영역에 넣고 수술용 칼날로 조직을 가능한 가장 작은 조각으로 자릅니다(조각이 작을수록 줄기 세포가 조직 밖으로 더 쉽게 이동할 수 있음). 그런 다음 PBS를 사용하여 각 조각을 다른 영역으로 들어 올려 네 번째 영역까지 옮기는 식으로 티슈 조각이 제대로 세척되고 오염 물질이 없도록 합니다.
5. 한편, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 항생제 칵테일(즉, 페니실린 및 스트렙토마이신)과 함께 비필수 아미노산을 함유한 약 0.8-1mL의 α-MEM을 6웰 플레이트의 웰에 붓습니다. 플레이트를 움직여 매체를 균일하게 분배하여 웰 표면에 고르게 펴 놓습니다.
6. 집게를 사용하여 작은 펄프 조직 조각 또는 배엽물을 6-웰 플레이트의 단일 웰 (웰 당 4-6 개)에 파종하고 생물 안전 후드에서 5 분 동안 플레이트를 방해하지 않고 유지하십시오.
   참고: 이 단계는 배양 플레이트의 처리된 표면에 조직/외식물이 부착되는 데 도움을 줍니다.
7. 배양 플레이트를 37°C의 온도와 5% CO₂ 수준의 가습된 분위기에서 유지하십시오_.
8. 다음 날, 외식물을 방해하지 않고 우물에서 매체를 조심스럽게 흡입하고 새로운 매체를 추가하십시오. 건조를 방지하기 위해 이 단계에서 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오. 추가 증발로 인해 플레이트 웰의 매체가 건조되지 않도록 인큐베이터의 트레이에 충분한 물이 있는지 확인하십시오.
   알림: 이것은 매우 중요한 단계이며 방해로 인해 외식이 제자리에서 빠질 수 있습니다. 매체 전달 중에 외식물 조각이 제자리에서 빠지면 매체를 완전히 제거하고 웰 표면에 부착되도록 하여 다시 부착하십시오. 매체는 외식물을 방해하지 않고 우물 벽을 따라 조심스럽게 추가해야 하며, 그렇지 않으면 다시 분리될 수 있습니다. 도립 현미경(4x 또는 10x 확대)으로 세포 배양 플레이트를 정기적으로 관찰합니다. 플라스틱 표면에 부착하는 능력과 스핀들 모양의 형태로 DPSC를 식별합니다.
9. 외식물에서 충분한 세포가 이동하면 조직을 제거하고 세포가 증식하여 최적 70%-75% 세포 합류점에 도달하도록 한 후 하위 배양합니다. 10% FBS를 함유하는 α-MEM의 부피는 이 단계에서 2mL로 증가시켜 세포가 더 빨리 분열할 수 있도록 할 수 있습니다. 이 단계에서 3일마다 미디어를 교체하십시오.

3. DPSC 확장

1. DPSC의 합류 T75 배양 플라스크(밀도: 70%-80%)를 PBS(10mL)로 두 번 세척합니다.
2. T75 플라스크 측면에 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2.5mL를 넣고 트립신-EDTA가 DPSC의 전체 세포 시트 또는 단층을 덮도록 부드럽게 휘젓습니다.
3. 후드 내부의 플라스크를 37-3분 동안 5°C로 유지하십시오. 3분 후 플라스크를 가볍게 두드려 세포가 분리되도록 합니다.
4. 5mL의 완전한 배지(10% FBS가 포함된 α-MEM) 또는 250μL의 FBS(사용된 트립신 부피의 10%)를 중화제로 추가하여 트립신 활성을 비활성화합니다. 해리된 DPSC의 전체 세포 현탁액을 새로운 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 옮깁니다.
5. 해리된 세포를 실온에서 500 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
6. 피펫을 사용하여 모든 상층액을 흡인하고, 플라스크에 5-10mL의 PBS를 추가하여 잔류 세포를 수집하고, 부드러운 피펫팅으로 PBS의 세포를 세척하고, 세포를 다시 500 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 필요한 경우 반복합니다.
7. 상층액을 조심스럽게 제거하고 부드러운 피펫팅을 수행하여 단일 세포 현탁액을 얻은 후 1mL의 완전한 배지(10% FBS가 포함된 α-MEM)에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
8. 세포를 분할하고 (동일한 부피) 각각 10mL의 완전한 배지가 들어 있는 두 개의 T75 배양 플라스크에 파종합니다. 후드 내부의 플라스크를 37°C로 유지하십시오.
9. 다음 날, 매체를 흡인하고 새로운 완전한 매체로 교체합니다.
   참고: 트립신 치료를 장기간 하면 세포 표면 단백질과 세포외 기질 단백질을 절단하여 세포 무결성, 생존력 및 세포 기능을 손상시킬 수 있습니다.

4. 줄기세포 표현형 마커 식별 (시간: 90 - 120분)

참고: 펄프 조직에서 채취한 세포의 특성을 분석하려면 세 번째와 다섯 번째 통로 사이의 세포를 사용하십시오.

1. DPSC의 70%-80%(~3-4 x 10⁶ 세포, 이미지 기반 세포분석기 또는 혈구계를 사용하여 세포 계산) 융합 T75 배양 플라스크 2개를 사용하고 10mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
2. 0.25% 트립신-EDTA 2.5mL를 넣고 후드 내부의 플라스크를 37-5분 동안 37°C로 유지합니다. 5mL의 전체 배지 또는 250μL의 FBS(사용된 트립신 부피의 10%)를 중화제로 추가하여 트립신 활성을 비활성화합니다.
3. 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브에서 피펫을 사용하여 세포를 수집합니다. 해리된 세포를 실온에서 500 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
4. 피펫을 사용하여 모든 상층액을 흡인하고, 플라스크에 PBS 5mL를 첨가하여 잔여 세포를 수집하고, 부드러운 피펫팅으로 PBS에서 세포를 세척하고, 세포를 다시 500 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
5. 상층액을 조심스럽게 제거한 후 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁시키고 부드러운 피펫팅을 수행하여 단세포 현탁액을 얻습니다.
6. 가용성에 따라 이미지 기반 세포분석기 또는 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수하고 1 x 10⁴ cells/tube의 미세 원심분리기 튜브에 분배합니다. 0.5%-1% 소 혈청 알부민(BSA)에서 0.5-1시간 동안 세포를 배양합니다.
7. 각 튜브에 분화군집(CD) 마커(즉, CD90[0.4μg], CD73[0.8μg], CD105[0.4μg], CD34[0.8μg], CD45[0.4μg] 및 HLA-DR[0.08μg^])6,7,8,9를 위한 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 피코에리트린(PE) 복합 항체를 추가하고 실온의 어두운 곳에서 0.5시간 동안 배양합니다.
8. 0.5시간 후 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿 아래로 펠릿화합니다. 상층액을 흡인하고 PBS로 세포의 펠릿을 씻어낸 다음 다시 원심분리합니다.
9. 원심분리 후 펠릿을 PBS(200μL/튜브)에 재현탁시키고 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮긴 다음 유세포 분석기를 사용하여 획득합니다. 모든 상용 소프트웨어를 사용하여 다양한 항체에 대한 양성 세포의 비율을 추가로 분석할 수 있습니다.
   알림: 4.7-4.9단계는 실온의 어두운 곳에서 수행해야 합니다. 적절한 isotype control과 염색되지 않은 샘플을 사용하여 세포의 배경 형광을 생략해야 합니다.

5. DPSC를 여러 계통으로 차별화

참고: 다능성 평가를 위해 세 번째에서 다섯 번째 통로에서 DPSC의 75%-80% 융합 배양을 사용하십시오. α-MEM을 포함하는 대조군 세포기는 후술하는 모든 유형의 분화에 사용되어야 한다.

