تصوير طويل المدى للمجموعات العصبية المحددة باستخدام المنشورات الدقيقة في التي تتحرك بحرية وثابتة الرأس

Summary

عند دمجها مع لوحة رأس وتصميم بصري متوافق مع كل من المجاهر أحادية الفوتون وثنائية الفوتون ، تقدم عدسة المنشور الدقيق ميزة كبيرة في قياس الاستجابات العصبية في عمود عمودي في ظل ظروف متنوعة ، بما في ذلك التجارب التي يتم التحكم فيها جيدا في حالات ثابتة الرأس أو المهام السلوكية الطبيعية في التي تتحرك بحرية.

Abstract

مع تقدم المجهر متعدد الفوتونات والتقنيات الجزيئية ، ينمو التصوير الفلوري بسرعة ليصبح نهجا قويا لدراسة بنية أنسجة المخ الحية ووظيفتها ومرونتها. بالمقارنة مع الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية ، يمكن للفحص المجهري الفلوري التقاط النشاط العصبي بالإضافة إلى مورفولوجيا الخلايا ، مما يتيح تسجيلات طويلة الأجل لمجموعات الخلايا العصبية المحددة بدقة خلية واحدة أو تحت خلوية. ومع ذلك ، يتطلب التصوير عالي الدقة عادة إعدادا مستقرا وثابتا للرأس يقيد حركة ، ويسمح إعداد سطح مستو من الزجاج الشفاف بتصور الخلايا العصبية في مستوى أفقي واحد أو أكثر ولكنه محدود في دراسة العمليات الرأسية التي تعمل عبر أعماق مختلفة. هنا ، نصف إجراء للجمع بين تثبيت لوحة الرأس والمنشور الدقيق الذي يعطي تصويرا متعدد الطبقات ومتعدد الوسائط. لا يتيح هذا المستحضر الجراحي الوصول إلى العمود الكامل للقشرة البصرية للفأر فحسب ، بل يسمح بالتصوير ثنائي الفوتون في وضع ثابت للرأس وتصوير فوتون واحد في نموذج يتحرك بحرية. باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء أخذ عينات من مجموعات الخلايا المحددة عبر طبقات قشرية مختلفة ، وتسجيل استجاباتها تحت حالات ثابتة الرأس وتتحرك بحرية ، وتتبع التغييرات طويلة المدى على مدى أشهر. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة فحصا شاملا للدوائر الدقيقة ، مما يتيح المقارنة المباشرة للأنشطة العصبية التي تثيرها المحفزات التي يتم التحكم فيها جيدا وفي إطار نموذج سلوكي طبيعي.

Introduction

ظهر ظهور التصوير الفلوري ثنائي الفوتون في الجسم الحي ^1,2 ، الذي يجمع بين التقنيات الجديدة في الأنظمة البصرية ومؤشرات التألق المعدلة وراثيا ، كتقنية قوية في علم الأعصاب للتحقيق في البنية المعقدة والوظيفة واللدونة في الدماغ الحي ^3,4. على وجه الخصوص ، توفر طريقة التصوير هذه ميزة لا مثيل لها على الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية من خلال التقاط كل من التشكل والأنشطة الديناميكية للخلايا العصبية ، وبالتالي تسهيل التتبع طويل المدى للخلايا العصبية المحددة^5،6،7،

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لقانون في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 بموجب التراخيص الشخصية وتراخيص المشاريع المعتمدة والصادرة عن وزارة الداخلية البريطانية بعد مراجعة الأخلاقيات المناسبة. خطوط معدلة وراثيا للبالغين CaMKII-TTA ؛ تم تربية GCaMP6S-TRE²¹ واستخدام نسلها في التجربة. من أجل سلامة المجربين والحفاظ على الظروف المعقمة ، تم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة ومع معدات الحماية الشخصية الكاملة.

1. التحضير قبل الجراحة

1. لتقليل الوذمة، يتم تطبيق ديكساميثازون (0.2 ملغ/كغ) تحت الجلد، قبل 12-24 ساعة من الجراحة.
2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف وتعقيم المنطقة ال....

النتائج

تم عرض طريقة إجراء تصوير الكالسيوم المزمن متعدد الطبقات في الجسم الحي لنفس المجموعة العصبية على مدى عدة أسابيع ، باستخدام كل من طرق التصوير بفوتون واحد وفوتون ، في ظل ظروف متحركة بحرية وثابتة الرأس. هنا ، تم إثبات القدرة على تحديد المجموعات العصبية المتطابقة تحت تصوير فوتون واحد أثنا.......

Discussion

هنا ، أظهرنا القدرة على مراقبة الخلايا العصبية ومقارنتها مباشرة في ظروف ثابتة الرأس وتتحرك بحرية في نفس المجموعات العصبية. بينما أظهرنا التطبيق في القشرة البصرية ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع العديد من مناطق الدماغ الأخرى ، سواء المناطق القشرية أو النوى العميقة^24،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment