Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Resumen

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Resumen

Con el avance de la microscopía multifotónica y las tecnologías moleculares, las imágenes de fluorescencia están creciendo rápidamente para convertirse en un enfoque poderoso para estudiar la estructura, la función y la plasticidad de los tejidos cerebrales vivos. En comparación con la electrofisiología convencional, la microscopía de fluorescencia puede capturar la actividad neuronal, así como la morfología de las células, lo que permite registros a largo plazo de las poblaciones de neuronas identificadas con una resolución unicelular o subcelular. Sin embargo, las imágenes de alta resolución generalmente requieren una configuración estable y fija en la cabeza que restringe el movimiento del animal, y la preparación de una superficie plana de vidrio transparente permite la visualización de neuronas en uno o más planos horizontales, pero está limitada en el estudio de los procesos verticales que se ejecutan a diferentes profundidades. Aquí, describimos un procedimiento para combinar una fijación de la placa de la cabeza y un microprisma que proporciona imágenes multicapa y multimodal. Esta preparación quirúrgica no solo da acceso a toda la columna de la corteza visual del ratón, sino que permite obtener imágenes de dos fotones en una posición fija de la cabeza y obtener imágenes de un fotón en un paradigma de movimiento libre. Con este enfoque, se pueden muestrear poblaciones celulares identificadas en diferentes capas corticales, registrar sus respuestas en estados fijos y de movimiento libre, y realizar un seguimiento de los cambios a largo plazo durante meses. Por lo tanto, este método proporciona un ensayo completo de los microcircuitos, lo que permite la comparación directa de las actividades neuronales evocadas por estímulos bien controlados y bajo un paradigma de comportamiento natural.

Introducción

El advenimiento de las imágenes fluorescentes de dos fotones in vivo ^1,2, que combinan las nuevas tecnologías en sistemas ópticos e indicadores de fluorescencia modificados genéticamente, ha surgido como una técnica poderosa en neurociencia para investigar la intrincada estructura, función y plasticidad en el cerebro vivo ^3,4. En particular, esta modalidad de imagen ofrece una ventaja sin precedentes sobre la electrofisiología tradicional al capturar tanto la morfología como las actividades dinámicas de las neuronas, lo que facilita el seguimiento

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 bajo licencias personales y de proyectos aprobadas y emitidas por el Ministerio del Interior del Reino Unido después de la revisión ética correspondiente. Líneas transgénicas adultas CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE²¹ fueron criados y sus descendientes utilizados en el experimento. Para la seguridad de los experimentadores y el mantenimiento de las condiciones estériles, todos los procedimientos se realizaron en condiciones asépticas y con equipos de protección personal completos.

1. Preparaci....

Discusión

Aquí, hemos demostrado la capacidad de observar y comparar directamente neuronas en condiciones de cabeza fija y movimiento libre en las mismas poblaciones neuronales. Si bien demostramos la aplicación en la corteza visual, este protocolo se puede adaptar a una multitud de otras áreas cerebrales, tanto áreas corticales como núcleos profundos 24,25,26,27,28, así como a otras configuraciones de adquisición de datos y comportamiento

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment