Culture primaire de cellules souches de la pulpe dentaire

Résumé

Cet article fournit un guide par étapes pour établir une culture primaire de cellules souches de pulpes dentaires à l’aide de la méthode de culture d’explants et la caractérisation de ces cellules basée sur les directives de l’ICSCRT. Les cellules isolées par ce protocole peuvent être considérées comme des cellules souches mésenchymateuses pour d’autres applications.

Résumé

La pulpe dentaire humaine représente un réservoir de cellules souches multipotentes prometteur avec une compétence régénérative prééminente qui peut être récoltée à partir d’une dent extraite. L’origine ecto-mésenchymateuse dérivée de la crête neurale des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) confère un haut degré de plasticité qui doit à ses multiples avantages dans la réparation et la régénération des tissus. Il existe diverses façons pratiques de récolter, de conserver et de faire proliférer les cellules souches adultes à l’étude pour leur utilisation en médecine régénérative. Dans ce travail, nous démontrons l’établissement d’une culture primaire de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu dentaire par la méthode de la culture d’explants. Les cellules isolées étaient en forme de fuseau et adhéraient à la surface en plastique de la plaque de culture. La caractérisation phénotypique de ces cellules souches a montré une expression positive des marqueurs de surface cellulaire recommandés par la société internationale de thérapie cellulaire (ISCT) pour les CSM, tels que CD90, CD73 et CD105. De plus, l’expression négligeable des marqueurs hématopoïétiques (CD45) et endothéliales (CD34), et l’expression inférieure à 2 % des marqueurs HLA-DR, ont confirmé l’homogénéité et la pureté des cultures DPSC. Nous avons également illustré leur multipotence basée sur la différenciation en lignées adipogènes, ostéogéniques et chondrogéniques. Nous avons également induit ces cellules à se différencier en cellules de type hépatique et neuronal en ajoutant des milieux de stimulation correspondants. Ce protocole optimisé aidera à la culture d’une population hautement extensible de cellules souches mésenchymateuses qui seront utilisées en laboratoire ou pour des études précliniques. Des protocoles similaires peuvent être incorporés dans des configurations cliniques pour la pratique de traitements basés sur le DPSC.

Introduction

Les cellules souches adultes sont devenues un outil thérapeutique puissant pour les traitements et les thérapies dirigés contre les cellules en raison de leur plasticité, de leurs mécanismes paracrines et de leurs propriétés immunomodulatrices ^1,2,3. Les données encourageantes des études précliniques basées sur les cellules souches ont inspiré les chercheurs à travailler pour la traduction du laboratoire au chevet du patient. Le type de cellules souches utilisé pour la thérapie par cellules souches joue un rôle important dans les résultats positifs. Dans les études précliniques et cliniques, la source la plus largement rapportée de cellules souches mésenchymateuses (CSM) reste la moelle osseuse ^4,5. Cependant, les principaux inconvénients de l’utilisation de cellules souches dérivées de la moelle osseuse (BMSC) comprennent leur population rare, des procédures d’isolement très invasives et leur capacité limitée à se développer. Par conséquent, d’autres sources de CSM sont à l’étude. À cet égard, les tissus dentaires, avec leur facilité d’accès, leur énorme plasticité, leur potentiel de régénération élevé et leur grande capacité de prolifération, sont maintenant considérés comme une source alternative riche et potentielle de cellules souches 6,7,8,9,10.

Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) ont été le premier type de cellules souches dentaires à être isolé et caractérisé par Gronthos en 2000¹¹. Les DPSC ont attiré l’attention pour les applications d’ingénierie tissulaire en raison de leur taux de prolifération élevé, de leur potentiel de différenciation significatif, de leur facilité d’accès avec une culture sans effort et, surtout, de leur capacité à être obtenues à partir d’une dent jetée sans aucun souci éthique¹². Les limites posées par d’autres sources de cellules souches, telles que les BMSC et les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC), dans leur isolement et leurs capacités d’auto-renouvellement insuffisantes sont contournées par les DPSC¹³. Les DPSC humaines peuvent être obtenues à partir de dents primaires humaines, de dents permanentes, de dents de sagesse, de dents de lait exfoliées (SHED) et de papilles apicales. De plus, les DPSC peuvent également être isolés à partir de dents surnuméraires, qui sont généralement jetées¹⁴. Les DPSC expriment des marqueurs associés à la crête neurale et ont le potentiel de se différencier en cellules neuronales in vitro et in vivo¹⁵. En plus de leur potentiel neurogène, les DPSC peuvent se différencier en d’autres lignées cellulaires, telles que ostéogéniques, chondrogéniques, adipogènes, hépatiques et myogènes, lorsqu’elles sont soumises à des conditions de différenciation spécifiques¹³. Ainsi, ces cellules multipotentes présentent un grand potentiel pour la thérapie cellulaire et peuvent être utilisées pour la régénération de divers tissus. Des études ont également rapporté le rôle potentiel des DPSC dans la reconstruction de la cornée¹⁶, la réparation de l’infarctus du myocarde¹⁷ et leur rôle thérapeutique potentiel dans des maladies telles que l’ischémie des membres¹⁸, la maladie d’Alzheimer ¹⁹, la maladie de Parkinson ²⁰ et le vieillissement²¹. Par conséquent, les cellules souches dérivées du tissu dentaire peuvent être utilisées non seulement pour la régénération dentaire, mais également pour la réparation et la régénération d’organes non dentaires comme les yeux¹⁶, les cœurs¹⁷, les foies²², les os²³ , etc.

Il existe deux méthodes particulières pour isoler une population de CSM à partir du tissu pulpaire : la digestion enzymatique et la culture d’explants^24,25. L’établissement réussi de cultures primaires sans aucune différence significative dans la quantité et les propriétés des DPSC a été signalé par ces deux méthodes²⁶. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’isolement des DPSC par la méthode de l’explant²⁷, car cette méthode génère des DPSC sans contamination des cellules hématopoïétiques et endothéliales, par rapport à la digestion enzymatique qui peut entraîner une contamination des fibroblastes²⁸.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans l’étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Institut (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) de PGIMER, Chandigarh. Toutes les expériences liées à la culture cellulaire doivent être réalisées dans une enceinte de sécurité biologique (BSC) de classe II selon une technique aseptique. La pulpe dentaire a été obtenue à partir de dents saines de trois patients (F/14, M/14 et M/20) subissant des extractions de la troisième molaire pour des raisons orthodontiques. Avant le prélèvement de l’échantillon, le consentement éclairé écrit du patient/tuteur a été obtenu, conformément aux directives fournies par le comité d’éthique du PGIMER, Chandigarh.

1. Mise en place d’une culture primaire de cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) à partir de tissus dentaires humains

REMARQUE : Les dents cariées ne doivent pas être utilisées.

1. Prélèvement et transport des échantillons de pulpe dentaire au laboratoire de culture tissulaire
   1. Effectuer une procédure d’extraction dentaire dans des conditions non traumatiques et aseptiques. Rincez abondamment la dent extraite avec une solution saline stérile pour éliminer les restes de sang.
   2. Coupez longitudinalement la dent extraite en deux morceaux à l’aide d’une fraise à fissure en carbure avec irrigation constante avec une solution saline normale stérile pour exposer la pulpe.
   3. Transportez la dent extraite ainsi que la pulpe intacte dans un milieu essentiel stérile α-minimum (α-MEM) maintenu sur de la glace jusqu’au laboratoire de culture cellulaire et tissulaire.
      REMARQUE : Idéalement, traitez tous les échantillons reçus dans les 2 h pour la culture cellulaire. Cependant, un rapport récent a suggéré que le traitement de l’échantillon de dent, même après 24 heures, n’a pas affecté la viabilité et la prolifération des DPSC, mais a réduit leur fonctionnalité²⁹.

2. Retrait du tissu pulpaire de la dent et culture cellulaire de DPSC (temps : 60-120 min)

REMARQUE : Toutes les étapes après le transport des dents ont été effectuées dans le laboratoire de culture cellulaire et tissulaire à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité de niveau 2.

1. Placez l’échantillon de dent dans des boîtes de Pétri de culture stérile et rincez-le abondamment (trois ou quatre fois) avec 1 solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
2. Retirez soigneusement le tissu pulpaire de la cavité pulpaire à l’aide d’une excavatrice bien aiguisée et d’une pince.
3. Une fois la pulpe retirée, nettoyez-la soigneusement avec du PBS stérile pour éliminer tout reste de sang.
4. Coupez le tissu pulpaire en petits morceaux d’environ 2-3 mm à l’aide d’une lame chirurgicale dans une boîte de Pétri.
   1. Divisez la surface du plat en quatre parties en mettant 1 à 2 ml de PBS stérile dans chaque zone. Placez l’échantillon de tissu pulpaire dans une zone avec du PBS et coupez le tissu en morceaux les plus petits possibles avec une lame chirurgicale (plus le morceau est petit, plus il sera facile pour les cellules souches de migrer hors du tissu). Après cela, transférez chaque morceau en le soulevant dans une autre zone avec du PBS, et ainsi de suite jusqu’à la quatrième zone, afin que les morceaux de tissu soient correctement lavés et exempts de tout contaminant.
5. Entre-temps, versez environ 0,8 à 1 ml de α-MEM contenant des acides aminés non essentiels avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et un cocktail d’antibiotiques (c’est-à-dire de la pénicilline et de la streptomycine) dans les puits d’une plaque à 6 puits. Répartissez uniformément le média en déplaçant la plaque, de manière à l’étaler uniformément sur la surface du puits.
6. Ensemencez les petits morceaux de pulpe ou d’explants à l’aide d’une pince dans un seul puits (quatre à six morceaux par puits) de la plaque à 6 puits et gardez la plaque intacte pendant 5 minutes dans une hotte de biosécurité.
   REMARQUE : Cette étape permet/facilite l’adhérence des tissus/explants aux surfaces traitées des plaques de culture.
7. Maintenir la plaque de culture dans une atmosphère humidifiée avec une température de 37 °C et _{un taux de} CO₂ de 5 %.
8. Le lendemain, aspirez soigneusement le média des puits sans déranger les explants et ajoutez-y un média frais. Changez le support tous les deux jours à cette étape pour éviter le dessèchement. Assurez-vous que l’incubateur a suffisamment d’eau dans le plateau afin qu’une évaporation supplémentaire ne provoque pas le dessèchement du média dans les puits de la plaque.
   REMARQUE : Il s’agit d’une étape très cruciale, et les perturbations peuvent faire déloger les explants de leur position. Si les morceaux d’explant sont délogés de leur position pendant le transfert du support, essayez de les rattacher en retirant complètement le support et en le laissant adhérer à la surface du puits. Le média doit être soigneusement ajouté le long de la paroi du puits sans déranger les explants, sinon ils pourraient se détacher à nouveau. Observez régulièrement les plaques de culture cellulaire sous un microscope inversé (grossissement de 4x ou 10x). Identifier les DPSC par leur capacité à adhérer à la surface plastique et leur morphologie en forme de fuseau.
9. Une fois qu’un nombre suffisant de cellules migrent des explants, retirez les tissus et permettez aux cellules de proliférer et d’atteindre la confluence cellulaire optimale de 70 % à 75 % avant de les sous-cultiver. Le volume de α-MEM contenant 10 % de FBS peut être augmenté à 2 mL à cette étape afin que les cellules puissent se diviser plus rapidement. Changez de support tous les trois jours à ce stade.

3. Expansion de la DPSC

1. Laver deux fois le ballon de culture confluent T75 (confluence : 70 % à 80 %) des DPSC avec du PBS (10 mL).
2. Ajoutez 2,5 ml d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % sur le côté du ballon T75 et agitez-le doucement pour vous assurer que la trypsine-EDTA recouvre toute la feuille cellulaire ou la monocouche de DPSC.
3. Maintenir la gourde à l’intérieur de la hotte à 37 °C pendant 3 à 5 min. Au bout de 3 min, tapotez doucement le ballon pour assurer la dissociation des cellules.
4. Ajouter 5 mL de milieu complet (α-MEM avec 10 % de FBS) ou 250 μL de FBS (10 % du volume de trypsine utilisé) comme agent neutralisant pour inactiver l’activité de la trypsine. Transférez la suspension cellulaire entière de DPSC dissociés dans un tube à centrifuger conique frais de 15 ml.
5. Centrifuger les cellules dissociées à 500 x g pendant 2 min à température ambiante pour obtenir la pastille cellulaire.
6. Aspirer tout surnageant à l’aide de la pipette, ajouter 5 à 10 mL de PBS dans le ballon pour recueillir les cellules restantes, laver la cellule dans du PBS avec un pipetage doux, puis centrifuger à nouveau les cellules à 500 x g pendant 2 min. Répétez l’opération si nécessaire.
7. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet (α-MEM avec 10 % de FBS) après avoir soigneusement retiré le surnageant et effectué un pipetage doux pour obtenir une suspension unicellulaire.
8. Divisez les cellules et ensemencez-les (volume égal) dans deux flacons de culture T75 contenant chacun 10 mL de milieu complet. Maintenez la gourde à l’intérieur de la hotte à 37 °C.
9. Le lendemain, aspirez le support et remplacez-le par le support complet frais.
   REMARQUE : Un traitement prolongé à la trypsine peut compromettre l’intégrité, la viabilité et la fonction cellulaire en clivant la protéine de surface cellulaire et la protéine de la matrice extracellulaire.

4. Identification des marqueurs phénotypiques des cellules souches (durée : 90 - 120 min)

REMARQUE : Pour la caractérisation des cellules prélevées dans le tissu pulpaire, utilisez des cellules entre le troisième et le cinquième passage.

1. Utilisez deux flacons de culture T75 confluents de 70 % à 80 % (~3-4 x 10⁶ cellules ; comptez les cellules à l’aide d’un cytomètre basé sur l’image ou d’un hémocytomètre) de DPSC et lavez les cellules deux fois avec 10 ml de PBS.
2. Ajouter 2,5 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et maintenir le flacon à l’intérieur de la hotte à 37 °C pendant 3 à 5 min. Ajouter 5 mL de milieu complet ou 250 μL de FBS (10 % du volume de trypsine utilisé) comme agent neutralisant pour inactiver l’activité de la trypsine.
3. Prélever les cellules à l’aide d’une pipette dans un tube à centrifuger conique de 15 ml. Centrifuger les cellules dissociées à 500 x g pendant 2 min à température ambiante pour obtenir la pastille cellulaire.
4. Aspirez tout surnageant à l’aide de la pipette, ajoutez 5 mL de PBS dans le ballon pour recueillir les cellules restantes, rincez la cellule dans du PBS avec un pipetage doux, puis centrifugez à nouveau les cellules à 500 x g pendant 2 min.
5. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS après avoir soigneusement retiré le surnageant et effectuer un pipetage doux pour obtenir une suspension unicellulaire.
6. Comptez les cellules à l’aide d’un cytomètre basé sur l’image ou d’un hémocytomètre, selon la disponibilité, et répartissez-les dans des tubes de microcentrifugation à raison de 1 x 10⁴ cellules/tube. Incuber les cellules dans 0,5 à 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 0,5 à 1 h.
7. Dans chaque tube, ajouter 1 à 2 μL d’anticorps conjugués à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et à la phycoérythrine (PE) pour les marqueurs de groupe de différenciation (CD) (c.-à-d. CD90 [0,4 μg], CD73 [0,8 μg], CD105 [0,4 μg], CD34 [0,8 μg], CD45 [0,4 μg] et HLA-DR [0,08 μg])6,7,8,9 et incuber pendant 0,5 h dans l’obscurité à température ambiante.
8. Après 0,5 h, granuler les cellules en centrifugeant à 500 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant, lavez la pastille des cellules avec du PBS et centrifugez-la à nouveau.
9. Après la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans du PBS (200 μL/tube), transférer la suspension cellulaire dans des tubes de cytométrie en flux et les acquérir à l’aide d’un cytomètre en flux. N’importe quel logiciel commercial peut être utilisé pour analyser davantage le pourcentage de cellules positives pour divers anticorps.
   REMARQUE : Les étapes 4.7 à 4.9 doivent être effectuées dans l’obscurité à température ambiante. Des contrôles d’isotypes appropriés et des échantillons non colorés doivent être utilisés pour omettre la fluorescence de fond des cellules.

5. Différenciation DPSC en plusieurs lignées

REMARQUE : Utiliser des cultures confluentes de 75 % à 80 % de DPSC du troisième au cinquième passage pour l’évaluation de la multipotence. Un groupe de cellules de contrôle contenant de l’α-MEM doit être utilisé pour tous les types de différenciations décrits ci-dessous.

1. Différenciation ostéogénique des DPSC, coloration au rouge d’alizarine et quantification
   1. Préparez une suspension unicellulaire en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA, comme décrit ci-dessus à l’étape 4.2, et remettez en suspension la pastille cellulaire dans du α-MEM complet.
   2. Comptez les cellules et ensemencez-les dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits traitées à une densité de cellules de² x 10 cellules contenant de 0,4 à 0,5 mL de milieu complet pendant 48 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
   3. Après 48 h, retirer le milieu des puits et ajouter 0,4 à 0,5 mL de milieu inductif ostéogénique (c.-à-d. α-MEM avec des facteurs inductifs ostéogéniques tels que le bêta-glycérophosphate [5 mM], le phosphate monopotassique [1,8 mM] et le phosphate disodique de dexaméthasone [0,01 mM])⁸. Préparez des puits de contrôle (cellules non induites) contenant uniquement du α-MEM complet, sans aucun facteur inductif ostéogénique (milieux de contrôle).
      REMARQUE : L’ajout de 50 μM d’ascorbate améliorerait également la différenciation ostéogénique ^30,31. Tous les trois jours, remplacer le milieu à induction et le milieu de contrôle par des milieux frais et cultiver pendant 21 jours (3 semaines). À la fin de la période d’induction, retirer le milieu des plaques de culture, ajouter 0,5 mL de PBS et laver deux fois.
   4. Après le lavage au PBS, fixer les cellules dans 0,5 mL de solution de formol tamponné neutre à 10 % pendant 20 à 30 minutes à température ambiante. Effectuer la fixation dans une hotte de fumée/chimique.
2. Coloration rouge d’alizarine
   1. Préparez la coloration au rouge d’alizarine S (2%) en dissolvant 1 g de rouge d’alizarine S dans 50 mL d’eau doublement distillée (ddH₂O) et en ajustant le pH à 4,0-4,2 à l’aide d’acide chlorhydrique (HCL) ou d’hydroxyde d’ammonium (NH₄OH). Filtrez la tache avec du papier filtre. Stockez la tache dans l’obscurité (4 °C).
   2. Lavez les cellules deux fois avec de l’eau distillée deux fois (ddH₂O), ajoutez le colorant rouge d’alizarine S et incubez à température ambiante pendant 30 à 45 min.
   3. Enlevez la tache de tous les puits et lavez les cellules quatre ou cinq fois avec du ddH₂O pour enlever toute tache non liée. Capturez les images à l’aide d’un microscope à champ clair.
3. Extraction de la coloration rouge d’alizarine pour l’analyse quantitative
   1. Ajouter un tampon de chlorure de cétylpyridinium (CPC) (pH 7,0) dans les puits colorés (0,4 mL/puits) et incuber les cellules pendant 2 h à 37 °C. De plus, les cellules peuvent également être incubées avec 10% d’acide acétique pour la dissolution correcte des cristaux rouges d’alizarine³². Gardez les plaques sur une plaque à bascule ou un shaker.
   2. Après l’incubation, prélever le surnageant (colorant extrait), le transférer dans une plaque à 96 puits et lire la plaque ou les échantillons à 405 nm. Pour obtenir une valeur vide, ajoutez uniquement la mémoire tampon CPC (même volume) et lisez ^32,33 .

6. Différenciation adipogénique des DPSC, coloration au O rouge d’huile et quantification

REMARQUE : Les étapes initiales de l’ensemencement sont les mêmes que ci-dessus (c’est-à-dire l’étape de différenciation ostéogénique 5.1).

1. Après 48 h, retirer le milieu des puits et ajouter 0,4 à 0,5 mL de milieu inductif adipogénique (c.-à-d. α-MEM avec des facteurs inductifs adipogènes tels que l’isobutyl-méthylxanthine [IBMX ; 0,5 mM], la dexaméthasone [1 μM], l’indométacine [200 μM] et l’insuline [10 μM])⁸. Préparez des puits de contrôle contenant des cellules non induites (c’est-à-dire cultivées en α-MEM uniquement sans facteurs inductifs {milieux de contrôle]).
2. Réapprovisionnez le milieu tous les trois jours et cultivez les cellules pendant 3 semaines. Après 3 semaines, aspirez le milieu des plaques de culture et ajoutez 0,5 ml de PBS pour laver les cellules deux fois.
3. Après le lavage du PBS, fixez les cellules dans une solution NBF à 10% pendant 20 à 30 minutes à température ambiante.
4. Lavez les cellules deux fois avec de l’eau doublement distillée (ddH₂O), ajoutez la coloration rouge d’huile O et incubez à température ambiante pendant 30-40 min.
5. Enlevez la tache de tous les puits et rincez les puits contenant des cellules à plusieurs reprises avec du ddH₂O jusqu’à ce qu’ils soient clairs (deux à quatre fois). Observez au microscope et capturez des images.
6. Extraction de l’O rouge d’huile pour l’analyse quantitative
   1. Ajouter 0,4 mL de 100 % 2-propanol dans les puits colorés et incuber à température ambiante en couvrant correctement la plaque pendant 30 min. Gardez la plaque sur une plaque à bascule ou un shaker.
   2. Après l’incubation, prélever le surnageant, le transférer dans une plaque à 96 puits, lire la plaque ou les échantillons à 510 nm. Utilisez 100% de 2-propanol pour le découpage.

7. Différenciation chondrogénique des DPSC, coloration au bleu d’Alcian et quantification

REMARQUE : La différenciation chondrogénique a été induite dans la culture monocouche de DPSC. Les étapes initiales de l’ensemencement sont les mêmes que ci-dessus (c’est-à-dire l’étape 5.1 de la différenciation ostéogénique).

1. Après 48 h, retirer le milieu des puits et ajouter 0,4 à 0,5 mL de milieu d’induction chondrogénique (c’est-à-dire α-MEM avec des facteurs inductifs spécifiques de la différenciation chondrogénique, de l’acide ascorbique [0,2 M], du pyruvate de sodium [1 mM], du facteur de croissance transformant bêta-3 [TGF-β₃ ; 10 μM], de la dexaméthasone [1 mM] et 1 prémélange ITS [insuline, transferrine et acide sélénène)¹⁰. Préparez des puits de contrôle contenant des cellules non induites (c’est-à-dire cultivées en α-MEM uniquement sans facteurs inductifs [milieux de contrôle]).
2. Réapprovisionnez le milieu tous les trois jours et cultivez les cellules pendant 3 semaines. Après la fin de la période d’induction, aspirez le milieu des plaques de culture et ajoutez 0,5 ml de PBS pour laver les cellules deux fois.
3. Après le lavage du PBS, fixez les cellules dans une solution de NBF à 10 % pendant 15 à 20 minutes à température ambiante. Lavez les cellules deux ou trois fois avec de l’eau double distillée (ddH₂O), ajoutez du colorant au bleu d’Alcian et incubez à température ambiante pendant 45 min.
4. Enlevez la tache de tous les puits, puis rincez deux ou trois fois avec du HCL 0,1 N. Lavez les cellules quatre fois ou donnez fois avec ddH₂O.
5. Observez les cellules à la recherche de protéoglycanes (couleur bleue) au microscope et capturez les images.
6. Pour la quantification du bleu d’Alcian, extraire le colorant à l’aide de 6 M de guanidine-HCl et lire les échantillons à une densité optique (DO) de 595 nm. Le kit bleu Alcian utilisé dans cette étude colore les protéoglycanes acides dans le cartilage et lie spécialement les glycosaminoglycanes sulfatés (GAG) présents dans la matrice des chondrocytes¹⁰.

8. Différenciation des DPSC vers une lignée hépatique et caractérisation

1. Faites une suspension unicellulaire de cellules par traitement à la trypsine, comme décrit ci-dessus, et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un α-MEM complet.
2. Comptez les cellules et ensemencez-les dans 24 plaques de culture bien traitées à raison de 2 x 10⁴ cellules/puits contenant de 0,4 à 0,5 mL de milieu complet pendant 48 h.
3. Après 48 h, retirer le milieu des puits et incuber les cellules avec un milieu d’induction hépatique pendant 14 jours. Le milieu d’induction est constitué d’un milieu modifié de Dulbecco à faible teneur en glucose (DMEM) contenant de la dexaméthasone (0,5 μM), du facteur de croissance épidermique (EGF ; 2 ng/mL), du prémélange ITS+ (50 mg/mL) et du facteur de croissance hépatocytaire (HGF ; 20 ng/mL) ⁶.
4. Après 14 jours, remplacer le milieu par un milieu de maturation pendant 14 jours supplémentaires (α-MEM complété par Oncostatin M [OSM ; 20 ng/mL], le prémélange ITS [50 mg/mL] et la dexaméthasone [0,5 μM]) ⁶. Réapprovisionnez le média avec du milieu frais tous les trois jours.
5. Effectuer une analyse immunohistochimique et un dosage des lipoprotéines de basse densité (LDL) pour confirmer la différenciation hépatique.
   1. Absorption des LDL et coloration immunofluorescente pour le récepteur LDL
      REMARQUE : Les cellules de type hépatocytes post-différenciation ont été caractérisées par le kit de test d’absorption des LDL conformément aux instructions du kit. Le fluorochrome LDL-550 a été utilisé pour évaluer l’absorption des LDL dans les cellules différenciées à l’état vivant et l’anticorps du récepteur LDL a été utilisé pour la détection des récepteurs LDL dans les cellules différenciées après la fixation.
      1. Après la différenciation, colorer les cellules vivantes avec du LDL-550 (1:100) pendant 3-4 h. Après 3-4 h, remplacer la solution de coloration par un milieu de culture et observer l’absorption de LDL au microscope fluorescent capable d’exciter l’iodure de propidium (PI) et les longueurs d’onde d’émission à 537 et 617 nm, respectivement.
      2. Fixez les cellules dans la solution fixatrice pendant 10 min. Après la fixation des cellules, bloquez les cellules dans la solution de blocage pendant 30 min.
      3. Incuber les cellules avec un anticorps primaire du récepteur LDL pendant 1 h, laver avec 1x PBS trois fois, puis incuber avec 488 anticorps secondaires (1:100) pendant 1 h dans l’obscurité.
      4. Lavez les cellules avec du PBS trois fois pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires. Ajouter le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme colorant nucléaire.
      5. Observez les cellules au microscope à fluorescence. Prenez des images à l’aide d’un microscope fluorescent capable de mesurer les longueurs d’onde dans la gamme d’excitation/émission de DAPI, PI et FITC.
         REMARQUE : Les paramètres d’intensité d’une seule cellule peuvent être enregistrés pour quantifier l’expression des anticorps du récepteur LDL et l’absorption des LDL. Des témoins d’anticorps secondaires appropriés doivent être utilisés pour la coloration par immunofluorescence afin d’omettre la fluorescence de fond résultant de l’anticorps secondaire uniquement.

9. Différenciation neurale des DPSC vers une lignée de type neuronal et caractérisation

1. Après le placage des cellules, comme décrit ci-dessus, cultivez les cellules en α-MEM pendant 48 h.
2. Aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu neurobasal contenant des facteurs de croissance tels qu’un supplément de G5 à 0,5 %, un supplément de N2 à 0,2 %, un facteur de croissance épidermique de 20 ng/mL, un facteur de croissance des fibroblastes basiques de 20 ng/mL et un supplément de B27 (1 %). Cultivez les cellules dans ce milieu pendant 25 à 41 jours⁷.
3. Changez de milieu tous les deux ou trois jours, en fonction de son métabolisme par les cellules. Pour obtenir une maturation neuronale efficace et un plus grand nombre de neurones de la protéine 2 associée aux microtubules (MAP-2+), éliminez l’EGF et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2) après la phase d’induction neuronale (14 jours).
   REMARQUE : Au fil du temps et après des changements répétés de milieux, les neurones différenciés peuvent montrer un détachement des puits de plaque en raison d’une faible adhérence, entraînant une perte de neurones en culture à long terme. Pour éviter cela, enduisez les puits de la plaque de laminine ou de fibronectine (facultatif).
4. Effectuer une analyse immunohistochimique pour confirmer la différenciation neuronale.
   1. Immunomarquage des DPSC différenciées
      REMARQUE : Pour confirmer la différenciation neuronale des DPSC, une immunocytochimie a été réalisée dans les cellules différenciées à l’aide de MAP-2 et d’anticorps de neurofilaments (NFM), qui sont des protéines spécifiques de la lignée neurogène⁷.
      1. Retirer le milieu de culture une fois la différenciation terminée. Ajoutez du PBS, faites tourner doucement la plaque et retirez le PBS à l’aide d’une pipette. Répétez l’étape.
      2. Fixez les cellules à l’aide de 10 % de NBF ou de 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 à 30 minutes à température ambiante.
      3. Retirez le fixateur et lavez les cellules avec 1x PBS deux ou trois fois. Ajouter une solution de perméabilisation (Triton-X-100 ; 0,1 %) et incuber les cellules pendant 5 min.
      4. Effectuez deux ou trois lavages PBS et bloquez les cellules avec un agent bloquant (BSA) à 0,5 % à 1 % pendant 1 h à 37 °C ou toute la nuit à 4 °C. Retirez l’agent bloquant et lavez les cellules avec 1x PBS.
      5. Incuber les cellules pendant la nuit avec un anticorps primaire (préparé dans 0,1 % de BSA, NFM [1:50] et MAP-2 [1:200]).
      6. Retirez l’anticorps primaire et lavez les cellules avec 1x PBS trois ou quatre fois pour éliminer les anticorps non liés.
      7. Ajoutez l’anticorps secondaire (lapin anti-souris 1:2 000) et incubez les cellules à température ambiante pendant 1,5 à 2 h dans l’obscurité. Lavez les cellules avec du PBS (deux ou trois fois).
      8. Incuber les cellules dans du DAPI pendant 10 minutes et laver à nouveau avec du PBS. Conservez le volume résiduel pour éviter le dessèchement de l’échantillon. Observez au microscope à fluorescence.
         REMARQUE : De plus, la caractérisation de la stabilité du caryotype¹⁰ et de la sénescence peut également être effectuée pour avoir une meilleure idée de la pureté et de la fonctionnalité des cellules.

Résultats

Ici, nous décrivons comment les chercheurs peuvent établir une culture pure de DPSC via la méthode d’explant ^6,7,8,9,10 et les induire vers plusieurs lignées pour établir la pureté de la culture pour des applications en aval.

Nous avons établi une culture primaire de DPSC à partir du petit tissu de pulpe extrait d...

Discussion

Les cellules souches ont suscité l’espoir de guérir de nombreuses maladies, en raison de leur plasticité, de leur robustesse, de leurs propriétés immunomodulatrices, de leurs mécanismes paracrines et de leur efficacité de guidage. Le tissu de la pulpe dentaire est considéré comme la source la plus puissante et la plus précieuse de cellules souches, avec une plasticité éminente et une capacité de régénération. Ici, nous démontrons l’isolement des DPSC, en utilisant la méthode de culture d’explants ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G