Primärkultur von Stammzellen der Zahnpulpa

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält eine schrittweise Anleitung zur Etablierung einer Primärkultur von Zahnpulpa-Stammzellen unter Verwendung der Explantatkulturmethode und zur Charakterisierung dieser Zellen auf der Grundlage der ICSCRT-Richtlinien. Die durch dieses Protokoll isolierten Zellen können als mesenchymale Stammzellen für weitere Anwendungen betrachtet werden.

Zusammenfassung

Die humane Zahnpulpa stellt ein vielversprechendes multipotentes Stammzellreservoir mit herausragender regenerativer Kompetenz dar, das aus einem extrahierten Zahn gewonnen werden kann. Der aus der Neuralleiste gewonnene ekto-mesenchymale Ursprung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) verleiht ein hohes Maß an Plastizität, das auf seine vielfältigen Vorteile bei der Gewebereparatur und -regeneration zurückzuführen ist. Es gibt verschiedene praktische Möglichkeiten, adulte Stammzellen zu gewinnen, zu erhalten und zu vermehren, die für ihren Einsatz in der regenerativen Medizin untersucht werden. In dieser Arbeit zeigen wir die Etablierung einer primären mesenchymalen Stammzellkultur aus Zahngewebe mit Hilfe der Explantatkulturmethode. Die isolierten Zellen waren spindelförmig und hafteten an der Kunststoffoberfläche der Kulturplatte. Die phänotypische Charakterisierung dieser Stammzellen zeigte eine positive Expression der von der International Society of Cell Therapy (ISCT) empfohlenen Zelloberflächenmarker für MSC, wie CD90, CD73 und CD105. Darüber hinaus bestätigte die vernachlässigbare Expression von hämatopoetischen (CD45) und endothelialen Markern (CD34) und weniger als 2% der HLA-DR-Marker die Homogenität und Reinheit der DPSC-Kulturen. Des Weiteren haben wir ihre Multipotenz anhand der Differenzierung zu adiogenen, osteogenen und chondrogenen Linien veranschaulicht. Wir haben diese Zellen auch dazu gebracht, sich durch Zugabe entsprechender Stimulationsmedien in leberähnliche und neuronale Zellen zu differenzieren. Dieses optimierte Protokoll wird bei der Kultivierung einer hochgradig erweiterbaren Population von mesenchymalen Stammzellen helfen, die im Labor oder für präklinische Studien verwendet werden sollen. Ähnliche Protokolle können in klinische Setups für die Durchführung von DPSC-basierten Behandlungen integriert werden.

Einleitung

Adulte Stammzellen haben sich aufgrund ihrer Plastizität, ihrer parakrinen Mechanismen und immunmodulatorischen Eigenschaften zu einem leistungsfähigen therapeutischen Werkzeug für zellgerichtete Behandlungen und Therapien entwickelt ^1,2,3. Die ermutigenden Daten aus stammzellbasierten präklinischen Studien haben Forscher dazu inspiriert, an der Labor-zu-Krankenbett-Translation zu arbeiten. Die Art der Stammzellen, die für die Stammzelltherapie verwendet werden, spielt eine wichtige Rolle für erfolgreiche Ergebnisse. In präklinischen und klinischen Studien ist das Knochenmark....

Protokoll

Alle in der Studie beschriebenen Verfahren wurden von der Ethikkommission des Instituts (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) von PGIMER, Chandigarh, genehmigt. Alle Experimente im Zusammenhang mit der Zellkultur müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) der Klasse II nach aseptischer Technik durchgeführt werden. Die Zahnpulpa wurde von gesunden Zähnen von drei Patienten (F/14, M/14 und M/20) gewonnen, die sich aus kieferorthopädischen Gründen einer Extraktion des dritten Molaren unterzogen hatten. Vor der Probenentnahme wurde eine schriftliche Einverständniserklärung des Patienten/Erziehungsberechtigten gemäß den Richtlinien der Ethikkommission von PGIMER, Chan....

Diskussion

Stammzellen haben aufgrund ihrer Plastizität, Robustheit, immunmodulatorischen Eigenschaften, parakrinen Mechanismen und Homing-Effizienz die Hoffnung auf die Heilung zahlreicher Krankheiten geknüpft. Zahnpulpagewebe gilt als die potenteste und wertvollste Quelle für Stammzellen, mit herausragender Plastizität und regenerativer Fähigkeit. Hier demonstrieren wir die Isolierung von DPSCCs unter Verwendung der weit verbreiteten Explantatkulturmethode, bei der die Zellen aus Pulpagewebestücken oder Explantaten migriere.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G