הדמיה ארוכת טווח של אוכלוסיות עצביות מזוהות באמצעות מיקרופריזמות בבעלי חיים הנעים בחופשיות ומקובעים לראש

Summary

בשילוב עם לוחית ראש ועיצוב אופטי התואם למיקרוסקופים של פוטון בודד ושני פוטונים, עדשת המיקרופריזמה מציגה יתרון משמעותי במדידת תגובות עצביות בטור אנכי בתנאים מגוונים, כולל ניסויים מבוקרים היטב במצבים קבועים בראש או משימות התנהגותיות טבעיות בבעלי חיים הנעים בחופשיות.

Abstract

עם התקדמות המיקרוסקופ הרב-פוטוני והטכנולוגיות המולקולריות, דימות פלואורסצנטי גדל במהירות והופך לגישה רבת עוצמה לחקר המבנה, התפקוד והפלסטיות של רקמות מוח חיות. בהשוואה לאלקטרופיזיולוגיה קונבנציונלית, מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול ללכוד את הפעילות העצבית כמו גם את המורפולוגיה של התאים, ומאפשר הקלטות ארוכות טווח של אוכלוסיות הנוירונים שזוהו ברזולוציה של תא בודד או תת-תאי. עם זאת, הדמיה ברזולוציה גבוהה דורשת בדרך כלל מערך יציב וקבוע ראש המגביל את תנועת החיה, והכנת משטח שטוח של זכוכית שקופה מאפשרת הדמיה של תאי עצב במישור אופקי אחד או יותר, אך מוגבלת בחקר התהליכים האנכיים הפועלים על פני עומקים שונים. כאן, אנו מתארים הליך לשילוב קיבוע לוחית ראש ומיקרופריזמה המעניקה הדמיה רב שכבתית ורב-מודאלית. הכנה כירורגית זו לא רק מעניקה גישה לכל העמודה של קליפת המוח הראייתית של העכבר, אלא מאפשרת הדמיה של שני פוטונים במיקום קבוע בראש והדמיה של פוטון אחד בפרדיגמה הנעה בחופשיות. באמצעות גישה זו, ניתן לדגום אוכלוסיות תאים מזוהות על פני שכבות קליפת המוח השונות, לרשום את תגובותיהן תחת מצבים קבועים ונעים בחופשיות, ולעקוב אחר השינויים ארוכי הטווח לאורך חודשים. לפיכך, שיטה זו מספקת בדיקה מקיפה של microcircuits, המאפשר השוואה ישירה של פעילויות עצביות המתעוררות על ידי גירויים מבוקרים היטב תחת פרדיגמה התנהגותית טבעית.

Introduction

הופעתו של הדמיה פלואורסצנטית של שני פוטונים in vivo ^1,2, המשלבת את הטכנולוגיות החדשות במערכות אופטיות ואינדיקטורים פלואורסצנטיים מהונדסים גנטית, התפתחה כטכניקה רבת עוצמה במדעי המוח לחקור את המבנה, התפקוד והפלסטיות המורכבים במוח החי ^3,4. בפרט, שיטת הדמיה זו מציעה יתרון שאין שני לו על פני אלקטרופיזיולוגיה מסורתית בכך שהיא לוכדת הן את המורפולוגיה והן את הפעילות הדינמית של נוירונים, ובכך מאפשרת מעקב ארוך טווח אחר נוירונים מזוהים 5,6,7,8.

Protocol

כל הניסויים נערכו על פי חוק בעלי החיים הבריטי (נהלים מדעיים) 1986 תחת רישיונות אישיים ופרויקטים שאושרו והונפקו על ידי משרד הפנים הבריטי לאחר ביקורת אתית מתאימה. קווים טרנסגניים למבוגרים CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE²¹ גודלו וצאצאיהם שימשו בניסוי. למען בטיחות הנסיינים ושמירה על תנאים סטריליים, כל ההליכים בוצעו בתנאים אספטיים ועם ציוד מגן אישי מלא.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. כדי למזער בצקת, יש לתת דקסמתזון (0.2 מ"ג/ק"ג) תת עורית, 12-24 שעות לפני הניתוח.
2. לעקר את כל כלי הניתוח באוטוקלאבה ולעקר את אזור הניתוח עם חומצה היפוכלורית מיוצבת עם מים מזוקקים ואתנול 70% לפני הניתוח. ודא שכל ציוד הניתוח מופ....

תוצאות

השיטה של ביצוע הדמיית סידן כרונית רב-שכבתית in vivo של אותה אוכלוסייה עצבית במשך תקופה של מספר שבועות, תוך שימוש בשיטות הדמיה של פוטון אחד ושני פוטונים, בתנאים הנעים בחופשיות וקבועים בראש. כאן הודגמה היכולת לזהות אוכלוסיות תאי עצב תואמות תחת הדמיה של פוטון אחד בזמן שהחיה חקרה זירה פתוחה ?.......

Discussion

כאן, הראינו את היכולת להתבונן ולהשוות ישירות תאי עצב בתנאים קבועים בראש ובתנועה חופשית באותן אוכלוסיות עצביות. בעוד הדגמנו את היישום בקליפת המוח הראייתית, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למספר רב של אזורים אחרים במוח, הן אזורים בקליפת המוח והן גרעינים עמוקים 24,25,26,27,28.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment