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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati Rappresentativi
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Se integrata con una piastra di testa e un design ottico compatibile con microscopi a singolo e due fotoni, la lente del microprisma presenta un vantaggio significativo nella misurazione delle risposte neurali in una colonna verticale in diverse condizioni, inclusi esperimenti ben controllati in stati di fissazione della testa o compiti comportamentali naturali in animali che si muovono liberamente.

Abstract

Con il progresso della microscopia multi-fotone e delle tecnologie molecolari, l'imaging a fluorescenza sta rapidamente crescendo fino a diventare un potente approccio per studiare la struttura, la funzione e la plasticità dei tessuti cerebrali viventi. Rispetto all'elettrofisiologia convenzionale, la microscopia a fluorescenza è in grado di catturare l'attività neurale e la morfologia delle cellule, consentendo registrazioni a lungo termine delle popolazioni di neuroni identificate a risoluzione singola o subcellulare. Tuttavia, l'imaging ad alta risoluzione richiede in genere una configurazione stabile e fissata sulla testa che limita il movimento dell'animale, e la preparazione di una superficie piana di vetro trasparente consente la visualizzazione dei neuroni su uno o più piani orizzontali, ma è limitata nello studio dei processi verticali che attraversano diverse profondità. Qui, descriviamo una procedura per combinare una fissazione della piastra di testa e un microprisma che fornisce immagini multistrato e multimodali. Questa preparazione chirurgica non solo dà accesso all'intera colonna della corteccia visiva del topo, ma consente l'imaging a due fotoni in una posizione fissa sulla testa e l'imaging a un fotone in un paradigma che si muove liberamente. Utilizzando questo approccio, è possibile campionare popolazioni cellulari identificate in diversi strati corticali, registrare le loro risposte in stati di testa fissa e in movimento libero e monitorare i cambiamenti a lungo termine nel corso dei mesi. Pertanto, questo metodo fornisce un saggio completo dei microcircuiti, consentendo il confronto diretto delle attività neurali evocate da stimoli ben controllati e secondo un paradigma comportamentale naturale.

Introduzione

L'avvento dell'imaging fluorescente a due fotoni in vivo 1,2, che combina le nuove tecnologie nei sistemi ottici e gli indicatori di fluorescenza geneticamente modificati, è emerso come una potente tecnica nelle neuroscienze per studiare l'intricata struttura, funzione e plasticità nel cervello vivente 3,4. In particolare, questa modalità di imaging offre un vantaggio senza precedenti rispetto all'elettrofisiologia tradizionale, catturando sia la morfologia che le attività dinamiche dei neuroni, facilitando così il monitoraggio a lungo

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo l'UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 in base a licenze personali e di progetto approvate e rilasciate dal Ministero degli Interni del Regno Unito a seguito di un'appropriata revisione etica. Linee transgeniche adulte CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 sono stati allevati e la loro progenie è stata utilizzata nell'esperimento. Per la sicurezza degli sperimentatori e il mantenimento delle condizioni di sterilità, tutte le procedure sono state eseguite in condizioni asettiche e con dispositivi di protezione individuale completi.

1. Preparazione pre-operatoria

Risultati Rappresentativi

È stato mostrato il metodo di condurre l'imaging cronico del calcio multistrato in vivo della stessa popolazione neuronale per un periodo di diverse settimane, utilizzando modalità di imaging a uno o due fotoni, in condizioni di movimento libero e testa fissata. In questo caso, è stata dimostrata la capacità di identificare popolazioni neuronali corrispondenti nell'ambito dell'imaging a un fotone mentre l'animale esplorava un'arena aperta al buio (Figura 7A). Le tracce di calcio.......

Discussione

Qui, abbiamo mostrato la capacità di osservare e confrontare direttamente i neuroni in condizioni di testa fissa e in movimento libero nelle stesse popolazioni neurali. Mentre abbiamo dimostrato l'applicazione nella corteccia visiva, questo protocollo può essere adattato a una moltitudine di altre aree cerebrali, sia aree corticali che nuclei profondi 24,25,26,27,28, così come altre acquisizioni di dati e configurazioni comportamentali

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Ringraziamo la Sig.ra Charu Reddy e il Professor Matteo Carandini (Cortex Lab) per i loro consigli sul protocollo chirurgico e sulla condivisione del ceppo di topo transgenico. Ringraziamo il Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) per la sua guida e assistenza durante lo sviluppo dell'intervento. Ringraziamo la Sig.ra Andreea Aldea (Sun Lab) per la sua assistenza con la configurazione chirurgica e l'elaborazione dei dati. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Moorfields Eye Charity.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250mlDechra20091607Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter burFST18004-18Drill bit
1ml syringeTerumoMDSS01SE1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needleTerumoNN-2316R23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in softwareRWD-RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)SurgisponSSP-101010gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcoholBraun9160612Alcohol pads
Aluminium foilAny retailer-Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand3525/25MLACSF
Automated microinjection pumpWPI8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500mlVidene/Ecolab3030440Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)Bruker-Two-photon imaging system 
Cardiff AldasorberVet-TechAN006Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XCNikonMRH4823020x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unitVet-TechAN001Compact anaesthesia system 
Contec Prochlor Aston PharmaAP2111L1Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25HikmaCovetrus:70789Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steelFine Science Tools10055-12Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear BarsStoelting51649Ear bar
Dummy microscopeInscopixDummy microscopeTo help with implantation
Ethanol (100%) VWR40-1712-25Used to make 70% ethanol 
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat IIIFischerScientific17182182Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-FHarvard Apparatus50-7222-FHomeothermic monitoring system/heating pad
Image processing softwareImageJ-Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)Inscopix-One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043InSightInsight Spectra X3Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalationZoetisWM 42058/4195Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone AdhesiveWorld Precision Intruments (WPI)KWIK-SILSilicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/EPROXXONNO 28 515Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System packageInscopix-One-photon Imaging system and software
ProView Implant KitInscopixProView Implant KitDummy microscope, stereotaxic arm and attachment 
ProView Prism ProbeInscopix1050-002203Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)ZoetisVM 42058/4123Carprofen 
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clampWPIPZMTIII-AAC Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN MedicalPrestige-DentalK058EAdhesive cement
Two-photon calcium image softwareSuite2P-Two-photon calcium imaging processing software
VapouriserVet-Tech-Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5gXailin-NightMLG/28/1551Ophthalmic ointment 

Riferimenti

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications t....

Ristampe e Autorizzazioni

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