1. DPSC의 골형성 분화, alizarin red 염색 및 정량화
   1. 위의 단계 4.2에서 설명한 대로 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 단일 세포 현탁을 만들고 세포 펠릿을 완전한 α-MEM에서 재현탁시킵니다.
   2. 세포를 계수하고 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 48 시간 동안 0.4-0.5 mL의 완전한 배지를 포함하는 2 x 10⁴ 세포 / 웰 세포 밀도의 24 웰 조직 배양 처리 플레이트에 파종합니다.
   3. 48시간 후 웰에서 배지를 제거하고 0.4-0.5mL의 골형성 유도 매체(즉, 베타 글리세로포스페이트[5mM], 인산일칼륨[1.8mM], 덱사메타손 인산이나트륨[0.01mM])8와 같은 골형성 유도 인자를 사용한 α-MEM)^을 추가합니다. 골형성 유도 인자(대조 매체) 없이 완전한 α-MEM만 포함하는 대조군 웰(유도되지 않은 세포)을 준비합니다.
      참고: 50μM 아스코르브산염을 첨가하면 골형성 분화가 향상되는 것으로 보고되었습니다 ^30,31. 3일마다 인덕션 배지와 대조 배지를 교체하고 21일(3주) 동안 새로운 배지 및 배양액으로 교체합니다. 유도 기간이 끝나면 배양 플레이트에서 배지를 제거하고 PBS 0.5mL를 추가한 다음 2회 세척합니다.
   4. PBS 세척 후 실온에서 20-30분 동안 0.5mL의 10% 중성 완충 포르말린(NBF) 용액에 세포를 고정합니다. 흄/케미컬 후드에 고정을 수행합니다.
2. 알리자린 레드 염색
   1. 2mL의 이중 증류수(ddH_2O) 50mL에 alizarin red S 1g을 용해시키고 염산(HCL) 또는 수산화암모늄(NH_4OH)을 사용하여 pH를 4.0-4.2로 조정하여 alizarin red S 염색(4%)을 준비합니다. 여과지로 얼룩을 걸러냅니다. 얼룩을 어두운 곳(4°C)에 보관하십시오.
   2. 이중 증류수(ddH₂O)로 세포를 두 번 세척하고 alizarin red S 염색을 첨가한 다음 실온에서 30-45분 동안 배양합니다.
   3. 모든 웰에서 얼룩을 제거하고 ddH₂O로 세포를 4-5 번 세척하여 결합되지 않은 얼룩을 제거합니다. 명시야 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
3. 정량 분석을 위한 Alizarin 적색 염색 추출
   1. 세틸 피리디늄 클로라이드(CPC) 완충액(pH 7.0)을 염색된 웰(0.4mL/웰)에 넣고 37°C에서 2시간 동안 세포를 배양합니다. 또한, 세포는 또한 alizarin red crystals³²의 적절한 용해를 위해 10% 아세트산으로 배양될 수 있다. 플레이트를 플레이트 로커 또는 셰이커에 보관하십시오.
   2. 배양 후 상층액(추출된 염료)을 수집하여 96웰 플레이트에 옮기고 405nm에서 플레이트 또는 샘플을 판독합니다. 빈 값을 얻으려면 CPC(동일한 볼륨) 버퍼만 추가하고^32,33을 읽습니다.

6. DPSC의 지방 분화, 오일 레드 O 염색 및 정량화

참고: 파종의 초기 단계는 위와 동일합니다(즉, 골형성 분화 단계 5.1).

1. 48시간 후 웰에서 배지를 제거하고 0.4-0.5mL의 지방 유도 매체(즉, 이소부틸-메틸크산틴[IBMX], 0.5mM], 덱사메타손[1μM], 인도메타신[200μM] 및 인슐린[10μM])8와 같은 지방 유발 유도 인자를 사용한 α-MEM)^을 추가합니다. 유도되지 않은 세포를 포함하는 대조군 웰을 준비합니다(즉, 유도 인자 없이 α-MEM에서만 배양됨{대조 매체]).
2. 3일마다 배지를 보충하고 3주 동안 세포를 배양합니다. 3주 후 배양 플레이트에서 배지를 흡인하고 PBS 0.5mL를 추가하여 세포를 두 번 세척합니다.
3. PBS 세척 후 실온에서 20-30분 동안 10% NBF 용액에 셀을 고정합니다.
4. 이중 증류수(ddH₂O)로 세포를 두 번 세척하고 오일 레드 O 염색을 첨가한 다음 실온에서 30-40분 동안 배양합니다.
5. 모든 웰에서 얼룩을 제거하고 세포가 들어있는 웰을 ddH₂O로 반복적으로 헹굽니다 (2-4 회). 현미경으로 관찰하고 이미지를 캡처합니다.
6. 정량 분석을 위한 오일 레드 O 추출
   1. 염색된 웰에 0.4mL의 100% 2-프로판올을 추가하고 플레이트를 30분 동안 적절하게 덮어 실온에서 배양합니다. 접시를 접시 로커 또는 셰이커에 보관하십시오.
   2. 배양 후 상층액을 수집하여 96웰 플레이트로 옮기고 510nm에서 플레이트 또는 샘플을 판독합니다. 블랭킹을 위해 100% 2-프로판올을 사용하십시오.

7. DPSC의 연골 형성 분화, Alcian blue 염색 및 정량화

참고: 연골 형성 분화는 DPSC의 단층 배양에서 유도되었습니다. 파종의 초기 단계는 위와 동일합니다(즉, 골형성 분화 단계 5.1).

1. 48시간 후 웰에서 배지를 제거하고 0.4-0.5mL의 연골 유도 배지(즉, 연골 분화에 특이적인 유도 인자가 있는 α-MEM, 아스코르브산[0.2M], 피루브산나트륨[1mM], 형질전환 성장 인자-베타 3[TGF-β₃; 10μM], 덱사메타손[1mM] 및 1x ITS 프리믹스[인슐린, 트랜스페린 및 셀렌산]¹⁰을 추가합니다. 유도되지 않은 세포를 포함하는 대조군 웰을 준비합니다(즉, 유도 인자[대조 매체] 없이 α-MEM에서만 배양).
2. 3일마다 배지를 보충하고 3주 동안 세포를 배양합니다. 유도 기간이 끝나면 배양 플레이트에서 배지를 흡입하고 0.5mL의 PBS를 추가하여 세포를 두 번 세척합니다.
3. PBS 세척 후 실온에서 15-20분 동안 10% NBF 용액에 세포를 고정합니다. 이중 증류수(ddH₂O)로 세포를 두세 번 세척하고 Alcian blue stain을 첨가한 다음 실온에서 45분 동안 배양합니다.
4. 모든 웰에서 얼룩을 제거한 다음 0.1N HCL로 두세 번 헹굽니다. 세포를 4 번 씻거나 ddH₂O로 시간을 내십시오.
5. 현미경으로 프로테오글리칸(파란색)에 대한 세포를 관찰하고 이미지를 캡처합니다.
6. Alcian blue 정량화의 경우 6M guanidine-HCl을 사용하여 염료를 추출하고 595nm의 광학 밀도(OD)에서 샘플을 판독합니다. 이 연구에 사용된 Alcian blue 키트는 연골의 산성 프로테오글리칸을 염색하고 연골세포 매트릭스에 존재하는 황산염 글리코사미노글리칸(GAG)과 특별히 결합합니다¹⁰.

8. 간유사 계통에 대한 DPSC의 차별화 및 특성화

1. 상술한 바와 같이, 트립신 처리에 의해 세포의 단일-세포 현탁을 만들고, 세포 펠릿을 완전한 α-MEM에서 재현탁시킨다.
2. 세포를 세고 48시간 동안 0.4-0.5mL의 완전한 배지를 포함하는 2 x 10⁴ cells/well에서 24-well 처리된 배양 플레이트에 파종합니다.
3. 48시간 후 웰에서 배지를 제거하고 14일 동안 간 유도 배지로 세포를 배양합니다. 유도 배지는 덱사메타손(0.5μM), 표피 성장 인자(EGF; 2ng/mL), ITS+ 프리믹스(50mg/mL) 및 간세포 성장 인자(HGF, 20ng/mL)를 함유한 저포도당 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)으로 구성됩니다 ⁶.
4. 14일 후 배지를 14일 더 성숙 배지로 교체합니다(α-MEM에 Oncostatin M[OSM], 20ng/mL, ITS 프리믹스[50mg/mL], 덱사메타손[0.5μM]이 보충됨) ⁶. 3일마다 새로운 미디어로 미디어를 보충하십시오.
5. 면역조직화학 분석 및 저밀도 지단백질(LDL) 분석을 수행하여 간과 유사한 분화를 확인합니다.
   1. LDL 수용체에 대한 LDL 흡수 및 면역형광 염색
      참고: 분화 후 간세포 유사 세포는 키트 지침에 따라 LDL 흡수 분석 키트에 의해 특성화되었습니다. LDL-550 형광 색소는 살아있는 상태에서 분화된 세포의 LDL 흡수를 평가하는 데 사용되었으며, LDL 수용체 항체는 고정 후 분화된 세포에서 LDL 수용체를 검출하는 데 사용되었습니다.
      1. 분화 후 살아있는 세포를 LDL-550(1:100)으로 3-4시간 동안 염색합니다. 3-4시간 후 염색 용액을 배양 배지로 교체하고 537nm 및 617nm에서 각각 프로피듐 요오드화물(PI) 여기 및 방출 파장을 수행할 수 있는 형광 현미경으로 LDL 흡수를 관찰합니다.
      2. 정착액에 세포를 10분 동안 고정합니다. 세포 고정 후 차단 용액의 세포를 30분 동안 차단합니다.
      3. 1 차 LDL 수용체 항체로 1 시간 동안 세포를 배양하고, 1x PBS로 3 회 세척 한 다음 어두운 곳에서 1 시간 동안 488 2 차 항체 (1 : 100)로 배양합니다.
      4. PBS로 세포를 3회 세척하여 과도한 2차 항체를 제거합니다. 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 핵 염색제로 추가합니다.
      5. 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. DAPI, PI 및 FITC의 여기/방출 범위에서 파장을 측정할 수 있는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다.
         참고: LDL 수용체 항체 발현 및 LDL 흡수를 정량화하기 위해 단일 세포 강도 매개변수를 기록할 수 있습니다. 면역형광 염색에는 2차 항체에서만 발생하는 배경 형광을 생략하기 위해 적절한 2차 항체 대조군을 사용해야 합니다.

