JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье представлено пошаговое руководство по созданию первичной культуры стволовых клеток пульпы зубов с использованием метода культивирования эксплантов и характеристике этих клеток на основе рекомендаций ICSCRT. Клетки, выделенные по этому протоколу, можно рассматривать как мезенхимальные стволовые клетки для дальнейшего применения.

Аннотация

Пульпа зуба человека представляет собой многообещающий мультипотентный резервуар стволовых клеток с выдающимися регенеративными компетенциями, которые могут быть получены из удаленного зуба. Экто-мезенхимальное происхождение стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), полученное из нервного гребня, обеспечивает высокую степень пластичности, которая обусловлена их многогранными преимуществами в восстановлении и регенерации тканей. Существуют различные практические способы сбора, поддержания и пролиферации взрослых стволовых клеток, которые исследуются для их использования в регенеративной медицине. В данной работе мы демонстрируем создание первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из зубной ткани методом культивирования экспланта. Выделенные клетки имели веретенообразную форму и прилегали к пластиковой поверхности культуральной пластины. Фенотипическая характеристика этих стволовых клеток показала положительную экспрессию рекомендованных Международным обществом клеточной терапии (ISCT) маркеров клеточной поверхности для МСК, таких как CD90, CD73 и CD105. Кроме того, незначительная экспрессия гемопоэтических (CD45) и эндотелиальных маркеров (CD34) и менее 2% экспрессии маркеров HLA-DR подтвердили гомогенность и чистоту культур DPSC. Далее мы проиллюстрировали их мультипотентность, основанную на дифференциации на адипогенные, остеогенные и хондрогенные линии. Мы также заставили эти клетки дифференцироваться в печеночные и нейроноподобные клетки путем добавления соответствующих стимулирующих сред. Этот оптимизированный протокол поможет в культивировании расширяемой популяции мезенхимальных стволовых клеток для использования в лаборатории или для доклинических исследований. Подобные протоколы могут быть включены в клинические установки для практики лечения на основе DPSC.

Введение

Взрослые стволовые клетки превратились в мощный терапевтический инструмент для клеточного лечения и терапии благодаря своей пластичности, паракринным механизмам и иммуномодулирующим свойствам 1,2,3. Обнадеживающие данные доклинических исследований на основе стволовых клеток вдохновили исследователей на работу по переводу «от скамьи к постели больного». Тип стволовых клеток, используемых для терапии стволовыми клетками, играет важную роль в достижении успешных результатов. В доклинических и клинических исследованиях наиболее широко известным источником мезенхимальных стволовых клеток (МСК) остается костный мозг 4,5. Тем не менее, основными недостатками использования стволовых клеток, полученных из костного мозга (BMSC), являются их редкая популяция, высокоинвазивные процедуры изоляции и их ограниченная способность к расширению. В связи с этим изучаются альтернативные источники МСК. В связи с этим зубные ткани, с их легкостью доступа, огромной пластичностью, высоким регенеративным потенциалом и высокой пролиферативной способностью, в настоящее время рассматриваются как богатый и потенциальный альтернативный источник стволовых клеток 6,7,8,9,10.

Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC) были первым типом стоматологических стволовых клеток, которые были выделены и охарактеризованы Gronthos в 2000году11. DPSC привлекли внимание к приложениям тканевой инженерии из-за их высокой скорости пролиферации, значительного потенциала дифференцировки, легкости доступа с легким культивированием и, что наиболее важно, их возможности быть полученными из выброшенного зуба без каких-либо этическихпроблем. DPSC обходят ограничения, связанные с другими источниками стволовых клеток, такими как BMSC и стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), в плане их изоляции и недостаточной способности к самообновлению. DPSC человека могут быть получены из молочных зубов человека, постоянных зубов, зубов мудрости, отслоившихся молочных зубов (SHED) и апикальных сосочков. Более того, DPSC также могут быть выделены из лишних зубов, которые обычно отбрасываются14. DPSC экспрессируют маркеры, связанные с нервным гребнем, и обладают потенциалом для дифференцировки в нейронные клетки как in vitro , так и in vivo15. В дополнение к своему нейрогенному потенциалу, DPSC могут дифференцироваться в другие клеточные линии, такие как остеогенные, хондрогенные, адипогенные, печеночные и миогенные приопределенных условиях дифференцировки. Таким образом, эти мультипотентные клетки обладают большим потенциалом для клеточной терапии и могут быть использованы для регенерации различных тканей. Исследования также сообщили о потенциальной роли DPSC в реконструкции роговицы16, восстановлении инфаркта миокарда17 и их потенциальной терапевтической роли при таких заболеваниях, как ишемия конечностей18, болезнь Альцгеймера 19, болезнь Паркинсона 20 и старение21. Таким образом, стволовые клетки, полученные из зубной ткани, могут быть использованы не только для регенерации зубов, но и для восстановления и регенерации нестоматологических органов, таких как глаза16, сердце17, печень22, кости23 и т. д.

