자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

요약

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

초록

다광자 현미경 및 분자 기술의 발전으로 형광 이미징은 빠르게 성장하여 살아있는 뇌 조직의 구조, 기능 및 가소성을 연구하기 위한 강력한 접근 방식이 되고 있습니다. 기존의 전기생리학과 비교했을 때, 형광 현미경은 세포의 형태뿐만 아니라 신경 활동도 포착할 수 있어 단세포 또는 세포 내 분해능으로 식별된 뉴런 집단을 장기간 기록할 수 있습니다. 그러나 고해상도 이미징은 일반적으로 동물의 움직임을 제한하는 안정적인 머리 고정 설정이 필요하며, 투명 유리의 평평한 표면을 준비하면 하나 이상의 수평면에서 뉴런을 시각화할 수 있지만 다양한 깊이에서 실행되는 수직 프로세스를 연구하는 데는 제한적입니다. 여기에서는 헤드 플레이트 고정과 다층 및 다중 모드 이미징을 제공하는 마이크로 프리즘을 결합하는 절차를 설명합니다. 이 수술 준비는 생쥐 시각 피질의 전체 기둥에 접근할 수 있을 뿐만 아니라 머리 고정 위치에서 2광자 이미징과 자유롭게 움직이는 패러다임에서 1광자 이미징을 가능하게 합니다. 이 접근법을 사용하면 다양한 피질 층에서 식별된 세포 집단을 샘플링하고, 머리가 고정되고 자유롭게 움직이는 상태에서 반응을 등록하고, 수개월에 걸친 장기적인 변화를 추적할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 미세 회로에 대한 포괄적인 분석을 제공하여 잘 제어된 자극과 자연스러운 행동 패러다임에 의해 유발되는 신경 활동을 직접 비교할 수 있습니다.

서문

광학 시스템과 유전자 변형 형광 지표의 새로운 기술을 결합한 생체 내 이광자 형광 이미징(in vivo two-photon fluorescent imaging^)1,2의 출현은 살아있는 뇌의 복잡한 구조, 기능 및 가소성을 조사하기 위한 신경 과학의 강력한 기술로 부상했습니다 ^3,4. 특히, 이 이미징 방식은 뉴런의 형태와 동적 활동을 모두 포착함으로써 기존 전기생리학에 비해 비교할 수 없는 이점을 제공하여 식별된 뉴런의 장기 추적을 용이하게 합니다 5,6,7,8.

주목할 만한 장점에도 불구하고, 고해상도 형광 이미징을 적용하려면 동물의 이동성을 제한하는 정적인 머리 고정 설정이 필요한 경우가 많습니다 ^9,10,11

프로토콜

모든 실험은 1986년 영국 동물(과학적 절차)법에 따라 영국 내무부에서 승인하고 발급한 개인 및 프로젝트 라이선스에 따라 적절한 윤리 검토를 거쳐 수행되었습니다. 성인 형질전환 라인 CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE²¹ 을 사육하고 그 자손을 실험에 사용했습니다. 실험자의 안전과 멸균 조건의 유지를 위해 모든 절차는 무균 조건에서 완전한 개인 보호 장비로 수행되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 부종을 최소화하려면 수술 12-24시간 전에 덱사메타손(0.2mg/kg)을 피하 투여하십시오.
2. 오토클레이브에서 모든 수술 도구를 멸균하고 수술 전에 증류수와 70% 에탄올로 안정화된 차아염소산으로 수술 부위를 멸균합니다. 모든 수술 장비가 켜져 있는지 확인하십시오.
3. 유도 용량 5%의 이소플루란을 사용하여 동물(생후 24주, 체중 31g의 수컷)을 마취하며, 마우스가 입체 프레임에 있으면 1%-2%로 감소하고 O₂ 는 1-2L/min 사이로 유지됩니다. 비스테로이드성 항염증제(Carprofen, 2.5 mg/kg)를 피하 주사합니다.
4. 마취 깊이를 평가하기 위해 발가락 꼬집기 반사가 없는....

토론

여기에서 우리는 동일한 신경 집단에서 머리가 고정되고 자유롭게 움직이는 조건에서 뉴런을 관찰하고 직접 비교할 수 있는 능력을 보여주었습니다. 우리가 시각 피질에서 응용을 시연하는 동안, 이 프로토콜은 피질 영역과 심부 핵 24,25,26,27,28 뿐만 아니라 다른 데이터 수집 및 행동 설정

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment