Culture primaire de cellules souches de la pulpe dentaire

Résumé

Cet article fournit un guide par étapes pour établir une culture primaire de cellules souches de pulpes dentaires à l’aide de la méthode de culture d’explants et la caractérisation de ces cellules basée sur les directives de l’ICSCRT. Les cellules isolées par ce protocole peuvent être considérées comme des cellules souches mésenchymateuses pour d’autres applications.

Résumé

La pulpe dentaire humaine représente un réservoir de cellules souches multipotentes prometteur avec une compétence régénérative prééminente qui peut être récoltée à partir d’une dent extraite. L’origine ecto-mésenchymateuse dérivée de la crête neurale des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) confère un haut degré de plasticité qui doit à ses multiples avantages dans la réparation et la régénération des tissus. Il existe diverses façons pratiques de récolter, de conserver et de faire proliférer les cellules souches adultes à l’étude pour leur utilisation en médecine régénérative. Dans ce travail, nous démontrons l’établissement d’une culture primaire de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu dentaire par la méthode de la culture d’explants. Les cellules isolées étaient en forme de fuseau et adhéraient à la surface en plastique de la plaque de culture. La caractérisation phénotypique de ces cellules souches a montré une expression positive des marqueurs de surface cellulaire recommandés par la société internationale de thérapie cellulaire (ISCT) pour les CSM, tels que CD90, CD73 et CD105. De plus, l’expression négligeable des marqueurs hématopoïétiques (CD45) et endothéliales (CD34), et l’expression inférieure à 2 % des marqueurs HLA-DR, ont confirmé l’homogénéité et la pureté des cultures DPSC. Nous avons également illustré leur multipotence basée sur la différenciation en lignées adipogènes, ostéogéniques et chondrogéniques. Nous avons également induit ces cellules à se différencier en cellules de type hépatique et neuronal en ajoutant des milieux de stimulation correspondants. Ce protocole optimisé aidera à la culture d’une population hautement extensible de cellules souches mésenchymateuses qui seront utilisées en laboratoire ou pour des études précliniques. Des protocoles similaires peuvent être incorporés dans des configurations cliniques pour la pratique de traitements basés sur le DPSC.

Introduction

Les cellules souches adultes sont devenues un outil thérapeutique puissant pour les traitements et les thérapies dirigés contre les cellules en raison de leur plasticité, de leurs mécanismes paracrines et de leurs propriétés immunomodulatrices ^1,2,3. Les données encourageantes des études précliniques basées sur les cellules souches ont inspiré les chercheurs à travailler pour la traduction du laboratoire au chevet du patient. Le type de cellules souches utilisé pour la thérapie par cellules souches joue un rôle important dans les résultats positifs. Dans les études précliniqu....

Protocole

Toutes les procédures décrites dans l’étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Institut (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) de PGIMER, Chandigarh. Toutes les expériences liées à la culture cellulaire doivent être réalisées dans une enceinte de sécurité biologique (BSC) de classe II selon une technique aseptique. La pulpe dentaire a été obtenue à partir de dents saines de trois patients (F/14, M/14 et M/20) subissant des extractions de la troisième molaire pour des raisons orthodontiques. Avant le prélèvement de l’échantillon, le consentement éclairé écrit du patient/tuteur a été obtenu, conformément aux directives fournies par le comité d’éthique du PGIMER, Ch....

Résultats

Ici, nous décrivons comment les chercheurs peuvent établir une culture pure de DPSC via la méthode d’explant ^6,7,8,9,10 et les induire vers plusieurs lignées pour établir la pureté de la culture pour des applications en aval.

Nous avons établi une culture primaire de DPSC à partir du petit tissu de pulpe extrait d.......

Discussion

Les cellules souches ont suscité l’espoir de guérir de nombreuses maladies, en raison de leur plasticité, de leur robustesse, de leurs propriétés immunomodulatrices, de leurs mécanismes paracrines et de leur efficacité de guidage. Le tissu de la pulpe dentaire est considéré comme la source la plus puissante et la plus précieuse de cellules souches, avec une plasticité éminente et une capacité de régénération. Ici, nous démontrons l’isolement des DPSC, en utilisant la méthode de culture d’explants .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G