Существуют два конкретных метода выделения популяции МСК из пульповой ткани - ферментативное расщепление и эксплантная культура24,25. Сообщалось об успешном создании первичных культур без существенной разницы в количестве и свойствах DPSC с помощью обоих этих методов26. В данном исследовании мы сосредоточились на выделении DPSC методом экспланта27, поскольку этот метод позволяет получить DPSC без контаминации гемопоэтических и эндотелиальных клеток, по сравнению с ферментативным расщеплением, которое может привести к контаминации фибробластов28.

протокол

Все процедуры, описанные в исследовании, были одобрены Комитетом по этике института (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) PGIMER, Чандигарх. Все эксперименты, связанные с клеточными культурами, должны проводиться в шкафу биологической безопасности класса II (BSC) в соответствии с асептическим методом. Пульпа зуба была получена из здоровых зубов трех пациентов (F/14, M/14 и M/20), перенесших удаление третьего моляра по ортодонтическим причинам. Перед сбором образца было получено письменное информированное согласие от пациента/опекуна в соответствии с руководящими принципами, предоставленными комитетом по этике PGIMER, Чандигарх.

1. Создание первичной культуры стволовых клеток пульпы зуба (DPSC) из зубной ткани человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует использовать любые кариозные зубы.

  1. Сбор образцов пульпы зубов и транспортировка в лабораторию культуры тканей
    1. Провести процедуру удаления зуба в нетравматичных и асептических условиях. Тщательно промойте удаленный зуб стерильным солевым раствором, чтобы удалить остатки крови.
    2. Разрежьте удаленный зуб в продольном направлении на две части с помощью твердосплавного бора для фиссуры с постоянным орошением стерильным физиологическим раствором для обнажения пульпы.
    3. Транспортируйте удаленный зуб вместе с интактной пульпой в стерильных средах α-минимума эссенциальных веществ (α-MEM), поддерживаемых на льду, в лабораторию клеточных и тканевых культур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале все полученные образцы обрабатывайте в течение 2 часов для культивирования клеток. Тем не менее, в недавнем отчете было высказано предположение, что обработка образца зуба даже через 24 часа не повлияла на жизнеспособность и распространение DPSC, однако она снизилаих функциональность.

2. Удаление пульповой ткани из зуба и клеточной культуры DPSC (время: 60-120 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы после транспортировки зубов были выполнены в лаборатории клеточных и тканевых культур внутри шкафа биобезопасности уровня 2.

  1. Поместите образец зуба в стерильную культуру в чашки Петри и тщательно промойте (три или четыре раза) 1x стерильным раствором фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Аккуратно удалите ткань пульпы из полости пульпы с помощью острого экскаватора и щипцов.
  3. После удаления мякоти тщательно очистите ее стерильным PBS, чтобы удалить остатки крови.
  4. Разрежьте ткань пульпы на небольшие кусочки примерно по 2-3 мм с помощью хирургического лезвия в чашке Петри.
    1. Разделите площадь поверхности чашки на четыре части, положив в каждую область по 1-2 мл стерильного PBS. Поместите образец ткани пульпы в одну область с помощью PBS и разрежьте ткань на мельчайшие возможные кусочки хирургическим лезвием (чем меньше кусочек, тем легче будет стволовым клеткам мигрировать из ткани). После этого перенесите каждый кусочек, подняв его в другую область с помощью PBS, и так далее до четвертой области, чтобы кусочки салфетки были должным образом вымыты и не содержали никаких загрязнений.
  5. Между тем, налейте примерно 0,8-1 мл α-MEM, содержащего заменимые аминокислоты, с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и коктейлем антибиотика (т.е. пенициллином и стрептомицином) в лунки 6-луночного планшета. Равномерно распределите среду, перемещая пластину так, чтобы равномерно распределить ее по поверхности лунки.
  6. Высадите небольшие кусочки ткани пульпы или экспланты с помощью щипцов в одну лунку (от четырех до шести штук на лунку) 6-луночного планшета и подержите планшет в неподвижном виде в течение 5 минут в биозащитном колпаке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап позволяет/способствует адгезии ткани/эксплантов к обработанным поверхностям культуральных планшетов.
  7. Выдерживайте культуральную пластину во влажной атмосфере с температурой 37 °C и уровнем CO2 5%.
  8. На следующий день осторожно отсасывайте среду из лунок, не беспокоя экспланты, и добавьте в нее свежую среду. На этом этапе меняйте носитель через день, чтобы предотвратить высыхание. Убедитесь, что в лотке инкубатора достаточно воды, чтобы избыточное испарение не привело к высыханию среды в лунках планшета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг, и нарушение может привести к тому, что экспланты сместятся со своего места. Если эксплантные детали сместились со своего места во время переноса среды, попробуйте прикрепить их обратно, полностью удалив среду и позволив ей прилипнуть к поверхности лунки. Средства следует осторожно добавлять вдоль стенки лунки, не беспокоя экспланты, иначе они могут снова отсоединиться. Регулярно наблюдайте за планшетами с клеточными культурами под перевернутым микроскопом (4-кратное или 10-кратное увеличение). Идентифицируйте DPSC по их способности прилипать к пластиковой поверхности и веретенообразной морфологии.
  9. Как только достаточное количество клеток мигрирует из эксплантов, удалите ткани и позвольте клеткам размножаться и достигать оптимального 70%-75% слияния клеток перед субкультивированием. Объем α-MEM, содержащего 10% FBS, может быть увеличен до 2 мл на этом этапе, чтобы клетки могли делиться быстрее. На этом этапе меняйте носители каждый третий день.

3. Расширение DPSC

  1. Дважды промойте сливающуюся колбу с культурой T75 (конфлюенция: 70%-80%) DPSC PBS (10 мл).
  2. Добавьте 2,5 мл 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) на боковую сторону колбы Т75 и осторожно взболтайте ее, чтобы трипсин-ЭДТА покрывал весь клеточный лист или монослой DPSC.
  3. Держите колбу внутри вытяжки при температуре 37 °C в течение 3-5 минут. Через 3 минуты аккуратно постучите по колбе, чтобы обеспечить диссоциацию клеток.
  4. Добавьте 5 мл полной среды (α-MEM с 10% FBS) или 250 мкл FBS (10% от используемого объема трипсина) в качестве нейтрализующего агента для инактивации активности трипсина. Перенесите всю клеточную суспензию диссоциированных DPSC в свежую коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
  5. Центрифугируйте диссоциированные клетки при давлении 500 x g в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы получить клеточную гранулу.
  6. Отасуньте всю надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 5-10 мл PBS в колбу для сбора остатков клеток, промойте ячейку PBS с помощью щадящего пипетирования и снова центрифугируйте клетки при 500 x g в течение 2 минут. При необходимости повторите.
  7. Повторно суспендируйте клеточную таблетку в 1 мл полной среды (α-MEM с 10% FBS) после тщательного удаления надосадочной жидкости и выполнения щадящего пипетирования для получения одноклеточной суспензии.
  8. Разделите клетки и засейте их (равным объемом) в две колбы для культур T75, каждая из которых содержит 10 мл полной полной среды. Держите колбу внутри вытяжки при температуре 37 °C.
  9. На следующий день отсасывайте из среды и замените ее свежей готовой средой.
    Примечание: Длительное лечение трипсином может нарушить целостность клеток, жизнеспособность и функцию клеток из-за расщепления белка клеточной поверхности и белка внеклеточного матрикса.

4. Идентификация фенотипических маркеров стволовых клеток (время: 90 - 120 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения характеристик клеток, полученных из пульповой ткани, используйте клетки между третьим и пятым пассажем.

  1. Используйте две 70%-80% (~3-4 x 106 клеток; подсчитайте клетки с помощью цитометра или гемоцитометра на основе изображения) слитые колбы с культурой T75 DPSC и дважды промойте клетки 10 мл PBS.
  2. Добавьте 2,5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и подержите колбу внутри колбы при температуре 37 °C в течение 3-5 минут. Добавьте 5 мл готовой среды или 250 мкл FBS (10% от используемого объема трипсина) в качестве нейтрализующего агента для инактивации активности трипсина.
  3. Соберите клетки с помощью пипетки в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте диссоциированные клетки при давлении 500 x g в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы получить клеточную гранулу.
  4. Отсадите всю надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 5 мл PBS в колбу для сбора остатков клеток, промойте ячейку PBS с помощью щадящего пипетирования и снова центрифугируйте клетки при 500 x g в течение 2 минут.
  5. После осторожного удаления надосадочной жидкости суспендируйте гранулу в 1 мл PBS и выполните щадящее пипетирование для получения одноклеточной суспензии.
  6. Подсчитайте клетки с помощью цитометра или гемоцитометра на основе изображения, в зависимости от наличия, и распределите их по микроцентрифужным пробиркам в соотношении 1 x 104 клеток/пробирку. Инкубируйте клетки в 0,5%-1% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в течение 0,5-1 ч.
  7. В каждую пробирку добавляют 1-2 мкл флуоресцеина изотиоцианата (FITC)- и фикоэритрина (ПЭ)-конъюгированных антител для кластерных маркеров дифференцировки (CD) (т.е. CD90 [0,4 мкг], CD73 [0,8 мкг], CD105 [0,4 мкг], CD34 [0,8 мкг], CD45 [0,4 мкг] и HLA-DR [0,08 мкг])6,7,8,9 и инкубируют в течение 0,5 ч в темноте при комнатной температуре.
  8. Через 0,5 ч гранулируйте ячейки центрифугированием при давлении 500 x g в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, запивайте гранулы клеток PBS, и снова центрифугируйте.
  9. После центрифугирования гранулу ресуспендировать в PBS (200 мкл/пробирка), перенести клеточную суспензию в пробирки проточной цитометрии и получить их с помощью проточного цитометра. Любое коммерческое программное обеспечение может быть использовано для дальнейшего анализа процента положительных клеток на различные антитела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги с 4.7 по 4.9 должны выполняться в темноте при комнатной температуре. Следует использовать надлежащий контроль изотипа и неокрашенные образцы, чтобы исключить фоновую флуоресценцию клеток.

5. Дифференциация DPSC на несколько линий

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 75%-80% конфлюентных культур DPSC на третьем-пятом пассажах для оценки мультипотентности. Контрольную группу клеток, содержащую α-MEM, следует использовать для всех описанных ниже типов дифференцировки.

  1. Остеогенная дифференциация DPSC, окрашивание ализарином в красный цвет и количественное определение
    1. Изготовьте суспензию для одиночных клеток с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА, как описано выше в шаге 4.2, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в полном α-MEM.
    2. Подсчитайте клетки и засейте их в 24-луночные планшеты, обработанные культурой тканей, с плотностью 2 x 104 клеток/лунку, содержащие 0,4-0,5 мл готовой среды в течение 48 ч при 37 °C и 5%CO2.
    3. Через 48 ч удалите среду из лунок и добавьте 0,4-0,5 мл остеогенной индуктивной среды (т.е. α-МЕМ с остеогенными индуктивными факторами, такими как бета-глицерофосфат [5 мМ], монокалийфосфат [1,8 мМ] и дексаметазона динатрийфосфат [0,01 мМ])8. Подготавливают контрольные лунки (неиндуцированные клетки), содержащие только полный α-МЭМ без остеогенных индуктивных факторов (контрольных сред).
      Примечание: Добавление 50 μМ аскорбата, как сообщается, также усиливает остеогенную дифференцировку 30,31. После каждых третьих суток заменяйте индукционные среды и контрольные среды свежими средами и культурой в течение 21 дня (3 недели). По окончании индукционного периода удалите среду из питательных планшетов, добавьте 0,5 мл PBS и промойте два раза.
    4. После промывки PBS зафиксировать клетки в 0,5 мл 10% нейтрального буферизованного раствора формалина (НБФ) на 20-30 минут при комнатной температуре. Выполните фиксацию в вытяжном/химическом колпаке.
  2. Ализарин красное окрашивание
    1. Приготовьте краситель для ализарина красного S (2%), растворив 1 г ализарина красного S в 50 мл дважды дистиллированной воды (ddH2O) и отрегулировав pH до 4,0-4,2 с помощью соляной кислоты (HCL) или гидроксида аммония (NH4OH). Процедите пятно с помощью фильтровальной бумаги. Храните пятно в темноте (4 °C).
    2. Дважды промойте клетки двойной дистиллированной водой (ddH2O), добавьте ализарин красный S краситель и выдержите при комнатной температуре в течение 30-45 минут.
    3. Удалите пятно из всех лунок и промойте ячейки четыре или пять раз с ddH2O, чтобы удалить несвязанное пятно. Делайте снимки с помощью светлопольного микроскопа.
  3. Экстракция красного пятна Ализарин для количественного анализа
    1. Добавьте в окрашенные лунки буфер цетилпиридиния хлорида (ЦПХ) (pH 7,0) (0,4 мл/лунку) и инкубируйте клетки в течение 2 ч при 37 °C. Кроме того, клетки также могут быть инкубированы с 10% уксусной кислотой для надлежащего растворения красных кристаллов ализарина32. Держите пластины на качалке или шейкере.
    2. После инкубации соберите надосадочную жидкость (экстрагированный краситель), перенесите ее в 96-луночный планшет и считайте планшет или образцы при длине волны 405 нм. Чтобы получить пустое значение, добавьте только буфер CPC (того же объема) и прочтите32,33 .

6. Адипогенная дифференциация DPSC, окрашивание масляным красным O и количественное определение

ПРИМЕЧАНИЕ: Начальные этапы посева такие же, как и выше (т.е. стадия остеогенной дифференцировки 5.1).

  1. Через 48 ч удалите среду из лунок и добавьте 0,4-0,5 мл адипогенной индуктивной среды (т.е. α-МЕМ с адипогенными индуктивными факторами, такими как изобутилметилксантин [IBMX; 0,5 мМ], дексаметазон [1 мкМ], индометацин [200 мкМ] и инсулин [10 мкМ])8. Подготовить контрольные лунки, содержащие неиндуцированные клетки (т.е. культивируемые только в α-MEM без индуктивных факторов {контрольная среда]).
  2. Пополняйте среду каждый третий день и культивируйте клетки в течение 3 недель. Через 3 недели отсасывайте среду из культуральных планшетов и добавьте 0,5 мл PBS для двукратной промывки клеток.
  3. После промывки PBS зафиксируйте ячейки в 10% растворе NBF на 20-30 минут при комнатной температуре.
  4. Дважды промойте клетки двойной дистиллированной водой (ddH2O), добавьте масло красного цвета O и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30-40 минут.
  5. Удалите пятно со всех лунок и многократно промойте лунки, содержащие клетки, ddH2O до прозрачности (от двух до четырех раз). Наблюдайте под микроскопом и делайте снимки.
  6. Экстракция красного масла O для количественного анализа
    1. Добавьте 0,4 мл 100% 2-пропанола в окрашенные лунки и инкубируйте при комнатной температуре, надлежащим образом накрыв планшет на 30 минут. Держите тарелку на качалке или шейкере.
    2. После инкубации соберите надосадочную жидкость, перенесите ее на 96-луночный планшет, считайте планшет или образцы при 510 нм. Для вырубки используйте 100% 2-пропанол.

7. Хондрогенная дифференциация DPSC, окрашивание альцианским синим цветом и количественное определение

Примечание: Хондрогенная дифференцировка была индуцирована в монослойной культуре DPSC. Начальные этапы посева такие же, как и выше (т.е. этап остеогенной дифференцировки 5.1).

  1. Через 48 ч удалите среду из лунок и добавьте 0,4-0,5 мл хондрогенной индукционной среды (т.е. α-МЕМ с индуктивными факторами, специфичными для хондрогенной дифференцировки, аскорбиновую кислоту [0,2 М], пируват натрия [1 мМ], трансформирующий фактор роста-бета-3 [TGF-β3; 10 мкМ], дексаметазон [1 мМ] и 1x премикс ИТС [инсулин, трансферрин и селенозная кислота)10. Готовят контрольные лунки, содержащие неиндуцированные клетки (т.е. культивируемые только в α-MEM без индуктивных факторов [контрольные среды]).
  2. Пополняйте среду каждый третий день и культивируйте клетки в течение 3 недель. После окончания индукционного периода аспирировать среду из культуральных планшетов и добавить 0,5 мл PBS для двукратной промывки клеток.
  3. После промывки PBS зафиксируйте ячейки в 10% растворе NBF на 15-20 минут при комнатной температуре. Промойте клетки два или три раза двойной дистиллированной водой (ddH2O), добавьте морилку альцианского синего цвета и выдерживайте при комнатной температуре в течение 45 минут.
  4. Удалите пятно из всех лунок, после чего прополощите 0,1 Н HCL два или три раза. Промойте ячейки четыре раза или дайте раз с ddH2O.
  5. Понаблюдайте за клетками на наличие протеогликанов (синего цвета) под микроскопом и сделайте снимки.
  6. Для количественного определения алкийского синего извлеките краситель с помощью 6 М гуанидин-HCl и считайте образцы при оптической плотности (OD) 595 нм. Набор Alcian blue, используемый в этом исследовании, окрашивает кислые протеогликаны в хрящах и специально связывает сульфатированные гликозаминогликаны (ГАГ), присутствующие в матрице хондроцитов10.

8. Дифференциация DPSC в сторону печеноподобной линии и характеристика

  1. Сделайте одноклеточную суспензию клеток путем обработки трипсином, как описано выше, и ресуспендируйте клеточную гранулу в полном α-MEM.
  2. Подсчитайте клетки и засейте их в 24-хорошо обработанные культуральные планшеты в соотношении 2 x 104 клеток /лунку, содержащую 0,4-0,5 мл готовой среды в течение 48 ч.
  3. Через 48 ч извлеките среду из лунок и инкубируйте клетки с печеночной индукционной средой в течение 14 дней. Индукционная среда состоит из модифицированной орлиной среды (DMEM) с низким содержанием глюкозы, содержащей дексаметазон (0,5 мкМ), эпидермальный фактор роста (EGF; 2 нг/мл), премикс ITS+ (50 мг/мл) и фактор роста гепатоцитов (HGF; 20 нг/мл) 6.
  4. Через 14 дней замените среду средой для созревания еще на 14 дней (α-МЭМ с добавлением онкостатина М [OSM; 20 нг/мл], премикса ITS [50 мг/мл] и дексаметазона [0,5 мкМ]) 6. Пополняйте среды свежими средами после каждого третьего дня.
  5. Выполните иммуногистохимический анализ и анализ липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) для подтверждения печеночной дифференцировки.
    1. Поглощение ЛПНП и иммунофлуоресцентное окрашивание рецепторов ЛПНП
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постдифференцировку гепатоцитоподобных клеток характеризовали с помощью набора для анализа поглощения ЛПНП в соответствии с инструкциями к набору. Флуорохром ЛПНП-550 использовали для оценки поглощения ЛПНП в дифференцированных клетках в живом состоянии, а антитело к рецептору ЛПНП использовали для обнаружения рецепторов ЛПНП в дифференцированных клетках после фиксации.
      1. После дифференцировки живые клетки окрашивают ЛПНП-550 (1:100) в течение 3-4 часов. Через 3-4 ч замените окрашивающий раствор питательной средой и наблюдайте за поглощением ЛПНП под флуоресцентным микроскопом, способным возбуждать и испускать пропидий йодид (ПИ) на длинах волн 537 и 617 нм соответственно.
      2. Зафиксируйте клетки в фиксирующем растворе на 10 мин. После фиксации клеток заблокируйте клетки в блокирующем растворе на 30 минут.
      3. Инкубируйте клетки с первичным антителом к рецептору ЛПНП в течение 1 ч, промывайте 1x PBS три раза, а затем инкубируйте с 488 вторичным антителом (1:100) в течение 1 ч в темноте.
      4. Промойте клетки PBS три раза, чтобы удалить избыток вторичного антитела. Добавьте 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в качестве ядерного красителя.
      5. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа, способного измерять длины волн в диапазоне возбуждения/излучения DAPI, PI и FITC.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры интенсивности отдельных клеток могут быть записаны для количественной оценки экспрессии антител рецептора ЛПНП и поглощения ЛПНП. Для иммунофлуоресцентного окрашивания следует использовать надлежащий контроль вторичных антител, чтобы исключить фоновую флуоресценцию, возникающую только из вторичного антитела.

9. Нейронная дифференцировка DPSC в сторону нейроноподобной линии и характеризация

