歯髄幹細胞の初代培養

要約

この記事では、外植片培養法を使用した歯髄幹細胞の初代培養を確立するための段階的なガイドと、ICSCRTガイドラインに基づくこれらの細胞の特性評価について説明します。このプロトコルによって単離された細胞は、さらなるアプリケーションのための間葉系幹細胞と見なすことができます。

要約

ヒトの歯髄は、抜歯した歯から採取できる卓越した再生能力を備えた有望な多能性幹細胞リザーバーです。歯髄幹細胞(DPSC)の神経堤由来の外部間葉系起源は、組織の修復と再生におけるその多面的な利点に起因する高度な可塑性をもたらします。成体幹細胞を回収、維持、増殖させるための実用的な方法が数多くあり、再生医療での使用が検討されています。本研究では、外植片培養法による歯科組織からの初代間葉系幹細胞培養の確立を実証する。単離された細胞は紡錘形をしており、培養プレートのプラスチック表面に付着していました。これらの幹細胞の表現型の特徴付けは、CD90、CD73、CD105などのMSCの国際細胞治療学会(ISCT)が推奨する細胞表面マーカーの陽性発現を示しました。さらに、造血マーカー(CD45)および内皮マーカー(CD34)の発現はごくわずかであり、HLA-DRマーカーの発現は2%未満であり、DPSC培養の均一性と純度が確認されました。さらに、脂肪形成系、骨形成系、軟骨形成系への分化に基づいて、それらの多能性を示しました。また、これらの細胞を対応する刺激媒体を添加することにより、肝臓様細胞および神経細胞様細胞に分化するように誘導しました。この最適化されたプロトコルは、実験室や前臨床試験に利用される間葉系幹細胞の高度に拡張可能な集団の培養に役立ちます。同様のプロトコルは、DPSCベースの治療を実践するための臨床セットアップに組み込むことができます。

概要

成体幹細胞は、その可塑性、パラクリンメカニズム、および免疫調節特性により、細胞指向治療および治療のための強力な治療ツールに成長しました^1,2,3。幹細胞を用いた前臨床試験から得られた有望なデータは、研究者がベンチからベッドサイドへの翻訳に取り組むきっかけとなりました。幹細胞治療に使用される幹細胞の種類は、成功した結果に重要な役割を果たします。前臨床試験および臨床試験において、間葉系幹細胞(MSC)の最も広く報告されている供給源は依然として骨髄^です4,5。しかし、骨髄由来幹細胞(BMSC)を使用することの主な欠点は、その希少な集団、単離のための高侵襲的な手順、および増殖能力が限られていることです。したがって、MSCの代替供給源が調査されています。この点で、歯科組織は、そのアクセスの容易さ、巨大な可塑性、高い再生能力、および高い増殖能力により、現在、幹細胞6,7,8,9,10の豊富で潜在的な代替供給源と見なされています。

プロトコル

この研究に記載されているすべての手順は、チャンディーガルのPGIMERの研究所倫理委員会(IEC#9195 / PG-12 ITRG / 2571-72)によって承認されています。細胞培養に関連するすべての実験は、無菌技術に従ってクラスII生物学的安全キャビネット(BSC)で実施する必要があります。歯髄は、歯列矯正上の理由で第三大臼歯抜歯を受けた3人(F / 14、M / 14、およびM / 20)の患者の健康な歯から採取されました。サンプル収集の前に、チャンディーガルの PGIMER の倫理委員会が提供するガイドラインに従って、患者/保護者から書面によるインフォームド コンセントが得られました。

1. ヒト歯科組織からの歯髄幹細胞(DPSC)の初代培養の確立

注:虫歯は使用しないでください。

1. 歯髄サンプルの収集と組織培養ラボへの輸送
   1. 非外傷性および無菌条件下で抜歯手順を実行します。抜歯した歯を滅菌生理食塩水で十分にすすぎ、血液の残りを取り除きます。
   2. 抜歯した歯を超硬亀裂バーを使用して縦に2つに切断し、滅菌生理食塩水で一定の灌漑を行い、歯髄を露出させます。
   3. 抜歯した歯と無傷の歯髄を、氷上に保持された無菌α最小限の必須培地(α-MEM)に入れて、細胞および組織培養ラボに輸送します。
      注:理想的には、受け取っ....

ディスカッション

幹細胞は、その可塑性、堅牢性、免疫調節特性、パラクリンメカニズム、ホーミング効率により、多くの病気を治癒する望みを抱いてきました。歯髄組織は、幹細胞の最も強力で貴重な供給源と考えられており、優れた可塑性と再生能力を備えています。ここでは、広く採用されている外植片培養法を用いて、細胞が歯髄組織または外植片から移動して、紡錘形の線維芽細胞様細胞に形態学?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G