Coltura primaria di cellule staminali della polpa dentale

Riepilogo

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

Abstract

La polpa dentale umana rappresenta un promettente serbatoio di cellule staminali multipotenti con una competenza rigenerativa preminente che può essere prelevata da un dente estratto. L'origine ecto-mesenchimale derivata dalla cresta neurale delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) conferisce un alto grado di plasticità che deve ai suoi molteplici benefici nella riparazione e rigenerazione dei tessuti. Ci sono vari modi pratici per raccogliere, mantenere e proliferare le cellule staminali adulte che vengono studiate per il loro uso nella medicina rigenerativa. In questo lavoro, dimostriamo la creazione di una coltura primaria di cellule staminali mesenchimali da tessuto dentale con il metodo della coltura di espianto. Le cellule isolate erano a forma di fuso e aderivano alla superficie plastica della piastra di coltura. La caratterizzazione fenotipica di queste cellule staminali ha mostrato un'espressione positiva dei marcatori di superficie cellulare raccomandati dalla società internazionale di terapia cellulare (ISCT) per le MSC, come CD90, CD73 e CD105. Inoltre, l'espressione trascurabile dei marcatori ematopoietici (CD45) ed endoteliali (CD34) e inferiore al 2% di espressione dei marcatori HLA-DR, hanno confermato l'omogeneità e la purezza delle colture DPSC. Abbiamo ulteriormente illustrato la loro multipotenza basata sulla differenziazione in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Abbiamo anche indotto queste cellule a differenziarsi in cellule simili a quelle epatiche e neuronali aggiungendo corrispondenti mezzi di stimolazione. Questo protocollo ottimizzato aiuterà nella coltivazione di una popolazione altamente espandibile di cellule staminali mesenchimali da utilizzare in laboratorio o per studi preclinici. Protocolli simili possono essere incorporati in configurazioni cliniche per la pratica di trattamenti basati su DPSC.

Introduzione

Le cellule staminali adulte si sono trasformate in un potente strumento terapeutico per trattamenti e terapie diretti alle cellule grazie alla loro plasticità, ai meccanismi paracrini e alle proprietà immunomodulatorie ^1,2,3. I dati incoraggianti provenienti da studi preclinici basati su cellule staminali hanno ispirato i ricercatori a lavorare per la traduzione dal laboratorio al letto del paziente. Il tipo di cellule staminali utilizzate per la terapia con cellule staminali gioca un ruolo significativo nei risultati di successo. Negli studi preclinici e clinici, la fonte più ampiamente riportata di cellule staminali mesenchimali (MSC) rimane il midollo osseo ^4,5. Tuttavia, i principali svantaggi dell'utilizzo di cellule staminali derivate dal midollo osseo (BMSC) includono la loro rara popolazione, le procedure altamente invasive per l'isolamento e la loro limitata capacità di espansione. Pertanto, si stanno esplorando fonti alternative di MSC. A questo proposito, i tessuti dentali, con la loro facilità di accessibilità, l'enorme plasticità, l'alto potenziale rigenerativo e l'elevata capacità proliferativa, sono stati ora considerati come una ricca e potenziale fonte alternativa di cellule staminali 6,7,8,9,10.

Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) sono state il primo tipo di cellule staminali dentali ad essere isolate e caratterizzate da Gronthos nel 2000¹¹. I DPSC hanno attirato l'attenzione per le applicazioni di ingegneria tissutale a causa del loro alto tasso di proliferazione, del significativo potenziale di differenziazione, della facilità di accessibilità con una coltura senza sforzo e, soprattutto, della loro capacità di essere ottenuti da un dente scartato senza alcuna preoccupazione etica¹². Le limitazioni poste da altre fonti di cellule staminali, come le BMSC e le cellule staminali di derivazione adiposa (ADSC), nel loro isolamento e nelle inadeguate capacità di auto-rinnovamento sono aggirate dalle DPSC¹³. Le DPSC umane possono essere ottenute da denti primari umani, denti permanenti, denti del giudizio, denti decidui esfoliati (SHED) e papille apicali. Inoltre, le DPSC possono anche essere isolate dai denti soprannumerari, che vengono generalmente scartati¹⁴. Le DPSC esprimono marcatori associati alla cresta neurale e hanno il potenziale di differenziarsi in cellule neuronali sia in vitro che in vivo¹⁵. Oltre al loro potenziale neurogenico, le DPSC possono differenziarsi in altre linee cellulari, come osteogeniche, condrogeniche, adipogeniche, epatiche e miogeniche, quando vengono date specifiche condizioni di differenziazione¹³. Pertanto, queste cellule multipotenti hanno un grande potenziale per la terapia cellulare e possono essere impiegate per la rigenerazione di vari tessuti. Gli studi hanno anche riportato il potenziale ruolo delle DPSC nella ricostruzione della cornea¹⁶, nella riparazione dell'infarto del miocardio¹⁷ e il loro potenziale ruolo terapeutico in malattie come l'ischemia degli arti¹⁸, l'Alzheimer ¹⁹, il Parkinson ²⁰ e l'invecchiamento²¹. Pertanto, le cellule staminali derivate dal tessuto dentale possono essere utilizzate non solo per la rigenerazione dentale, ma anche per la riparazione e la rigenerazione di organi non dentali come gli occhi¹⁶, i cuori¹⁷, i fegati²², le ossa²³ ecc.

Esistono due metodi particolari per l'isolamento di una popolazione di MSC dal tessuto pulpare: la digestione enzimatica e la coltura di espianti^24,25. L'insediamento di colture primarie senza alcuna differenza significativa nella quantità e nelle proprietà dei DPSC è stato riportato con entrambi questi metodi²⁶. In questo studio, ci siamo concentrati sull'isolamento delle DPSC con il metodo di espiantazione²⁷, poiché questo metodo genera DPSC senza contaminazione delle cellule ematopoietiche ed endoteliali, rispetto alla digestione enzimatica che può provocare la contaminazione dei fibroblasti²⁸.

Protocollo

Tutte le procedure descritte nello studio sono state approvate dal Comitato Etico dell'Istituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) di PGIMER, Chandigarh. Tutti gli esperimenti relativi alle colture cellulari devono essere eseguiti in una cabina di sicurezza biologica (BSC) di Classe II seguendo una tecnica asettica. La polpa dentale è stata ottenuta da denti sani di tre pazienti (F/14, M/14 e M/20) sottoposti a estrazioni del terzo molare per motivi ortodontici. Prima della raccolta del campione, è stato ottenuto il consenso informato scritto dal paziente/tutore in conformità con le linee guida fornite dal comitato etico di PGIMER, Chandigarh.

1. Costituzione di colture primarie di cellule staminali della polpa dentale (DPSC) da tessuto dentale umano

NOTA: Non utilizzare denti cariati.

1. Raccolta di campioni di polpa dentale e trasporto al laboratorio di coltura tissutale
   1. Eseguire una procedura di estrazione del dente in condizioni non traumatiche e asettiche. Sciacquare accuratamente il dente estratto con una soluzione salina sterile per rimuovere i resti di sangue.
   2. Tagliare il dente estratto longitudinalmente in due pezzi utilizzando una fresa per fessure in metallo duro con irrigazione costante con soluzione fisiologica sterile per esporre la polpa.
   3. Trasportare il dente estratto insieme alla polpa intatta in terreni essenziali sterili α-minimi (α-MEM) mantenuti su ghiaccio al laboratorio di coltura cellulare e tissutale.
      NOTA: Idealmente, elaborare tutti i campioni ricevuti entro 2 ore per la coltura cellulare. Tuttavia, un recente rapporto ha suggerito che l'elaborazione del campione di dente anche dopo 24 ore non ha influito sulla vitalità e sulla proliferazione dei DPSC, tuttavia, ha ridotto la loro funzionalità²⁹.

2. Rimozione del tessuto pulpare dal dente e coltura cellulare di DPSC (tempo: 60-120 min)

NOTA: Tutte le fasi successive al trasporto del dente sono state eseguite nel laboratorio di coltura cellulare e tissutale all'interno di una cabina di biosicurezza di livello 2.

1. Collocare il campione di dente in piastre di Petri sterili per colture e risciacquare accuratamente (tre o quattro volte) con 1 soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
2. Rimuovere con cura il tessuto pulpare dalla cavità pulpare con l'aiuto di un escavatore affilato e di una pinza.
3. Una volta rimossa la polpa, pulirla accuratamente con PBS sterile per rimuovere eventuali residui di sangue.
4. Tagliare il tessuto pulpare in piccoli pezzi di circa 2-3 mm con l'aiuto di una lama chirurgica in una capsula di Petri.
   1. Dividi la superficie del piatto in quattro parti mettendo 1-2 ml di PBS sterile in ciascuna area. Mettere il campione di tessuto pulpare in un'area con PBS e tagliare il tessuto in pezzi più piccoli possibili con una lama chirurgica (più piccolo è il pezzo, più facile sarà per le cellule staminali migrare fuori dal tessuto). Successivamente, trasferisci ogni pezzo sollevandolo in un'altra area con PBS e così via fino alla quarta area, in modo che i pezzi di tessuto siano adeguatamente lavati e privi di contaminanti.
5. Nel frattempo, versare circa 0,8-1 ml di α-MEM contenente aminoacidi non essenziali con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e un cocktail di antibiotici (cioè penicillina e streptomicina) nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Distribuire uniformemente il supporto spostando la piastra, in modo da distribuirlo uniformemente sulla superficie del pozzetto.
6. Seminare i piccoli pezzi di polpa, tessuto o espianti con l'aiuto di una pinza in un singolo pozzetto (da quattro a sei pezzi per pozzetto) della piastra a 6 pozzetti e mantenere la piastra indisturbata per 5 minuti in una cappa di biosicurezza.
   NOTA: Questa fase consente/favorisce l'adesione dei tessuti/espianti alle superfici trattate delle piastre di coltura.
7. Mantenere la piastra di coltura in un'atmosfera umidificata con una temperatura di 37 °C _{e un livello} di CO_{2 del} 5%.
8. Il giorno successivo, aspirare con cura il terreno dai pozzetti senza disturbare gli espianti e aggiungere terreno fresco. Cambiare il supporto a giorni alterni in questo passaggio per evitare che si secchi. Assicurarsi che l'incubatrice abbia acqua sufficiente nel vassoio in modo che un'ulteriore evaporazione non causi l'essiccazione del materiale nei pozzetti della piastra.
   NOTA: Questo è un passaggio molto cruciale e il disturbo può causare lo spostamento degli espianti dalla loro posizione. Se i pezzi di espiantazione vengono rimossi dalla loro posizione durante il trasferimento del terreno, provare a riattaccarli rimuovendo completamente il supporto e lasciandoli aderire alla superficie del pozzetto. Il substrato deve essere aggiunto con cura lungo la parete del pozzo senza disturbare gli espianti, altrimenti potrebbero staccarsi di nuovo. Osservare regolarmente le piastre per colture cellulari al microscopio invertito (ingrandimento 4x o 10x). Identificare i DPSC in base alla loro capacità di aderire alla superficie plastica e alla loro morfologia a forma di fuso.
9. Una volta che un numero sufficiente di cellule migra dagli espianti, rimuovere i tessuti e consentire alle cellule di proliferare e raggiungere la confluenza cellulare ottimale del 70%-75% prima della subcoltura. Il volume di α-MEM contenente il 10% di FBS può essere aumentato a 2 mL in questa fase in modo che le cellule possano dividersi più velocemente. In questa fase cambia i media ogni tre giorni.