  1. После осаждения клеток, как описано выше, культивируют клетки в α-MEM в течение 48 ч.
  2. Аспирируйте среду и замените ее нейробазальной средой, содержащей факторы роста, такие как 0,5% добавка G5, 0,2% добавка N2, эпидермальный фактор роста 20 нг/мл, основной фактор роста фибробластов 20 нг/мл и добавка B27 (1%). Культивируют клетки в этой среде в течение 25-41 дня7.
  3. Меняйте среду каждые вторые или третьи сутки, в зависимости от ее метаболизма клетками. Для достижения эффективного созревания нейронов и большего количества нейронов, ассоциированных с микротрубочками-2 (MAP-2+), удалите EGF и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) после стадии индукции нейронов (14 дней).
    Примечание: Со временем и после многократного изменения среды дифференцированные нейроны могут демонстрировать отслоение от лунок пластины из-за низкой адгезии, что приводит к потере нейронов в долгосрочной культуре. Чтобы этого избежать, покройте лунки пластины ламинином или фибронектином (по желанию).
  4. Проведение иммуногистохимического анализа для подтверждения нейроноподобной дифференцировки.
    1. Иммуноокрашивание дифференцированных DPSC
      Примечание: Для подтверждения нейроноподобной дифференцировки DPSC в дифференцированных клетках проводили иммуноцитохимию с использованием антител к MAP-2 и нейрофиламентам (NFM), которые представляют собой нейрогенные линии-специфичные белки7.
      1. Удалите питательные среды после завершения дифференцировки. Добавьте PBS, аккуратно покрутите пластину и удалите PBS с помощью пипетки. Повторите этот шаг.
      2. Зафиксируйте клетки с помощью 10% НБФ или 4% параформальдегида на 20-30 мин при комнатной температуре.
      3. Снимите фиксатор и промойте ячейки 1x PBS два или три раза. Добавьте раствор для пермеабилизации (Тритон-Х-100; 0,1%) и инкубируйте клетки в течение 5 минут.
      4. Промывайте PBS два или три раза и блокируйте клетки 0,5%-1% блокирующим агентом (BSA) на 1 час при 37 °C или на ночь при 4 °C. Удалите блокирующее средство и промойте клетки 1x PBS.
      5. Инкубируйте клетки в течение ночи с первичным антителом (полученным в 0,1% BSA, NFM [1:50] и MAP-2 [1:200]).
      6. Удалите первичное антитело и промойте клетки 1x PBS три или четыре раза, чтобы удалить несвязанные антитела.
      7. Добавьте вторичное антитело (кролик против мыши 1:2000) и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч в темноте. Промойте клетки PBS (два-три раза).
      8. Инкубируйте клетки в DAPI в течение 10 минут и снова промойте PBS. Сохраняйте остаточный объем, чтобы избежать высыхания образца. Наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.
        Примечание: Кроме того, для получения лучшего представления о чистоте и функциональности клеток можно также провести оценку стабильности кариотипа10 и характеристику старения.

Результаты

В этой статье мы описываем, как исследователи могут создать чистую культуру DPSC с помощью методаэкспланта 6,7,8,9,10 и побудить их к нескольким линиям, чтобы установить чистоту культуры для последующего применения.

Обсуждение

Стволовые клетки связывают надежды на излечение многих болезней благодаря своей пластичности, прочности, иммуномодулирующим свойствам, паракринным механизмам и эффективности самонаведения. Ткань пульпы зуба считается самым мощным и ценным источником стволовых клеток, обладающих вы...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии финансового или нефинансового конфликта интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность за финансовую поддержку AK со стороны Департамента исследований в области здравоохранения (DHR), ICMR, правительства Индии (грант DHR-NRI # R.12015/01/2022-HR). SR получил финансирование от ICMR, правительство Индии (грант # 2020-7593/SCR-BMS), а PS получил стипендию от CSIR, правительство Индии. Мы также благодарны г-же Сандхье Тохи и г-же Бхупиндер Каур за помощь в проточной цитометрии, а также центральному яду сложных приборов (CSIC) и PGIMER, Чандигарх, за предоставленную инфраструктурную поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well cell culture plateCostar3516For cell culture
Alcian blue stainEZstain chondrocyte staining kit, HiMediaCCK029
alizarin red S stainSigma-AldrichTMS-008Osteogenic stain
Antibiotic cocktailHimediaA002-5X50MLTo prevent culture contamination
Ascorbic AcidHimediaTC094-25GChondrogenic induction
B27 supplementGibco17504044For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)GibcoPHG0024For neural induction
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)Sigma-Aldrich1104006For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodiumSigma-AldrichD1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineHimediaTS1006-5LFor washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)GibcoPHG0311For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscopeInvitrogenFor  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kitHimediaCCK029-1KTChondro stain Kit
FACS Canto flow cytometerBD BiosciencesFor cell characterization
Fetal Bovine SerumGibco16000044For primary culture
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442For cell culture
G5 supplementGibco17503012For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)Sigma-AldrichH1404For hepatic Induction
HLA-DRBiolegend307605
 Human TGF-β3Peprotech#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premixSigma-AldrichI3146For hepatic Induction
ITS premixCorning354350
LDL Uptake Assay kitAbcamab133127For hepatic characterization
Low glucose DMEMGibco11885-084For hepatic induction
MAP2 antibodySigma-AldrichM4403For neural characterization
N2 supplementGibco17502048For neural induction
Neural Basal MediaGibco21103049For neural induction
NFM antibodySigma-AldrichN4142For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscopeNikonFor  fluorescence imaging
Oil Red OSigma-Aldrich01391-250MlAdipogenic stain
Oncostatin MR&D Systems295-OM-010/CFFor hepatic Induction
PetridishTarson460090-90MMFor tissue cutting
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich15655-100GOsteogenic induction
Propan-2-olThermo FisherQ13827For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solutionSigma life sciencesS8636-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049For cell passaging
Whatman filter papermerckWHA1001325filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)Sigma-AldrichM0643-10X 1LMedia for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422-50G