9. 신경 세포와 같은 계통 및 특성화에 대한 DPSC의 신경 분화

1. 세포의 도금 후, 상술한 바와 같이, 세포를 α-MEM에서 48시간 동안 배양한다.
2. 배지를 흡인하고 0.5% G5 보충제, 0.2% N2 보충제, 20ng/mL 표피 성장 인자, 20ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자 및 B27 보충제(1%)와 같은 성장 인자를 포함하는 신경기저 배지로 교체합니다. 이 배지에서 25-41일 동안 세포를 배양합니다⁷.
3. 세포의 신진대사에 따라 2일 또는 3일마다 배지를 교체하십시오. 효율적인 신경 세포 성숙과 더 많은 미세소관 관련 단백질-2(MAP-2+) 신경 세포를 달성하려면 신경 세포 유도 단계(14일) 후에 EGF와 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 제거하십시오.
   참고: 시간이 지남에 따라 반복적인 배지 교체 후에 분화된 뉴런은 낮은 부착성으로 인해 플레이트 웰에서 분리될 수 있으며, 이로 인해 장기 배양에서 뉴런 손실이 발생할 수 있습니다. 이를 방지하려면 플레이트 웰을 라미닌 또는 피브로넥틴(선택 사항)으로 코팅하십시오.
4. 신경 세포와 같은 분화를 확인하기 위해 면역조직화학 분석을 수행합니다.
   1. 차별화된 DPSC의 면역염색
      참고: DPSC의 뉴런과 같은 분화를 확인하기 위해 신경인성 계통 특이적 단백질인 MAP-2 및 신경필라멘트(NFM) 항체를 사용하여 분화된 세포에서 면역세포화학을 수행했습니다⁷.
      1. 분화가 완료된 후 배양 배지를 제거합니다. PBS를 추가하고 플레이트를 부드럽게 휘젓고 피펫을 사용하여 PBS를 제거합니다. 이 단계를 반복합니다.
      2. 실온에서 20-30분 동안 10% NBF 또는 4% 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 고정합니다.
      3. 정착제를 제거하고 1x PBS로 세포를 두세 번 세척합니다. 투과화 용액(Triton-X-100, 0.1%)을 넣고 세포를 5분 동안 배양합니다.
      4. PBS 세척을 2-3회 수행하고 37°C에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 0.5%-1% 차단제(BSA)로 세포를 차단합니다. 차단제를 제거하고 1x PBS로 세포를 세척합니다.
      5. 1차 항체(0.1% BSA, NFM[1:50] 및 MAP-2[1:200]로 제조)로 세포를 밤새 배양합니다.
      6. 1차 항체를 제거하고 1x PBS로 세포를 3-4회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
      7. 2차 항체(rabbit anti-mouse 1:2,000)를 추가하고 어두운 곳에서 1.5-2시간 동안 실온에서 세포를 배양합니다. PBS로 세포를 세척하십시오 (2 회 또는 3 회).
      8. DAPI에서 10분 동안 세포를 배양하고 PBS로 다시 세척합니다. 샘플의 건조를 방지하기 위해 잔류량을 유지하십시오. 형광 현미경으로 관찰합니다.
         참고: 또한 핵형 안정성¹⁰ 및 노화 특성 분석을 수행하여 세포의 순도와 기능에 대한 더 나은 아이디어를 얻을 수 있습니다.

결과

여기에서는 연구자가 이식 방법 ^6,7,8,9,10을 통해 DPSC의 순수 배양을 확립하고 여러 계통으로 유도하여 다운스트림 응용 분야에 대한 배양의 순도를 확립하는 방법을 설명합니다.

우리는 그림 1A와 같이 환자의 세 번째 어금니...

토론

줄기 세포는 가소성, 견고성, 면역 조절 특성, 파라크린 메커니즘 및 귀환 효율성으로 인해 수많은 질병을 치료할 수 있는 희망을 품고 있습니다. 치과 치수 조직은 뛰어난 가소성과 재생 능력을 갖춘 줄기 세포의 가장 강력하고 가치 있는 공급원으로 간주됩니다. 여기에서는 세포가 펄프 조직 또는 외식물 조각에서 이동하여 형태학적으로 방추체 모양의 섬유아세포와 유사한 균질한 세포 배양으?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G