3. Espansione DPSC

1. Lavare due volte il pallone di coltura confluente T75 (confluenza: 70%-80%) di DPSC con PBS (10 mL).
2. Aggiungere 2,5 mL di acido tripsin-etilendiamminantetraacetico allo 0,25% (EDTA) sul lato del pallone T75 e agitarlo delicatamente per assicurarsi che la tripsina-EDTA copra l'intero foglio cellulare o il monostrato di DPSC.
3. Mantenere il pallone all'interno della cappa a 37 °C per 3-5 minuti. Dopo 3 minuti, picchiettare delicatamente il pallone per garantire la dissociazione delle cellule.
4. Aggiungere 5 mL di terreno completo (α-MEM con il 10% di FBS) o 250 μL di FBS (10% del volume di tripsina utilizzato) come agente neutralizzante per inattivare l'attività della tripsina. Trasferire l'intera sospensione cellulare di DPSC dissociate in una provetta da centrifuga conica fresca da 15 mL.
5. Centrifugare le celle dissociate a 500 x g per 2 minuti a temperatura ambiente per ottenere il pellet della cella.
6. Aspirare tutto il surnatante utilizzando la pipetta, aggiungere 5-10 ml di PBS al pallone per raccogliere le cellule rimanenti, lavare la cellula in PBS con pipettaggio delicato e centrifugare nuovamente le cellule a 500 x g per 2 minuti. Ripetere se necessario.
7. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno completo (α-MEM con il 10% di FBS) dopo aver rimosso accuratamente il surnatante ed eseguito un pipettaggio delicato per ottenere una sospensione a cellula singola.
8. Dividere le cellule e seminarle (di uguale volume) in due fiasche di coltura T75, ciascuna contenente 10 ml di terreno completo completo. Conservare il pallone all'interno della cappa a 37 °C.
9. Il giorno successivo, aspirare il supporto e sostituirlo con il supporto completo nuovo.
   NOTA: Prolungare il trattamento con tripsina può compromettere l'integrità, la vitalità e la funzione cellulare scindendo la proteina della superficie cellulare e la proteina della matrice extracellulare.

4. Identificazione di marcatori fenotipici delle cellule staminali (tempo: 90 - 120 min)

NOTA: Per la caratterizzazione delle cellule prelevate dal tessuto pulpare, utilizzare cellule tra il terzo e il quinto passaggio.

1. Utilizzare due fiasche di coltura T75 confluenti di DPSC al 70%-80% (~3-4 x 10⁶ ; contare le cellule utilizzando un citometro a immagini o un emocitometro) di DPSC e lavare le cellule due volte con 10 mL di PBS.
2. Aggiungere 2,5 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e mantenere il pallone all'interno della cappa a 37 °C per 3-5 minuti. Aggiungere 5 mL di terreno completo o 250 μL di FBS (10% del volume di tripsina utilizzato) come agente neutralizzante per inattivare l'attività della tripsina.
3. Raccogliere le cellule utilizzando una pipetta in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Centrifugare le celle dissociate a 500 x g per 2 minuti a temperatura ambiente per ottenere il pellet della cella.
4. Aspirare tutto il surnatante utilizzando la pipetta, aggiungere 5 mL di PBS al pallone per raccogliere le cellule rimanenti, lavare la cellula in PBS con pipettaggio delicato e centrifugare nuovamente le cellule a 500 x g per 2 minuti.
5. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS dopo aver rimosso accuratamente il surnatante ed eseguire un pipettaggio delicato per ottenere una sospensione a cellula singola.
6. Contare le cellule utilizzando un citometro o un emocitometro a immagini, a seconda della disponibilità, e distribuirle in provette da microcentrifuga a 1 x 10⁴ cellule/provetta. Incubare le cellule in albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5%-1% per 0,5-1 h.
7. A ciascuna provetta, aggiungere 1-2 μL di anticorpi coniugati con isotiocianato di fluoresceina (FITC) e ficoeritrina (PE) per i marcatori di cluster di differenziazione (CD) (ad es. CD90 [0,4 μg], CD73 [0,8 μg], CD105 [0,4 μg], CD34 [0,8 μg], CD45 [0,4 μg] e HLA-DR [0,08 μg])6,7,8,9 e incubare per 0,5 ore al buio a temperatura ambiente.
8. Dopo 0,5 h, pellettare le celle centrifugando a 500 x g per 5 min. Aspirare il surnatante, lavare il pellet di cellule con PBS e centrifugare nuovamente.
9. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in PBS (200 μL/provetta), trasferire la sospensione cellulare in provette per citometria a flusso e acquisirla utilizzando un citometro a flusso. Qualsiasi software commerciale può essere utilizzato per analizzare ulteriormente la percentuale di cellule positive per vari anticorpi.
   NOTA: I passaggi da 4.7 a 4.9 devono essere eseguiti al buio a temperatura ambiente. Dovrebbero essere utilizzati controlli isotipici adeguati e campioni non colorati per omettere la fluorescenza di fondo delle cellule.

5. Differenziazione DPSC in più lignaggi

NOTA: Utilizzare il 75%-80% di colture confluenti di DPSC dal terzo al quinto passaggio per la valutazione della multipotenza. Per tutti i tipi di differenziazione descritti di seguito dovrebbe essere utilizzato un gruppo di cellule di controllo contenente α-MEM.

1. Differenziamento osteogenico di DPSC, colorazione con rosso di alizarina e quantificazione
   1. Realizzare una sospensione a singola cellula utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25%, come descritto sopra al punto 4.2, e risospendere il pellet cellulare in α-MEM completo.
   2. Contare le cellule e seminarle in piastre trattate con coltura tissutale a 24 pozzetti a una densità di 2 x 10⁴ cellule/pozzetto contenenti 0,4-0,5 mL di terreno completo per 48 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
   3. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno dai pozzetti e aggiungere 0,4-0,5 mL di terreno induttivo osteogenico (cioè α-MEM con fattori induttivi osteogenici come il beta glicerofosfato [5 mM], il fosfato monopotassico [1,8 mM] e il desametasone fosfato disodico [0,01 mM])⁸. Preparare pozzetti di controllo (cellule non indotte) contenenti solo α-MEM completo senza fattori induttivi osteogenici (terreni di controllo).
      NOTA: L'aggiunta di 50 μM di ascorbato migliora anche la differenziazione osteogenica ^30,31. Dopo ogni tre giorni, sostituire i terreni di induzione e di controllo con terreni freschi e colture per 21 giorni (3 settimane). Al termine del periodo di induzione, rimuovere il terreno dalle piastre di coltura, aggiungere 0,5 ml di PBS e lavare due volte.
   4. Dopo il lavaggio con PBS, fissare le cellule in 0,5 mL di soluzione di formalina tamponata neutra (NBF) al 10% per 20-30 minuti a temperatura ambiente. Eseguire il fissaggio in una cappa aspirante/chimica.
2. Colorazione rossa di alizarina
   1. Preparare la colorazione rosso S di alizarina (2%) sciogliendo 1 g di rosso di alizarina S in 50 ml di acqua distillata doppia (ddH₂O) e regolando il pH a 4,0-4,2 con l'aiuto di acido cloridrico (HCL) o idrossido di ammonio (NH₄OH). Filtra la macchia con carta da filtro. Conservare la macchia al buio (4 °C).
   2. Lavare le cellule due volte con acqua distillata doppia (ddH₂O), aggiungere la colorazione S rossa di alizarina e incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti.
   3. Rimuovere la macchia da tutti i pozzetti e lavare le celle quattro o cinque volte con ddH₂O per rimuovere eventuali macchie non legate. Cattura le immagini utilizzando un microscopio a campo chiaro.
3. Estrazione della macchia rossa di alizarina per l'analisi quantitativa
   1. Aggiungere il tampone cloruro di cetil piridinio (CPC) (pH 7,0) ai pozzetti colorati (0,4 mL/pozzetto) e incubare le cellule per 2 ore a 37 °C. Inoltre, le cellule possono anche essere incubate con acido acetico al 10% per la corretta dissoluzione dei cristalli rossi di alizarina³². Conservare le piastre su un bilanciere o uno shaker.
   2. Dopo l'incubazione, raccogliere il surnatante (colorante estratto), trasferirlo in una piastra a 96 pozzetti e leggere la piastra o i campioni a 405 nm. Per ottenere un valore vuoto, aggiungere solo il buffer CPC (stesso volume) e leggere^32,33 .

6. Differenziazione adipogenica dei DPSC, colorazione con O rosso olio e quantificazione

NOTA: Le fasi iniziali della semina sono le stesse di cui sopra (cioè la fase di differenziazione osteogenica 5.1).

1. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno dai pozzetti e aggiungere 0,4-0,5 mL di terreno induttivo adipogenico (cioè α-MEM con fattori induttivi adipogenici come isobutil-metilxantina [IBMX; 0,5 mM], desametasone [1 μM], indometacina [200 μM] e insulina [10 μM])⁸. Preparare pozzetti di controllo contenenti cellule non indotte (cioè coltivate solo in α-MEM senza fattori induttivi {terreni di controllo]).
2. Rifornire il terreno ogni tre giorni e coltivare le cellule per 3 settimane. Dopo 3 settimane, aspirare il terreno dalle piastre di coltura e aggiungere 0,5 ml di PBS per lavare le cellule due volte.
3. Dopo il lavaggio PBS, fissare le cellule in soluzione di NBF al 10% per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare le cellule due volte con acqua distillata doppia (ddH₂O), aggiungere olio rosso macchia O e incubare a temperatura ambiente per 30-40 minuti.
5. Rimuovere la macchia da tutti i pozzetti e sciacquare ripetutamente i pozzetti contenenti le cellule con ddH₂O fino a quando non sono chiari (da due a quattro volte). Osserva al microscopio e cattura le immagini.
6. Estrazione di olio rosso O per analisi quantitative
   1. Aggiungere 0,4 mL di 100% 2-propanolo ai pozzetti colorati e incubare a temperatura ambiente coprendo adeguatamente la piastra per 30 minuti. Tenere la piastra su un bilanciere o uno shaker.
   2. Dopo l'incubazione, raccogliere il surnatante, trasferirlo su una piastra a 96 pozzetti, leggere la piastra o i campioni a 510 nm. Utilizzare il 100% di 2-propanolo per la tranciatura.

7. Differenziamento condrogenico di DPSC, colorazione con blu di Alcian e quantificazione

NOTA: La differenziazione condrogenica è stata indotta nella coltura monostrato di DPSC. Le fasi iniziali della semina sono le stesse di cui sopra (cioè la fase di differenziazione osteogenica 5.1).

1. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno dai pozzetti e aggiungere 0,4-0,5 mL di terreno di induzione condrogenica (ad es. α-MEM con fattori induttivi specifici per la differenziazione condrogenica, acido ascorbico [0,2 M], piruvato di sodio [1 mM], fattore di crescita trasformante-beta 3 [TGF-β₃; 10 μM], desametasone [1 mM] e 1x premiscela ITS [insulina, transferrina e acido selenoso)¹⁰. Preparare pozzetti di controllo contenenti cellule non indotte (cioè coltivate solo in α-MEM senza fattori induttivi [terreni di controllo]).
2. Rifornire il terreno ogni tre giorni e coltivare le cellule per 3 settimane. Al termine del periodo di induzione, aspirare il terreno dalle piastre di coltura e aggiungere 0,5 ml di PBS per lavare le cellule due volte.
3. Dopo il lavaggio con PBS, fissare le celle in una soluzione di NBF al 10% per 15-20 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle due o tre volte con acqua distillata doppia (ddH₂O), aggiungere il colorante blu di Alcian e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti.
4. Rimuovere la macchia da tutti i pozzetti, quindi risciacquare con 0,1 N HCL due o tre volte. Lavare le celle quattro o dare volte con ddH₂O.
5. Osservare le cellule per i proteoglicani (colore blu) al microscopio e catturare le immagini.
6. Per la quantificazione del blu di Alcian, estrarre il colorante utilizzando 6 M guanidina-HCl e leggere i campioni a una densità ottica (OD) di 595 nm. Il kit blu di Alcian utilizzato in questo studio colora i proteoglicani acidi nella cartilagine e lega in modo speciale i glicosaminoglicani solfatati (GAG) presenti nella matrice dei condrociti¹⁰.

8. Differenziamento delle DPSC verso la linea epatica e caratterizzazione

1. Effettuare una sospensione di cellule a singola cellula mediante trattamento con tripsina, come descritto sopra, e risospendere il pellet cellulare in α-MEM completo.
2. Contare le cellule e seminarle in piastre di coltura ben trattate a 24 x 10⁴ cellule/pozzetto contenenti 0,4-0,5 mL di terreno completo per 48 ore.
3. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno dai pozzetti e incubare le cellule con terreno di induzione epatica per 14 giorni. Il terreno di induzione è costituito da un terreno di coltura Dulbecco modificato a basso contenuto di glucosio (DMEM) contenente desametasone (0,5 μM), fattore di crescita epidermico (EGF; 2 ng/mL), premiscela ITS+ (50 mg/mL) e fattore di crescita degli epatociti (HGF; 20 ng/mL) ⁶.
4. Dopo 14 giorni, sostituire il terreno con il terreno di maturazione per altri 14 giorni (α-MEM integrato con oncostatina M [OSM; 20 ng/mL], premiscela ITS [50 mg/mL] e desametasone [0,5 μM]) ⁶. Rifornisci i media con nuovi media ogni tre giorni.
5. Eseguire analisi immunoistochimiche e un test delle lipoproteine a bassa densità (LDL) per confermare la differenziazione epatica.
   1. Captazione di LDL e colorazione immunofluorescente per il recettore LDL
      NOTA: Le cellule simili agli epatociti dopo la differenziazione sono state caratterizzate dal kit del saggio di captazione delle LDL secondo le istruzioni del kit. Il fluorocromo LDL-550 è stato utilizzato per valutare l'assorbimento di LDL in cellule differenziate allo stato vivo e l'anticorpo del recettore LDL è stato utilizzato per la rilevazione dei recettori LDL nelle cellule differenziate post-fissazione.
      1. Dopo la differenziazione, colorare le cellule vive con LDL-550 (1:100) per 3-4 ore. Dopo 3-4 ore, sostituire la soluzione colorante con terreni di coltura e osservare l'assorbimento di LDL al microscopio a fluorescenza in grado di eccitare e trasmettere lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dello ioduro di propidio (PI) rispettivamente a 537 e 617 nm.
      2. Fissare le cellule nella soluzione fissativa per 10 minuti. Dopo il fissaggio delle cellule, bloccare le cellule nella soluzione bloccante per 30 minuti.
      3. Incubare le cellule con un anticorpo primario del recettore LDL per 1 ora, lavare con 1x PBS tre volte, quindi incubare con 488 anticorpi secondari (1:100) per 1 ora al buio.
      4. Lavare le cellule con PBS tre volte per rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso. Aggiungere il 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) come colorante nucleare.
      5. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza. Scatta immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza in grado di misurare lunghezze d'onda nell'intervallo di eccitazione/emissione di DAPI, PI e FITC.
         NOTA: I parametri di intensità di una singola cellula possono essere registrati per quantificare l'espressione anticorpale del recettore LDL e l'assorbimento di LDL. Per la colorazione in immunofluorescenza devono essere utilizzati adeguati controlli anticorpali secondari per omettere la fluorescenza di fondo derivante solo dall'anticorpo secondario.

9. Differenziamento neurale di DPSC verso lignaggio neuronale e caratterizzazione

1. Dopo la placcatura delle cellule, come descritto sopra, coltivare le cellule in α-MEM per 48 ore.
2. Aspirare il terreno e sostituirlo con un terreno neurobasale contenente fattori di crescita come l'integratore di G5 allo 0,5%, l'integratore di N2 allo 0,2%, il fattore di crescita epidermico da 20 ng/mL, il fattore di crescita basico dei fibroblasti da 20 ng/mL e l'integratore di B27 (1%). Coltivare le cellule in questo terreno per 25-41 giorni⁷.
3. Cambia il terreno ogni due o tre giorni, a seconda del suo metabolismo da parte delle cellule. Per ottenere un'efficiente maturazione neuronale e un maggior numero di neuroni della proteina-2 associata ai microtubuli (MAP-2+), rimuovere l'EGF e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) dopo la fase di induzione neuronale (14 giorni).
   NOTA: Nel corso del tempo e dopo ripetuti cambiamenti dei media, i neuroni differenziati potrebbero mostrare un distacco dai pozzetti della piastra a causa della bassa aderenza, con conseguente perdita di neuroni nella coltura a lungo termine. Per evitare ciò, rivestire i pozzetti della piastra con laminina o fibronectina (opzionale).
4. Eseguire analisi immunoistochimiche per confermare la differenziazione neuronale.
   1. Immunocolorazione di DPSC differenziate
      NOTA: Per confermare la differenziazione neuronale delle DPSC, è stata eseguita l'immunocitochimica nelle cellule differenziate utilizzando anticorpi MAP-2 e neurofilamenti (NFM), che sono proteine neurogeniche specifiche del lignaggio⁷.
      1. Rimuovere i terreni di coltura al termine della differenziazione. Aggiungere il PBS, agitare delicatamente la piastra e rimuovere il PBS con l'aiuto di una pipetta. Ripeti il passaggio.
      2. Fissare le celle utilizzando il 10% di NBF o il 4% di paraformaldeide per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
      3. Rimuovere il fissativo e lavare le cellule con 1x PBS due o tre volte. Aggiungere la soluzione di permeabilizzazione (Triton-X-100; 0,1%) e incubare le cellule per 5 minuti.
      4. Eseguire il lavaggio PBS due o tre volte e bloccare le celle con l'agente bloccante (BSA) allo 0,5%-1% per 1 ora a 37 °C o per una notte a 4 °C. Rimuovere l'agente bloccante e lavare le celle con 1x PBS.
      5. Incubare le cellule per una notte con anticorpi primari (preparati in BSA allo 0,1%, NFM [1:50] e MAP-2 [1:200]).
      6. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare le cellule con 1x PBS tre o quattro volte per rimuovere gli anticorpi non legati.
      7. Aggiungere l'anticorpo secondario (coniglio anti-topo 1:2.000) e incubare le cellule a temperatura ambiente per 1,5-2 ore al buio. Lavare le celle con PBS (due o tre volte).
      8. Incubare le cellule in DAPI per 10 minuti e lavare nuovamente con PBS. Conservare il volume residuo per evitare l'essiccazione del campione. Osservare al microscopio a fluorescenza.
         NOTA: Inoltre, la caratterizzazione della stabilità del cariotipo¹⁰ e della senescenza può essere eseguita per avere un'idea migliore della purezza e della funzionalità delle cellule.

Risultati

Qui, descriviamo come i ricercatori possono stabilire una coltura pura di DPSC tramite il metodo di espiantazione 6,7,8,9,10 e indurli verso più lignaggi per stabilire la purezza della coltura per le applicazioni a valle.

Abbiamo stabilito una coltura primaria di DPSC dal piccolo tessuto di polpa estratto dal terzo molare ...

Discussione

Le cellule staminali hanno riposto le speranze di curare numerose malattie, grazie alla loro plasticità, robustezza, proprietà immunomodulatorie, meccanismi paracrini ed efficienza di homing. Il tessuto pulpare dentale è considerato la fonte più potente e preziosa di cellule staminali, con un'eminente plasticità e una capacità rigenerativa. Qui, dimostriamo l'isolamento delle DPSC, utilizzando il metodo di coltura dell'espianto, ampiamente adottato, in cui le cellule migrano da pezzi di tessuto pulpare o espianti p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G