Ссылки

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulation Research. 124 (6), 837-839 (2019).
  3. Raik, S., Kumar, A., Bhattacharyya, S. Insights into cell-free therapeutic approach: Role of stem cell "soup-ernatant". Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (2), 104-118 (2018).
  4. Rodriguez-Fuentes, D. E., et al. Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review. Archives of Medical Research. 52 (1), 93-101 (2021).
  5. Yamazaki, K., Kawabori, M., Seki, T., Houkin, K. Clinical trials of stem cell treatment for spinal cord injury. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3994 (2020).
  6. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific Reports. 7 (1), 15015 (2017).
  7. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  8. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome proteins regulate comparative osteogenic and adipogenic potential in bone marrow and dental stem cells. Biochimie. 155, 129-139 (2018).
  9. Kumar, A., Bhattacharyya, S., Rattan, V. Effect of uncontrolled freezing on biological characteristics of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Bank. 16 (4), 513-522 (2015).
  10. Raik, S., et al. Assessment of post-thaw quality of dental mesenchymal stromal cells after long-term cryopreservation by uncontrolled freezing. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (2), 728-743 (2020).
  11. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  12. Tsutsui, T. W. Dental pulp stem cells: advances to applications. Stem Cells and Cloning. 13, 33-42 (2020).
  13. Huang, G. T. -. J., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  14. La Noce, M., et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. Journal of Dentistry. 42 (7), 761-768 (2014).
  15. Xiao, L., Tsutsui, T. Characterization of human dental pulp cells-derived spheroids in serum-free medium: stem cells in the core. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2624-2636 (2013).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 87, 101011 (2022).
  17. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26 (3), 638-645 (2008).
  18. Yong, Z., et al. Comparison of the angiogenic ability between SHED and DPSC in a mice model with critical limb ischemic. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (4), 861-870 (2022).
  19. Zhang, X. M., et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cell transplantation in a rat model of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 16 (5), 893-898 (2021).
  20. Kabir, R., et al. Imperative role of dental pulp stem cells in regenerative therapies: a systematic review. Nigerian Journal of Surgery. 20 (1), 1-8 (2014).
  21. Kumar, A., et al. Dental pulp stem cell secretome ameliorates d-galactose induced accelerated aging in rat model. Cell Biochemistry and Function. 40 (5), 535-545 (2022).
  22. Hirata, M., et al. Multifaceted therapeutic benefits of factors derived from dental pulp stem cells for mouse liver fibrosis. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1416-1424 (2016).
  23. Fujii, Y., et al. regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 24 (2018).
  24. Ferrua, C. P., et al. How has dental pulp stem cells isolation been conducted? A scoping review. Brazilian Oral Research. 31, e87 (2017).
  25. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica. 65 (3), 124-133 (2019).
  26. Tatullo, M., Marrelli, M., Shakesheff, K. M., White, L. J. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 1205-1216 (2015).
  27. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  28. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), e12334 (2017).
  29. Aryal Ac, S., Islam, M. S., Samsudin, A. R. Investigation of the effect of a time delay on the characteristics and survival of dental pulp stem cells from extracted teeth. Archives of Oral Biology. 119, 104896 (2020).
  30. Langenbach, F., Handschel, J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 117 (2013).
  31. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 64 (2), 295-312 (1997).
  32. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the alizarin red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. International Journal of Molecular Sciences. 24 (1), 723 (2022).
  33. Coe, C. L., Lubach, G. R., Schneider, M. L., Dierschke, D. J., Ershler, W. B. Early rearing conditions alter immune responses in the developing infant primate. Pediatrics. 90, 505-509 (1992).
  34. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcified Tissue International. 88 (2), 130-141 (2011).
  35. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 26 (7), 1787-1795 (2008).
  36. Kim, B. C., et al. Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 235-244 (2012).
  37. Ge, J., et al. Distal C terminus of CaV1.2 channels plays a crucial role in the neural differentiation of dental pulp stem cells. PLoS One. 8 (11), e81332 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены