Langzeitbildgebung identifizierter neuronaler Populationen mit Mikroprismen bei frei beweglichen und kopffixierten Tieren

Zusammenfassung

In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.

Zusammenfassung

Mit dem Fortschritt der Multiphotonenmikroskopie und der molekularen Technologien entwickelt sich die Fluoreszenzbildgebung schnell zu einem leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Struktur, Funktion und Plastizität lebender Hirngewebe. Im Vergleich zur herkömmlichen Elektrophysiologie kann die Fluoreszenzmikroskopie sowohl die neuronale Aktivität als auch die Morphologie der Zellen erfassen und so Langzeitaufnahmen der identifizierten Neuronenpopulationen mit Einzelzell- oder subzellulärer Auflösung ermöglichen. Hochauflösende Bildgebung erfordert jedoch typischerweise einen stabilen, kopffesten Aufbau, der die Bewegung des Tieres einschränkt, und die Herstellung einer flachen Oberfläche aus transparentem Glas ermöglicht die Visualisierung von Neuronen auf einer oder mehreren horizontalen Ebenen, ist jedoch bei der Untersuchung der vertikalen Prozesse, die über verschiedene Tiefen verlaufen, begrenzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kombination einer Kopfplattenfixierung und eines Mikroprismas, das eine mehrschichtige und multimodale Bildgebung ermöglicht. Dieses chirurgische Präparat ermöglicht nicht nur den Zugang zur gesamten Säule des visuellen Kortex der Maus, sondern ermöglicht auch die Zwei-Photonen-Bildgebung in einer kopffesten Position und die Ein-Photonen-Bildgebung in einem frei beweglichen Paradigma. Mit diesem Ansatz kann man identifizierte Zellpopulationen über verschiedene kortikale Schichten hinweg beproben, ihre Reaktionen unter kopffesten und frei beweglichen Zuständen registrieren und die langfristigen Veränderungen über Monate hinweg verfolgen. Somit bietet diese Methode einen umfassenden Assay der Mikroschaltkreise, der einen direkten Vergleich neuronaler Aktivitäten ermöglicht, die durch gut kontrollierte Reize und unter einem natürlichen Verhaltensparadigma hervorgerufen werden.

Einleitung

Das Aufkommen der In-vivo-Zwei-Photonen-Fluoreszenzbildgebung ^1,2, die die neuen Technologien in optischen Systemen und genetisch veränderte Fluoreszenzindikatoren kombiniert, hat sich zu einer leistungsstarken Technik in den Neurowissenschaften entwickelt, um die komplizierte Struktur, Funktion und Plastizität im lebenden Gehirn zu untersuchen ^3,4. Insbesondere bietet diese Bildgebungsmodalität einen beispiellosen Vorteil gegenüber der herkömmlichen Elektrophysiologie, indem sie sowohl die Morphologie als auch die dynamischen Aktivitäten von Neuronen erfa....

Protokoll

Alle Experimente wurden gemäß dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 unter persönlichen und Projektlizenzen durchgeführt, die vom britischen Innenministerium nach entsprechender Ethikprüfung genehmigt und ausgestellt wurden. adulte transgene Linien CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE²¹ wurden gezüchtet und ihre Nachkommen im Experiment verwendet. Zur Sicherheit der Experimentatoren und zur Aufrechterhaltung steriler Bedingungen wurden alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen und mit vollständiger persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Um Ödeme zu minimiere....

Diskussion

Hier haben wir die Fähigkeit gezeigt, Neuronen unter kopffixierten und frei beweglichen Bedingungen in denselben neuronalen Populationen zu beobachten und direkt zu vergleichen. Während wir die Anwendung im visuellen Kortex demonstriert haben, kann dieses Protokoll an eine Vielzahl anderer Hirnareale angepasst werden, sowohl an kortikale Areale als auch an tiefe Kerne 24,25,26,27,28 sowie an andere Datenerfassungs- und Verhaltensaufbauten

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment